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Instituto de Ciências e Tecnologia de Alimentos
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO Patrícia da Silva Malheiros
Analise microbiológica de alimentos:
Investigar presença / ausência de micro-organismos micro- organismos
Quantificar os micro-organismos de interesse
Identificar diferentes espécies microbianas presentes
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO QUANTIFICAÇÃO DIRETA: Contagem
em placas Filtração Método do número mais provável QUANTIFICAÇÃO INDIRETA: Contagem direta ao microscópio Turbidimetria Atividade
metabólica Peso seco
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO QUANTIFICAÇÃO DIRETA CONTAGEM
EM PLACAS
- técnica mais utilizada na determinação do tamanho da população bacteriana; VANTAGEM: qualificação de células viáveis DESVANTAGEM: tempo
Após a incubação, a contagem das colônias é efetuada
Inóculo original
Diluições
Plaqueamento
9 mL de diluente em cada tubo
Contagem das colônias e cálculo dos resultados
Selecionar as placas com 25 a 250 colônias para contagem. O número de Unidades Formadores de Colônias (UFC) por grama ou mililitro da amostra será o número de colônias contadas multiplicado pelo inverso da diluição inoculada
O inverso da diluição 10 -1 é 101, o inverso da 10 -2 é 102 e assim por diante... Duas placas por diluição (duplicata) média aritmética da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata.
Resultado final Usar notação exponencial. Usar uma casa decimal depois da vírgula.
Contagem das colônias e cálculo dos resultados Ex: Plaqueamento em profundidade (1 mL) http://www.youtube.com/watch?v=bCI-O9vCmHM
AUTOMAÇÃO LABORATORIAL Utilizado nas etapas da analise:
a . Pesagem- Por ex, através de um aparelho chamado DILUTER ajustado que ao colocar a amostra, pesa a alíquota desejada, e já dilui acrescentando o diluente necessária para a diluição!
AUTOMAÇÃO LABORATORIAL b . Homogeneização- Uso do stomacher homogeneizador de pistão → não mais os liquidificadores que “cortam” as
células microbianas injuriando-as na análise!!!
AUTOMAÇÃO LABORATORIAL c. Semeadura – Utilização de um aparelho chamado “spiral plater ” → amostra é semeada na placa, através de uma cânula, que verte o inóculo, e a placa fica numa superfície que gira. http://www.youtube.com/watch?v=pRChN3QHuqo&hd=1
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO QUANTIFICAÇÃO DIRETA FILTRAÇÃO
Fonte: Tortora
GJ, Funke BR, Case CL. Microbiology: An Introduction . 960 p. 9th ed. Benjamin Cummings: California. 2006.
Membrana filtrante colocada sobre o meio de cultura e placa incubada. Células bacterianas na superfície da membrana (poros)
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO QUANTIFICAÇÃO DIRETA
MÉTODO
DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) - utilizado para microorganismos que não crescem bem em meio sólido.
Diluição
10 mL de inóculo
5 tubos positivos Diluição
3 tubos positivos
1 mL de inóculo
Diluição
0,1 mL de inóculo
1 tubos positivos
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO QUANTIFICAÇÃO DIRETA CONTAGEM
DIRETA AO MICROSCÓPIO
- um volume conhecido de suspensão bacteriana é colocado em uma área definida da lâmina de microscópio. - a amostra pode ser corada ou analisada a fresco. DESVANTAGENS: - não separa células mortas e vivas - pode haver erros de contagem - difícil contagem para bactérias móveis
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO QUANTIFICAÇÃO DIRETA
Sistemas prontos para uso: Placas de Petrifilm-3M, Placas de Simplate e diversos ágares adicionados de substratos cromogênicos ou fluorogênicos.
Análise de
Petrifilme 2
1
4
5
Escherichia coli 3
6
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO QUANTIFICAÇÃO INDIRETA ATIVIDADE METABÓLICA
- quantidade de um certo produto (como ácido ou CO2) é diretamente proporcional ao número de células bacterianas.
PESO SECO
- principalmente para fungos filamentosos
MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO QUANTIFICAÇÃO INDIRETA
TURBIDIMETRIA
- monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez; - espectrofotômetro (660 nm).
Origem de luz
Espectrofotômetro
Percentagem de luz transtmitida
Branco
Detector de luz
Percentagem de luz transtmitida
Suspensão bacteriana Fonte: Tortora
GJ, Funke BR, Case CL. Microbiology: An Introduction . 960 p. 9th ed. Benjamin Cummings: California. 2006.
- A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº. de bactérias.
TÉCNICA ASSÉPTICA - Cuidado com contaminações!
TÉCNICA DE ESGOTAMENTO - Obtenção de colônias puras.
