UNIVERSIDAD SAN IGNACIO DE LOYOLA FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA CARRERA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Y AGRONEGOCIOS
LABORATORIO 1: MICROFLORA DE LA CARNE MOLIDA: CONTEO ESTANDAR DE PLACA (SPC) Y CONTEO DE ESCHERICHIA COLI
Microbiología Agroalimentaria Profesor: Elías Peñafiel, Carlos Cesar Augusto Integrantes:
Gil Saldarriega, HectorAlonso Gonzales Alcarraz, Frank Antoni Gamarra Castro, Roberto José Carlos Jara Angeles, Bruno Alejandro Torres Avalos, Luis Enrique Romero Eyzaguirre, Victor
HORARIO Jueves de 5:00 p.m. a 7:00 p.m. FECHA DE LABORATORIO 28/08/2014 FECHA DE ENTREGA INFORME 04/08/2014
Lima - Perú
2014
INDICE Capítulo I: Introducción.……………………….……………………………………………….3 Capítulo II: Marco Teórico………..…………………………………………………………….4 Capítulo III: Objetivo…..…………..……………………………………………………………. 4 Capítulo IV: Materiales y Métodos …….. ………………………………..…………….…... ...5 4.1 Equipos y materiales………………… .……………………-…………………..5 4.2 Método……………………………………………………… .……………………5 4.3. Procedimiento …………………………………………..………………………7 Capítulo V: Resultados y Discusión……………………….…………………………………8 5.1 Resultados del grupo.. ………………………………………………………….8 5.2. Discusión…………………………………………………………… ..……......10 Capítulo VI Conclusiones…………………………………….......................................... …14 BIBLIOGRAFIA ………………………………………………………………………………… 15
2
CAPITULO I: INTRODUCCION Los recuentos de aerobios viables se basan comúnmente en el número de colonias que se desarrollan en placas de agar nutritivo que han sido previamente inoculadas con cantida des conocidas del alimento diluido e incubadas en condiciones ambientales predeterminadas. Cada tipo de recuento de gérmenes viables es potencialmente útil para fines específicos, pero el recuento de bacterias aerobias mesófilas es el más comúnmente utilizado para indicar la calidad sanitaria de los alimentos. La mayoría de alimentos industrializados (a excepción de los fermentados) deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando tengan un gran número de microorganismos, aun cuando no se haya determinado que éstos son patógenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolépticos del alimento. Pueden darse las siguientes razones: recuentos altos en alimentos estables a menudo indican materias primas contaminadas o tratamientos no satisfactorios ya sea desde el punto de vista sanitario o de las condiciones de almacenamiento, algunas bacterias mesófilas no consideradas como patógenas al presentarse en números muy altos pueden ser señaladas como causa d enfermedad, etc. Los alimentos contienen una determinada carga microbiana que no causa daño ni al alimento ni al humano que lo ingiere, es decir estos alimentos presentan microorganismos dentro de los límites establecidos por una norma. En el Perú la norma técnica sanitaria actual es la NTP Nº 071, en la cual se establece los criterios microbiológicos de la calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano. A nivel nacional la autoridad sanitaria responsable de vigilar el cumplimiento de la norma sanitaria es el ministerio de Salud a través de la Dirección General de Salud Ambiental (DIGESA) y por delegación, las Direcciones de Salud (DISAS); a nivel regional las Direcciones Regionales de Salud (DIRESA) y a nivel local las municipalidades. La norma establece para cada tipo de alimento los microorganismos que deben detectarse en los análisis y los rangos dentro de los que deben estar los resultados (límites), en la mayoría de los casos se señala como requisito la detección de aerobios mesófilos pero el límite varía según el tipo de alimento.
3
CAPITULO II: MARCO TEÓRICO Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC. Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo “coliforme” forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter , Klebsiella, Citrobacter ,
etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. Una elevada proporción de los coliformes que existen EN los sistemas de distribución no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es difícil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario. Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales biliares. CAPITULO III: OBJETIVO Adquirir destreza en el aislamiento y recuento de microorganismos aerobios mesófilos como colonias individuales a partir de muestras de la carne cruda mediante la técnica de recuento estándar en placa.
4
CAPITULO IV. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 Materiales
Agar soya tripticasa (TSA). Este es un agar rico en nutrientes que fomenta el crecimiento de diferentes microorganismos. Es un medio no selectivo y no diferencial y apropiado para uso en conteo estándar en placas (CEPs).
Agar Bilis rojo violeta suplementado con 4-metilumbeliferil-b-D-glucuronido (VRBA + MUG). Este medio es usado para plaquear selectivamente las bacterias coliformes. O,
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB), diferencia para E. coli y es selectivo para bacterias G(-). Si E. coli esta presente, las colonias tendrán un brillo verde metálico. El EMB contiene eosina y azul de metileno como indicadores. Cuando la lactosa fermenta, se producen ácidos y se produce un cambio de color. Con la excepción de E. coli, las colonias de color rosado son el resultado de fermentación de lactosa. Si las bacterias no fermentan lactosa (no son coliformes), no se produce acido y las colonias se presentan básicamente incoloras, transparentes o de color ambar – como pueden ser Salmonella y Shigella. El azul de metileno actúa como inhibidor de bacterias G(+).
Agua peptonada estéril
Placas Petri con TSA
Carne molida
Frascos estériles
Tubos de ensayo estériles
Licuadora con vaso estériL
Incubadora
Pipetas estériles
4.2 Método
Primero, lavarse las manos, desinfectar el área de trabajo
Preparación de la muestra 1. Usar un utensilio estéril para pesar 25 g de carne molida. 2. Agregar 225 ml de agua peptonada. Esta será la dilución inicial de 1/10 o 10 -1. Licuar por 2 min. 5
4. Preparar diluciones seriadas (Figura 1.1). Figura 1.1. Esquema de Dilución para EMB y SPC: para EMB diluciones en placa 10 -2 hasta 10-4, para SPC diluciones en placa 10 -3 hasta 10-6.
25 g
1 ml
1 ml
1 ml
Vol (ml)
225
9
9
9
9
Dilución
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
Dilución en placa con agar VRB
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
10-2
10-3
10-4
Dilución en placa con agar SPC
0.1 ml -4
0.1 ml
-5
10
10
0.1 ml
-6
10
Use técnicas de aislamiento de cultivos por dilución: por incorporación (SPC) y por dispersión con espátula (EMB).
Tecnica de Disperción con 1
espátula
6
4.3 Procedimiento
Lavarnos las manos y esterilizar el área de trabajo.
Agregar VRB hasta
Agregar el agar SPC
cubrir la placa y
hasta cubrir la placa.
dispersar con ayuda de la espátula de
Realizar ligero movimiento para
Drigalsky.
homogenizar.
Pesar 25 gr de
Pipetear 0,1 ml de
muestra (Carne
los tubos de ensayo
Molida).
a una placa para
Pipetear 0,1 ml de los tubos de ensayo a una placa para obtener diluciones de 10-4 10-5
obtener diluciones
10-6
de 10-2 10-3 10-4
Agregar 225 ml de agua
Rotular cada
peptonada.
placa por
Rotular cada placa. (En este caso no se trabajó por
duplicado.
duplicado.
Colocar sobre el
El agar VRB trabajará
vortex para
con tubos de ensayo que concentren
El agar SPC trabajará con tubos de ensayo
diluciones de 10-1 10-2
que concentren
homogenizar.
10
-3
diluciones de 10-3 10-4 10-5
Esperar unos
Pipetear 1 ml a
Incubar por
minutos hasta
los 5 tubos de
24 horas a
Realizar el
que los pedazos
ensayo estériles
una
conteo de las
de carne sedimenten.
y homogenizar en el vortex.
temperatura de 32 grados.
UFC. 7
CAPITULO V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. Resultados del grupo Para SPC y EMB 1. Calculo de las colonias SPC 10^-4:
342 0.0001
= 3420000 / = 3,42106 /
10^-5:
32 0.00001
= 3200000 / = 3,2106 /
10^-6:
1 0.000001
= 1000000 / = 1106 /
2. Cuente las colonias típicas de coliformes (de color rosado)
10^-2:
38 0.01
= 3.810 /
35 /0.01 = 3.510 /
Placa de dilucion 10 -2 a las 24 horas. 8
10^-3:
21 /0.001 = 2.110 / 23 /0.001 = 2.310 /
Placa de dilucion 10 -3 a las 24 horas. 10^-4:
108 /0.0001 = 1.08106 / 135 /0.0001 = 1.35106 /
Placa de dilucion 10 -4 a las 24 horas.
9
Cuadros de respuestas
Conteo Estándar en Placa (SPC) Dilución en placa
UFC/placa
10-4
3.42x106
10-5
1.2x106
10-6
1x106
SPC UFC/g = 3.42 x 106 (Asumiendo placas de 25 -250 UFC/PLACA) Conteo Presuntivo de Coliformes Dilución en placa
UFC/placa
UFC/placa Promedio
10-2
3.8x103
3.5x103
3.65x103
10-3
2.1x104
2.7x104
2.4x104
10-4
1.08x106
1.35x106
1.215x106
Presuntivo Coliformes UFC/g = 3.65 x 10 3 UFC/gr (Asumiendo placas de 25 -250 UFC/PLACA) 5.2 Discusiones a) Asuma placas de 25 – 250 UFC/placa. Cuál es el mínimo y máximo UFC/g que puede detectar con precisión con el esquema de dilución de SPC? Y el máximo y mínimo conteo de coliformes? La respuesta a la pregunta se muestra en el siguiente cuadro:
Agar TSA MINIMO MAXIMO
3,42x106 UFC/ml 3,42x106 UFC/ml
Agar VRB (Coliformes) 3.65x103 UFC/ml 1.215x106 UFC/ml
Nota: En las placas para SPC Agar Soya Tripticasa solo se mostraba una de ellas entre 25 – 250 UFC/placa, por lo que se consideró el mínimo y máximo con el mismo número.
10
b) Si las placas para SPC se hubiesen incubado a 37°C, ¿esperaría resultados diferentes? Sí, los resultados hubiesen sido diferentes al incrementarse el número de colonias presentes en cada placa. El medio utilizado para el SPC fue el agar soya tripticasa (TSA), el cual es un medio no selectivo y no diferencial; es decir que aquí se permite el crecimiento de diferentes tipos de microorganismos. En este caso se incubó por 48 horas a la temperatura de 32°; pero si se hubiese aumentado la temperatura a 37°, la cual es la temperatura más óptima para el desarrollo de coliformes hubiera incrementado la cantidad de microorganismos obtenidos en las placas. Es por eso que la temperatura es un factor que los manipuladores de alimentos alteran para poder controlar los microorganismos en los alimentos. c) ¿Por qué el conteo de coliformes de esta prueba se considera presuntivo? Que otros parámetros experimentales necesita para confirmar la presencia de coliformes? Porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (ColiformesTotales, Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una presunción, que habrá de confirmarse posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada. La denominada prueba presuntiva consiste en una metodología de tipo general para cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es específica. En el laboratorio se utilizó el medio de cultivo selectivo VRB para cuantificar los coliformes, el fundamento de este medio es que contienes sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de bacterias G+, también contiene lactosa como el carbohidrato y rojo neutro como indicador de pH. Los organismos que fermentan lactosa, como los coliformes, crecen formando colonias rojas, mientras que los no fermentadores forman colonias a transparentes. Además para confirmar la presencia de coliformes se pueden traspasar las colonias obtenidas al medio caldo bilis verde brillante; ya que este medio contiene bilis y verde brillante los cuales inhiben el crecimiento de bacterias G+ y G- con la excepción de los coliformes. d) Microorganismos máximos permitidos por la Legislación Peruana. Nuestra muestra de carne molida se encuentra en la sección X.6 de la Resolución Ministerial 591-2008: 11
Aquí podemos ver la cantidad máxima de microorganismos permitidos y la cantidad de microorganismos que solo un número determinado de muestras puede exceder, es decir la calidad aceptable que deben tener las muestras. En base a esta tabla, se puede decir que las muestras superan el número de microorganismos que deberían tener para tener una calidad aceptable: Asumiendo el conteo solo en placas de 25-250UFC/placa para lograr mayor precisión se observa:
Agar TSA MINIMO MAXIMO MAXIMO PERMITIDO POR LA RM. 591-2008
3,42x106 UFC/ml 3,42x106 UFC/ml 107
Agar VRB (Coliformes) 3.65 x103 UFC/ml 1.215 x106 UFC/ml 5 x 102
En el Agar TSA se obtuvo 1 resultado dentro de los límites microbiológicos entre 10 6 y 107 de un total de 1 prueba. Para rechazar al lote se debería realizar 4 pruebas más a otras muestras de la carne molida y realizar el conteo de mesófilos nuevamente. Si de estas 5 pruebas 3 resultan dentro de este límite se rechaza el lote Además se obtuvo un conteo de coliformes bastante elevado, lo cual puede implicar que el número de E.colis obtenidos es mayor al límite máximo (se debe recordar que es una prueba presuntiva y no confirmativa). Por todo esto se puede decir que la carne molida de la cual se extrajo la muestra no cumple con los requisitos establecidos por el Gobierno Peruano; y por lo tanto no es inocua y la gente puede contraer enfermedades graves si la consumen. e) Posibles factores de contaminación de la muestra de carne molida.
De acuerdo a los resultados la microflora bacteriana está presente en todos los casos, esto se podría deber a muchas causas de contaminación externa. En el caso de la carne molida, esta contiene microorganismos en la parte interna 12
debido a que, al realizar la molienda, los microorganismos que se encuentran en la parte externa de la carne se mezclan con la parte interior.
Las prácticas comunes en los mataderos eliminan los ganglios linfáticos de las partes comestibles. Sin embargo, la contaminación más importante es de origen externo y se produce durante la sangría, desuello y cuarteado, los microorganismos proceden principalmente de las partes externas del animal (piel, pezuña y pelo) y del tracto intestinal.
Los métodos de sacrificio recientemente aprobados, ya sean mecánico, químicos o eléctricos, dan lugar, por sí mismo, a escasa contaminación, pero la incisión y la sangría que se efectúan a continuación puede determinar una contaminación importante.
Los cuchillos, paños, aire, manos y ropa del personal pueden actuar como intermediarios de contaminación. Durante la manipulación posterior de la carne puede haber nuevas contaminaciones, a partir de las carretillas de transporte, cajas u otros recipientes, así de otras carnes contaminadas, de aire y del personal.
Debido a la gran variedad de fuentes de contaminación, los tipos de microorganismos que suelen encontrarse en la carne son muchos. Mohos de diferentes géneros, llegan a la superficie de la carne y se desarrollan sobre ella. Son especialmente
interesante
las
especies
de
los
géneros
Cladosporium,
Sporotrichum, Geotrichum, Thamnidium, Mucor, Penicillium, Alternaria y Monilia. A menudo se encuentran levaduras, especialmente no esporuladas. Entre las muchas bacterias que pueden hallarse, las más importantes son las de género Pseudomonas, Alcaligenes, Micrococcus, Sttreptococcus, Sarcina, Leuconostoc, Lactobacillus,
Proteus,
Flavobacterium,
Bacillus,
Clostridium,
Escherichia,
Salmonellas y Streptomyces. Muchas de estas bacterias crecen a temperatura de refrigeración. También es posible la contaminación de la carne y de sus productos por gérmenes patógenos del hombre, especialmente de origen entérico. f) Prevención de la contaminación de la carne. La prevención y control requieren un enfoque interdisciplinario en la producción animal, así como enfoques basados en riesgos a lo largo de toda la cadena de abastecimiento de alimentos. Éstos incluyen la aplicación de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF), Buenas Prácticas de Higiene (BPH) y Análisis de Peligros y de Puntos Críticos de Control (APPCC), desde la granja hasta llegar al consumidor. 13
Según la FAO, las estrategias que reducen el contagio entre animales vivos ofrecen métodos para reducir las poblaciones de agentes patógenos en animales destinados a la alimentación antes de que ingresen a la cadena alimentaria. Por ejemplo, se ha demostrado que cambiar drásticamente la alimentación del ganado de una ración alta en granos a una dieta basada en heno de alta calidad reduce la E. coli genérica y las poblaciones de E. coli (O157:H7). En la elaboración de la carne molida, para garantizar que las personas que tengan contacto directo o indirecto con los alimentos no se contaminen con la E. coli patógena, los manipuladores de alimentos deben ceñirse al “Código Internacional Recomendado
de Practicas - Principios Generales de Higiene de los Alimentos del Codex Alimentarius”. CAPITULO VI: CONCLUSIONES
En la práctica de laboratorio realizado se obtuvo un minimo de 3.42x10 6 UFC/gr de carne molida en el Agar TSA y un minimo de 3.65x103 UFC/gr y un máximo de 1.215x106 UFC/gr de carne molida en el Agar VRB para Coliformes.
En el Agar TSA se obtuvo 1 resultado dentro de los límites microbiológicos entre 106 y 107 de un total de 1 prueba. Para rechazar al lote se debería realizar 4 pruebas más a otras muestras de la carne molida y realizar el conteo de mesófilos nuevamente. Si de estas 5 pruebas 3 resultan dentro de este límite se rechazaría el lote.
Se obtuvo un conteo de coliformes bastante elevado, lo cual puede implicar que el número de E.colis obtenidos es mayor al límite máximo .Por lo tanto se puede concluir que la carne molida de la cual se extrajo la muestra no cumple con los requisitos establecidos por el Gobierno Peruano; y por lo tanto no es inocua y la gente puede contraer enfermedades graves si la consumen.
Los posibles fuentes de contaminación de la carne molida utilizada en el laboratorio puede ser: la maquina moledora, mala práctica de higiene en la cadena productiva, mal almacenamiento de la carne antes y después de la molienda.
La prevención y control requieren un enfoque interdisciplinario en la producción animal, así como enfoques basados en riesgos a lo largo de toda la cadena de abastecimiento de alimentos que incluyen Buenas Prácticas de Fabricación
14
(BPF), Buenas Prácticas de Higiene (BPH) y Análisis de Peligros y de Puntos Críticos de Control (APPCC), desde la granja hasta llegar al consumidor BIBLIOGRAFIA
Bioconservación de carne molida de res y cerdo, disponible en la web: http://www.ingquimica.uady.mx/revista/pdf/Revista47.pdf Sistema de control del carne molida, disponible en la web: http://www.slideshare.net/BorhaCM/sistemas-de-control-de-microorganismosen-carne NSO RTCA 67.04.50:08. Reglamento Tecnico Centroamericano. Alimentos. Criterios Microbiologicos para la inocuidad de alimentos. Prevencion de E.coli en Alimentos., disponible en http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/agns/pdf/Preventing_Ecoli_es.pdf RM Nº 591-2008 "Norma Sanitaria que Establece los Criterios de Calidad Sanitaria", disponible en la web: http://www.lablouispasteur.com/index.php/alimentos/resolucion-ministerial-n591-2008
15
