Manual Pract Bioquimica

Manual de Prácticas de Bioquímica

Dr. Claudio Arzola M.C. Celia Holguín Licón Responsables de la elaboración Del manual de Bioquímica

Mauricio Ramírez Ruano, D.I. Coordinador de la elaboración de Manuales de Prácticas

MC. Javier Martínez Nevarez Presidente del H. Consejo Técnico

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Directorio

C.P. Raúl Chávez Espinoza.

Rector de la Universidad Autónoma de Chihuahua

Ing. Heriberto Altes Médina

Secretario General de la Universidad Autónoma de Chihuahua

Dr. Alfredo de la Torre Hernández.

Director Secretario Académico de la Universidad Autónoma de Chihuahua

M.C. Javier Martínez Nevarez Director de la Facultad de Zootecnia

M.C. Josefina Domínguez Holguín

Secretaria Académica de la Facultad Facultad de Zootecnia

Ph.D. Claudio Arzola, M.C. Celia Holguín Licón Catedraticos de la Materia de Bio uímica

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Tabla de contenido INTRODUCCIÓN ................................... INTRODUCCIÓN ........................................................................ ................................................. ............ 1 ENCUADRE DEL SISTEMA SISTEMA DE PRÁCTICAS .......................................... ............................................. ...2 2 Introducción ............................... ................................................................... ...................................................... .................. 2 Competencias a las que contribuye, y su ubicación dentro del mapa curricular vigente.................................................................................4 Niveles de Desempeño ...................................... ...................................................................... ................................ 4 Programa del sistema de prácticas ................................... ...................................................... ................... 6 Tema .................................... ......................................................................... ................................................................ ........................... 6 Práctica o prácticas programadas ................................... ........................................................ ..................... 6 Contenido de cada Práctica en particular particular ........................................ ............................................ ....9 9 1.1.Difusión ................................. ...................................................................... ..................................................... ................ 9 1.2.Ósmosis y presión osmótica ........................................ ...................................................... .............. 13 1.3.Disociación electrolítica ................................... ........................................................... ........................ 15 1.4 Determinación de la acidez general de las disoluciones disoluciones.......... .......... 17 1.5 Determinación del pH ................................. ............................................................... .............................. 18 1.6 Preparación de las disoluciones amortiguadoras amortiguadoras..................... ..................... 21 2. Carbohidratos ................................... .......................................................................... ......................................... 24 2.1. Reacc Reacciones iones de recon reconocim ocimiento iento de los hidratos de carbono .... ....26 26 2.2. Prueba con naftorresorcina......................................................26 2.3. Monosacáridos ................................. ........................................................................ ......................................... 27 Aldohexosas ................................... .......................................................................... ................................................. .......... 28 2.4. Reacciones de reconocimiento le los hidratos de carbono reductores.......................................................................................28 Prueba con el hidróxido cúprico (II), reacción de Trommer........28 2.5. Reacción con el licor licor de Fehling Fehling .......................................... .............................................. .... 29 2.6. Reacción con las sales de bismuto... bismuto.......................................... ....................................... 30 2.7. Reacción con fenilhidrazina ..................................... ..................................................... ................ 31 2.8. Reac Reacción ción de recon reconocim ocimiento iento de la sa saca caro rosa sa ....... .............. .............. ............ .....32 32 2.9.. Reac 2.9 Reaccio ciones nes de fer fermen mentac tación ión de los hid hidrat ratos os de car carbon bono o ... ..... ..33 33 2.10. Reacciones coloreadas del almidón ................................... ....................................... .... 34 2.11 Hidrólisis acida escalonada del almid almidón ón ................................ 35 Página iii

2.12. Hidrólisis enzimática del almidón .......................................... 37 2.13 Reacción del glicógeno con el iodo........................................ 38 Reconocimiento del glicógeno en los tejidos animales .................. 38 3. Los lípidos y su metabolismo.................................................... 41 Los lípidos y sus metabolitos .............................................................. 42 Glicéridos (grasas) .......................................................................... 42 Reacciones de reconocimiento de las grasas.................................... 43 3.1. Reacción de la grasa y el aceite con el Sudán III.....................43 3.2. Determinación de la glicerina en las grasas.............................44 3.4. Solubilidad de las grasas ......................................................... 44 3.5. Determinación de la temperatura de fusión.............................45 3.6. Determinación del número acídico .......................................... 46 3.7. Determinación del índice de iodo ............................................ 47 3.8. Determinación del número (índice) de saponificación .............. 48 3.9. Determinación cuantitativa de la grasa en el hígado ...........49 4. Enzimas.........................................................................................52 4.1 La labilidad térmica de las enzimas ......................................... 55 4.2 Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas................. 56 4.3 Especificidad de las enzimas.................................................... 57 4.4 Influencia de los activadores e inhibidores ............................. 58 4.5 Determinación de la actividad de la dehidrogenasa de ácido succínico ........................................................................................ 59 BIBLIOGRAFIA....................................................................................61 ANEXOS..............................................................................................62 NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD E HIGIENE........................... 62

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INTRODUCCIÓN Este manual esta diseñado para estudiantes de zootecnia y veterinaria, pudiendo también ser usado por otros técnicos. Esta destinado a servir de complemento a la materia de bioquímica de la carrera de Ingeniero Zootecnista en Sistemas de Producción de la Facultad de Zootecnia de la Universidad de Chihuahua, pero podrá, mediante adaptaciones y modificaciones leves, ser usado en cualquier carrera afín.

Dr. Claudio Arzola Alvarez, M.C. Celia Holguín Licón Facultad de Zootecnia Universidad Autónoma de Chihuahua Pagina 1

ENCUADRE DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS Introducción Como estudiante de zootecnia, seguramente debes de tener en cuenta que la producción pecuaria en México tiene que ser competitiva y sustentable. Junto con otras cosas, es necesario que los zootecnistas tengan una mayor especialización en relación a otras carreras que usan la bioquímica. Lo anterior seguramente propiciará una educación de profesionistas que puedan resolver problemas, por las competencias que ésta promueva en los estudiantes. También es necesario tener en cuenta que las unidades de producción cuentan con laboratorios cada vez mas equipados. Es sabido que el incremento de la producción pecuaria solo puede ser basado en prácticas de producción intensiva, con miras a lograr una mayor productividad por cabeza con aplicación económica de insumos. Generalmente esto solo puede ser logrado mediante el incremento del número de cabezas, mejor genética o selección, uso de mayor mecanización y sobre todo, la introducción de tecnología moderna. Por lo tanto, este manual se dirige a estudiantes de zootecnia y veterinaria, los cuales tienen en su curricula la materia de bioquímica. Existen numerosos manuales de laboratorio para esta materia, pero por lo general están dirigidos a profesionales de la química. Por lo general, se enfatiza en la enseñanza y práctica de mediciones cuantitativas, aislamiento y separación de proteínas, ensayo de reacciones enzimáticas, manipulación de ADN recombinante, y el uso de PCR en el campo forense. La experiencia de muchos años en la docencia de la bioquímica en la Facultad de Zootecnia de la Universidad Autónoma de Chihuahua me ha demostrado que dicho enfoque no es el óptimo para un profesional de la zootecnia. Dado que en lo general el conocimiento de la bioquímica prepara al estudiante para tener competencias en el área de la alimentación animal, es necesario que adquieras una proeficiencia en el uso de los conceptos bioquímicos que soportan los trabajos teórico-prácticos de esta disciplina.


Manual del laboratorio de Bioquimica Encuadre….

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Sin embargo, existe una tendencia a enmarcar dichos conocimientos solamente en aspectos solamente en aspectos tales como el análisis de alimentos, determinación de tóxicos y conocimientos afines, dejando vacíos en campos emergentes de la bioquímica como lo es la biotecnología. Es por eso que el presente manual se ha diseñado con el propósito de fomentar no solo el conocimiento inherente al quehacer de la bioquímica, sino que también puede usarse en labores de investigación en asignaturas diferentes a la bioquímica, y te da herramientas docentes, amen de prepararte para eventuales empleos en laboratorios comerciales o de certificación o trazabilidad de productos pecuarios. Otra de las variantes es que contiene materiales relativos a físico-química y química coloidal, lo cual esta ausente en este tipo de publicaciones. El plan general del manual contempla la referencia a los fundamentos teóricos de la química y metabolismo de las sustancias en estudio. Dado que el estudiante deberá presentar un protocolo y un informe para cada práctica, se describe el análisis en una manera lo más completa posible, con el ánimo de que el estudiante tenga un margen amplio de independencia, y facilitar el desarrollo de competencias en el mismo. Se da un enfoque acerca de la finalidad del análisis, con lo que se pretende reforzar la enseñanza de la materia.

Dr. Claudio Arzola Alvarez, M.C. Celia Holguín Licón Facultad de Zootecnia Universidad Autónoma de Chihuahua

Competencias a las que contribuye, y su ubicación dentro del mapa curricular vigente. Niveles de Desempeño El conjunto de prácticas del presente manual te permitirá llegar a un desempeño de nivel 4 de acuerdo la clasificación de CONOCER, a saber “ Nivel 4.- Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y recursos para conciliar intereses. Se debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos de trabajo”. Las razones por las que asumimos que obtendrás un nivel de desempeño tan alto son: 1. La realización de las prácticas en forma y tiempo presupone el dominio de diferentes habilidades y conocimientos. 2. La elaboración de un protocolo y un informe por práctica requiere de disciplina y laboriosidad, así como la utilización de herramientas computacionales. 3. Las prácticas deberán ser realizadas en equipo, lo que requiere de la participación armónica de los elementos. La capacidad de liderazgo deberá ser usada en forma óptima para realizar los diversos pasos de la práctica.


Programa del sistema de prácticas Tema

Práctica o prácticas programadas

Ámbitos de desarrollo

Duración en horas para cada práctica, y semana del semestre en que se realizará

1.1. Difusión

6 horas

1.2. Ósmosis y presión

1-3 semana

osmótica 1.3. Resistividad osmótica de eritrocitos 1. Introducción y agua

1.4. Disociación electrolítica 1.5. Determinación de la acidez

Laboratorio

general 1.5. Determinación del pH 1.6. Preparación de soluciones amortiguadoras 2. Carbohidratos

2.1. Reconocimiento de

6 horas

carbohidratos

4-6 semana

2.2. Carbohidratos reductores 2.3. Reconocimiento de la sacarosa 2.4. Fermentación 2.5. Hidrólisis del almidón

Laboratorio

2.6. reconocimiento de glucógeno en tejidos

Dr. Claudio Arzola Alvarez, M.C. Celia Holguín Licón Facultad de Zootecnia Universidad Autónoma de Chihuahua Página 6

Manual del laboratorio de Bioquimica 3. Lípidos

Prácticas

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3.1. Reconocimiento de grasas

6 horas

3.2. Determinación de glicerina

7-9 semana

3.3. Constantes de las grasas 3.4. Cuantificación de las grasas 3.5. Reacciones del colesterol 4. Enzimas

4.1 La labilidad térmica de las

6 horas

enzimas

10-11 semana

4.2 Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas 4.3 Especificidad de las enzimas 4.4 Influencia de los activadores e inhibidores Determinación de la actividad de las enzimas Oxidorreductasas 4.5 Determinación de la actividad de la dehidrogenasa de ácido succínico


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Serie de Prácticas 1 Quím ica Física

C. Arzola, C. Holguín Facultad de Zootecnia, UACh 8

Febrero 2006

Contenido de cada Práctica en particular 1.1. Difusión Facultad de Zootecnia, Universidad Autónoma de Chihuahua Responsable: Dr. Claudio Arzola Álvarez Número de alumnos por práctica: Tres Propósito de la práctica: Al terminar esta práctica, serás capaz de entender el concepto de difusión química, y relacionarlo con los diversos aspectos de la práctica profesional de la zootecnia. Este concepto es fundamental para entender los principios del movimiento de las moléculas en disolución, lo que te permitirá tener una visión integradora y real de las características funcionales de las mezclas. Al mismo tiempo, tendrás la habilidad de elaborar un protocolo para emprender el estudio sistemático de un fenómeno complejo, lo que te capacitará para planear adecuadamente dicho tipo de acciones, además de ser un instrumento de comunicación adecuada con colaboradores y colegas, puesto que la práctica se llevará a cabo en grupo. Sin embargo, el protocolo deberá ser entregado en forma individual para su evaluación. Al terminar, deberás entregar un informe del desarrollo y resultados de la práctica, el cual deberá ser individual. En caso de presentarse duplicidad del informe con otros del grupo o de otros grupos, obtendrás menor calificación. Puesto que el desarrollo de esta práctica se considera una actividad integradora, deberás de observar una conducta adecuada durante la misma, con actitudes de respeto a tus compañeros y maestros. La pulcritud y el orden será un factor que te permita desarrollar la habilidad requerida para el desarrollo de este tipo de actividades, con miras a que tu posterior desempeño profesional sea de alto nivel.


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Química física Propiedades cinético-moleculares de las disoluciones diluidas

Difusión 1 Las disoluciones diluidas poseen capacidad de nivelar la concentración en todo su volumen. Este proceso se realiza a través del movimiento térmico de las moléculas de sustancia disuelta y de disolvente, que conduce a la penetración mutua de las moléculas. Tal fenómeno obtuvo el nombre de difusión. Ella puede observarse si sumergimos cristales de sustancias coloreadas en un disolvente puro. Instrumentos: Cilindros de vidrio incoloro de 250 ml. Pinzas. Reactivos: Cristales grandes de permanganato potásico, bicromato potásico, cristal violeta o de otras sustancias coloreadas. Vidrio soluble. Marcha dé los trabajos. Un cristal de sustancia coloreada se sumerge y se mantiene durante varios segundos en vidrio soluble, luego se traslada a un cilindro con agua. A medida que el vidrio soluble se disuelve, las partículas de la sustancia se difunden paulatinamente en el cilindro por todo el volumen del disolvente, coloreando uniformemente la disolución del color correspondiente. La velocidad de difusión en este proceso es inversamente proporcional a las dimensiones de la molécula de la sustancia disuelta. Influencia de la temperatura sobre la velocidad de difusión La causa de la difusión es el movimiento térmico de las moléculas. Con el crecimiento de la temperatura de la disolución, la velocidad de difusión, por lo común, aumenta. Instrumentos. Hornillo eléctrico. Vasos químicos de 250 ó 500 ml. Soporte con sujetadores. Tubos do vidrio con diámetro de 3 a 5 mm y longitud de 30 a 40 mm. Soportes blancos para los vasos. Reactivos. Cristales de permanganato potásico u otra sustancia coloreada. Marcha de los trabajos. En dos vasos se vierten de 250 a 300 ml de agua en cada uno. Un vaso se coloca sobre hornillo eléctrico y se calienta hasta la ebullición. Luego ambos vasos, colocados sobre soportes blancos, se introducen los tubos de Adaptado de PRACTICAS DE BIOQUÍMICA DEL GANADO Y AVES DE CORRAL, 1984. A.V. CHECHETKIN et. al. Editorial MIR, Moscú. 1


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vidrio de tal modo que éstos se sitúen en centro del vaso sin llegar al fondo en unos 10 ó 12 mm. Los tubos se sujetan en el soporte y a través de ellos se dejan caer simultáneamente en cada vaso (con agua caliente y fría) los cristales de KMnO 4. En el vaso con agua caliente KMnO 4 se disuelve, formando muy rápidamente una disolución uniformemente coloreada. En el vaso con agua fría la difusión transcurre

muy

lentamente. El experimento sirve de prueba del movimiento térmico de las moléculas en que se basa la difusión e ilustra claramente que la velocidad de movimiento de las moléculas crece considerablemente con el aumento de la temperatura de disolución, lo que hace la difusión más pronunciada.

Sistema de evaluación

Al final de cada práctica, se revisará tu desempeño mediante la revisión de los siguientes puntos: Evaluación

Evaluación

alumno

instructor

Actividad

Final

¿Trajiste el protocolo de tu práctica en forma completa? ¿Utilizaste material de protección, lentes, guantes de asbesto, bata? ¿Preparaste los reactivos en forma anticipada? ¿Limpiaste el equipo y material una vez finalizada la práctica?

¿Dispusiste de los desechos de cómo indica el manual? ¿Entregaste el reporte de la práctica pasada?


Observaciones


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Reporte escrito. En cada práctica se deberá elaborar un reporte escrito, el cual deberá entregarse a la fecha siguiente de la práctica. El informe deberá ser elaborado en forma individual y presentado en forma impreso y digital. Método de asignación de calificaciones. Tu calificación será resultado de los siguientes factores: 1. Protocolo

30%

2. Reporte

30%

3. Desempeño en el laboratorio

40%

Total

100%

Para aprobar la asignatura, el alumno deberá presentar cuando menos el 80% de las prácticas realizadas. Sin embargo, para el cálculo de la calificación final se tomará en cuenta el total de las prácticas.



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1.2. Ósmosis y presión osmótica La difusión en las disoluciones puede ser directa o indirecta. En el caso de la difusión indirecta las partículas de soluto y del disolvente encuentran un tabique orgánico permeable (por ejemplo, de colodión) y lo atraviesan libremente. Sin embargo, si entre el disolvente puro y la disolución está puesto el así llamado tabique semipermeable, entonces a través de este último pueden penetrar sólo las moléculas del disolvente. La difusión unilateral del disolvente a través del tabique semipermeable se denomina osmosis. En su movimiento, las moléculas del disolvente al encontrar un tabique semipermeable, lo atraviesan libremente, mientras que las moléculas del soluto encontrándose en estado de movimiento térmico, dan contra el tabique semipermeable, chocan contra él, creando así cierta presión. Tal presión se denomina osmótica. La presión osmótica se combina como la suma de los choques que le tocan a una superficie determinada del tabique semipermeable en la unidad de tiempo. La magnitud de la presión osmótica se expresa en pascales (Pa) *). La presión osmótica juega un papel importante en los procesos fisiológicos de los organismos vegetales y animales. Sólo en las condiciones de isotonía en la sangre, los líquidos intertisulares y las células pueden verificarse normalmente los procesos bioquímicos y fisiológicos. La elevación de la presión osmótica en los tejidos conduce a los edemas, la disminución de la presión osmótica en la sangre trae como resultado la hemólisis de los eritrocitos. Muchas enfermedades de los órganos internos (los riñones, el corazón, los pulmones) están acompañadas por el aumento de la presión osmótica en la sangre. Al crecer la presión osmótica en las aguas del suelo, se empeora considerablemente el suministro de agua a las plantas y éstas se secan rápidamente y perecen.

Determinación de la resistividad osmótica de eritrocitos (ROE) Por resistividad osmótica de los eritrocitos so entiende la estabilidad de los eritrocitos contra la hemólisis bajo la acción de disoluciones hipotónicas de cloruro sódico. Es conocido que en la formación de la envoltura de los eritrocitos participan, junto con otras sustancias, la lecitina y el colesterol. En la envoltura de los eritrocitos jóvenes prevalece la lecitina, mientras que en la envoltura de los eritrocitos viejos, el



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colesterol. Por lo tanto los eritrocitos jóvenes son más propensos a la hemólisis que los viejos. Si los procesos de formación de la sangre transcurren en el organismo normalmente y los eritrocitos no se destruyen prematuramente, entonces en la determinación de la ROE de la sangre de tal organismo el inicio y el final de la hemólisis son muy extendidos. Cuando la formación de la sangre está perturbada y los eritrocitos jóvenes no se suministran a la sangre, entonces la hemólisis de tal sangre empieza con concentraciones de las disoluciones de cloruro sódico relativamente bajas. Si los eritrocitos en el organismo por alguna razón se destruyen rápidamente, es decir, la sangre contiene solamente eritrocitos jóvenes, la hemólisis de tal sangre empieza y termina a concentraciones relativamente altas de cloruro sódico en la disolución

(de

0,7 a 0,6%). Instrumentos. Centrífuga. Probetas de centrífuga. Pipeta graduada de 1 ml.

Pipeta de 5 ml. Reactivos. Disolución de cloruro sódico al 1%. Sangro tratada con citrato.

Marcha de los trabajos. Se preparan previamente disoluciones de cloruro sódico de distintas concentraciones. En probetas de centrífuga, numeradas de antemano se mezcla una disolución de cloruro sódico al 1% con agua según el esquema siguiente:

Luego en cada probeta se agrega 0.2 ml de sangre. Las probetas se agitan y se dejan durante 10 min en el soporte, luego se centrifugan durante un tiempo de 5 a 10 min a 15 mil r.p.m. Al terminar la centrifugación, se detectan las probetas en las cuales la hemólisis acaba de iniciarse, y aquellas donde ésta se realizó hasta el final. De indicador del inicio de la hemólisis sirve la coloración roja del líquido sobre el precipitado en presencia de un sedimento de eritrocitos no hemolizados. La hemólisis completa se



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detecta en las probetas donde el líquido está coloreado de un color rojo en ausencia del sedimento de eritrocitos.

1.3. Disociación electrolítica La disociación electrolítica es la descomposición espontánea del electrolito en la disolución, en partículas con cargas eléctricas (iones). La disociación electrolítica se expresa de una manera más pronunciada en aquella disolución en que el disolvente posee la mayor constante dieléctrica, es decir, el disolvente puede disminuir con la mayor fuerza la interacción entre las partículas de cargas opuestas (iones). El agua es tal disolvente. En consecuencia, en el agua la disociación electrolítica se verifica en el mayor grado. Por grado de disociación electrolítica se entiende la proporción entre las moléculas disociadas y no disociadas. El grado de disociación depende de la naturaleza del disolvente y del soluto, de la concentración de la disolución, temperatura, presencia en la disolución de otros electrólitos con ion análogo. Los iones que se forman en el proceso de disociación electrolítica aumentan la concentración general de las partículas del soluto y con esto elevan el efecto osmótico de las disoluciones. Además, los iones comunican a las disoluciones una actividad química más alta y las dotan de una actividad biológica, es decir, las disoluciones de los



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electrólitos al actuar sobre las células, órganos y organismos enteros, pueden elevar o disminuir su actividad fisiológica. La acción aislada de ciertos iones sobre los organismos unicelulares tiene comúnmente como resultado la muerte rápida de los últimos debido a su hiperexcitación o depresión excesiva. Así, los iones formados durante la disociación de las sales potásicas y sódicas causan una fuerte excitación de las células y su muerte posterior a consecuencia de la hiperexcitación; los iones surgidos en la disociación de las sales de calcio y magnesio opresan las funciones de las células y en el caso de acción prolongada, causan su muerte. La mezcla de iones monovalentes y bivalentes tomados en una proporción estrictamente determinada no provoca desviaciones en el estado fisiológico de la célula. En tal mezcla tiene lugar la supresión mutua de la acción tóxica de los iones debido al antagonismo iónico. Disoluciones isotónicas que contienen sales de metales mono y bivalentes tomadas en una proporción determinada y que no poseen acción tóxica sobre el organismo obtuvieron el nombre de disoluciones equilibradas o fisiológicas. Como ejemplo de tales disoluciones puede servir la disolución de Ringer, de Ringer—Lokk o de Ringer— Tirrode (tabla 2). Las disoluciones fisiológicas se utilizan en los experimentos con los cultivos de órganos y tejidos para el estudio de los procesos bioquímicos y fisiológicos en estos cultivos, como también para la preparación de los medios nutritivos en la práctica bacteriológica y para las inyecciones intravenosas.



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1.4 Determinación de la acidez general de las disoluciones La acidez general de una disolución se expresa por el número de equivalentes gramo de álcali consumidos para la valoración de un litro de disolución a investigar. Ella indica la cantidad sumaria de sustancias que reaccionan como ácidos presentes en la disolución, y no depende del grado de su disociación. Las disoluciones de cualesquiera ácidos, equivalentes en concentración, tienen la misma acidez general. Instrumentos. Pipetas de 5 y 10 ml. Matraces de 50 ó 100 ml. Bureta Reactivos. Acido clorhídrico, 0.1 N. Acido acético, 0.1 N. Hidróxido sódico, 0.1 N.

Fenolftaleina.

Marcha de los trabajos. Se miden exactamente 5 ó 10 ml de ácido clorhídrico, se vierten en un matraz, se añaden 2 ó 3 gotas de fenolftaleína y la disolución se valora de una bureta graduada, con una disolución de álcali hasta la aparición de una coloración rosa. La valoración se repite y, para el cálculo, se toma el valor promedio



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aritmético. Las diferencias entre los resultados de la valoración no deben sobrepasar 0.1 ml. De la misma manera se determina la acidez general de la disolución del ácido acético. El cálculo de la acidez general se realiza según la fórmula x = Nalc*Valc/Va partiendo de la ecuación Nalc*Valc = Na*Va, donde Nalc es el número de equivalentes gramo de álcali, Valc es el volumen del álcali, Na es la cantidad de ácido en equivalentes gramo, Va es el volumen del ácido. En el curso de determinación de la acidez general de dos disoluciones con concentraciones equivalentes, una de ácido fuerte y otra de ácido débil, se cercioran de que la acidez general no depende de la naturaleza del ácido sino de su concentración en la disolución. La acidez general se determina corrientemente junto con la determinación de la acidez activa de una disolución.

1.5

Determinación del pH Por acidez activa se entiende la acidez condicionada por la concentración de

iones hidrógeno libre en la disolución. La acidez activa depende del grado de disociación de los ácidos presentes en la disolución u otras sustancias que reaccionan como ácidos y se caracteriza por la magnitud del pH. Para los procesos fisiológicos tiene importancia, en primer término, la acidez activa del medio en que se verifican unos u otros procesos bioquímicos, es decir, de la sangre, del líquido tisular, contenido del protoplasma celular y, para los organismos protozoarios, el medio ambiente que los rodea. La acidez activa se determina por dos métodos (que pueden tener variaciones), el colorimétrico y potenciométrico.

Determinación potenciométrica del pH de las disoluciones El método potenciométrico de determinación del pH se basa en la medición de las fuerzas electromotrices de las pilas voltaicas, preparadas a partir de las disoluciones



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a investigar y de electrodos especiales. El método se caracteriza por una gran precisión en la determinación del pH de cualesquiera líquidos. Se denomina pila voltaica el aparato en que la energía química se convierte en eléctrica. Una condición necesaria para los electrodos de la pila voltaica es la posibilidad de verificarse en su superficie el proceso de oxido-reducción. Se denomina fuerza electromotriz (f.e.m.) la máxima diferencia de potenciales entre los electrodos de una pila voltaica en las condiciones reversibles de su trabajo. Para la determinación de los potenciales de electrodo o la concentración de iones en la disolución se emplean los electrodos estándar con una magnitud conocida del potencial de electrodo. En función de tales electrodos de referencia se usan los electrodos de hidrógeno, de calomelano y de quinhidrona. Electrodo de hidrógeno. El electrodo de hidrógeno consta de una placa de platino

saturada de hidrógeno molecular y sumergida en una disolución que contiene iones de hidrogeno: (Pt) H2/h+. En este sistema el platino desempeña el papel de conductor de electrones y de portador del hidrógeno. Una parte de las moléculas de hidrógeno que se encuentran en la placa de platino, se disocia en la disolución suministrándola cationes hidrógeno. Si la concentración de iones hidrógeno en la disolución es igual a 1 ión-g/1 y la presión del hidrógeno molecular es igual 0,101 MPa, entonces tal electrodo de hidrógeno se denomina normal. El potencial de un electrodo normal de hidrógeno es igual a cero.

Disoluciones amortiguadoras Las disoluciones capaces de mantener firmemente la estabilidad de la concentración de los iones hidrógeno (pH) cuando sobre ellas actúan cantidades relativamente pequeñas de ácido o álcali fuertes, como también durante la dilución, se denominan disoluciones amortiguadoras. Esta capacidad las disoluciones la adquieren gracias a la presencia en su composición de sustancias amortiguadoras, cuyo papel puede ser desempeñado por las mezclas que constan de: 1) ácidos débiles y sales muy disociables de estos ácidos; ejemplo, el amortiguador de acetato es ácido acético/ acetato sódico; el amortiguador de



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bicarbonato es ácido careo/bicarbonato sódico; el amortiguador de borato es ácido bórico/borato sódico. 2) bases débiles y sales muy disociables de estas bases; ejemplo, el amortiguador amónico es hidróxido amóni-oriiro amónico; 3) sales mono y bisustituidas de ácidos polibásicos; por ejemplo el amortiguador de fosfato es NaH 2PO4/Na2HPO4. La capacidad amortiguadora la poseen también los electrolitos anfóteros, por ejemplo, los aminoácidos, proteínas y algunas otras sustancias. El pH de las disoluciones amortiguadoras depende de la proporción en éstas entre ácido y sal, y a una proporción dada siempre invariable. De aquí que, cuando se preparan las disoluciones amortiguadoras se puede calcular teóricamente según

la

fórmula ¡e (-'ácido es la concentración del ácido, C sal es la concentración de la sal, C basP es la concentración de la base, K K es la constante de disociación electrolítica del ácido (base). De la fórmula citada se deduce que cambiando la proporción entre las concentraciones de los componentes de la mezcla amortiguadora, es posible preparar disoluciones con diferentes pH dentro de los límites determinados por la constante de disociación de los ácidos (bases). La dilución do las disoluciones amortiguadoras no trae consigo la variación de su pH, ya que la proporción do los componentes que constituyen la mezcla amortiguadora se queda en este caso invariable. Cada disolución amortiguadora se caracteriza por una capacidad amortiguadora determinada. Esta capacidad es la medida de la acción amortiguadora de la disolución y se esa por el número de equivalentes gramo de ácido o de base que. deben ser agregados a 1 l de disolución amortiguadora para desplazar su pH en una unidad. La calidad amortiguadora de las disoluciones depende de su concentración absoluta y con la dilución disminuye de una manera directamente proporcional al dilución.


grado de


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1.6 Preparación de las disoluciones amortiguadoras Anteriormente fue indicado que el pll de las disolución amortiguadoras depende de la naturaleza de las sustanci químicas que constituyen la mezcla amortiguadora y de proporción entre estas sustancias en la disolución. Partiendo de estos hechos, puede ser preparada una serie de disolución amortiguadoras con diferentes, pero conocidos pH. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Pipetas graduadas 10 ml.

Pipeta

cuentagotas. Reactivos. Fosfato potásico monosustituido, disolución 0.15 N. fosfato sódico

disustituido, disolución 0.15 M; ácido acético 0.1 acetato sódico, disolución 0.1 N. Indicador universal.

Marcha de los trabajos. 1. En seis tubos de ensayo previamente numerados se vierten las disoluciones de ácido acético y acetato sódico en las siguientes proporciones:

A las mezclas preparadas se añaden 2 gotas de indicador universal y por el carácter de la coloración se determina pH de cada mezcla. En caso de disponer de un potenciómetro, se determina el pH de las mezclas preparadas por el método potenciometrico. 2. Se numeran ocho tubos de ensayo y se vierten en caí uno de ellos disoluciones 0.15 M de KH2P04 en las siguientes proporciones



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El contenido de cada tubo de ensayo se mezcla cuidadosamente. En otros ocho tubos de ensayo numerados previamente se vierten G ml de disoluciones amortiguadoras respectivamente preparadas. Las disoluciones que se quedan en los tubos de ensayo 1 y cS se utilizan para la determinación aproximada del p 11 con ayuda de mi indicador universal y a base de esta determinación se selecciona un indicador unicolor apropiado del grupo de nitrofenoles, para la determinación exacta del pH de las disoi liciones amortiguadoras preparadas. Se añade 1 ml de indicador en cada uno de los ocho tubos de ensayo que contienen 6 mi do mezclas amortiguadoras preparadas. El contenido de los tubos de ensayo se mezcla cuidadosamente y, partiendo del color que se desarrolla en el líquido, so determina el pH de cada disolución amortiguadora, utilizando para ello los patrones estándar con los mismos indicadores. Los resultados de la determinación del pH se anotan en la tabla indicada más arriba.


Serie de Prácticas 2 Carbohidratos

C. Arzola, C. Holguín Facultad de Zootecnia, UACh

febrero 2006

2. Carbohidratos Facultad de Zootecnia, Universidad Autónoma de Chihuahua Responsable: Dr. Claudio Arzola Alvarez Número de alumnos por práctica: Tres Propósito de la práctica: Al terminar esta práctica, serás capaz de entender la naturaleza de los carbohidratos y la importancia práctica del conocimiento de los mismos, incluyendo la determinación cualitativa y cuantitativa de algunos de los mas importantes. Al mismo tiempo, tendrás la habilidad de elaborar un protocolo para emprender el estudio sistemático de un grupo de sustancias que constituyen la mayor parte de la dieta de los rumiantes, siendo dicho protocolo además un instrumento de comunicación adecuada con colaboradores y colegas, puesto que la práctica se llevará a cabo en grupo. Sin embargo, el protocolo deberá ser entregado en forma individual para su evaluación. Al terminar, deberás entregar un informe del desarrollo y resultados de la práctica, el cual deberá ser individual. En caso de presentarse duplicidad del informe con otros del grupo o de otros grupos, obtendrás menor calificación. Puesto que el desarrollo de esta práctica se considera una actividad integradora, deberás de observar una conducta adecuada durante la misma, con actitudes de respeto a tus compañeros y maestros. La pulcritud y el orden será un factor que te permita desarrollar la habilidad requerida para el desarrollo de este tipo de actividades, con miras a que tu posterior desempeño profesional sea de alto nivel.

Dr. Claudio Arzola Alvarez, M.C. Celia Holguín Licón Facultad de Zootecnia Universidad Autónoma de Chihuahua Página 24


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Carbohidratos 2 Los hidratos de carbono pertenecen a los compuestos poli-funcionales que contienen grupos carbonilo (aldehilico o cetónico) y grupos hidroxilo alcohólicos. Por lo tanto, ellos poseen simultáneamente propiedades de aldehidos o catonas y de alcoholes polihidroxílicos. Los hidratos de carbono comprenden un grupo amplio de compuestos naturales que se dividen en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos, según el número de átomos de carbono en la molécula, se clasifican en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, heptosas, etc. La fórmula genérica de los monosacáridos es CnH2nOn. Todos los monosacáridos naturales, teniendo en sus moléculas átomos de carbono asimétricos, son ópticamente activos y giran el plano de la luz polarizada. Los oligosacáridos y polisacáridos son hidratos de carbono complejos y al ser calentados con ácidos diluidos o hidrolizados por enzimas, se desintegran en monosacáridos. Entonces, los oligosacáridos se desintegran formando varias moléculas de monosacáridos (dos, en el caso de disacáridos; tres, en el caso de trisacáridos, cuatro, para los tetrasacáridos, etc.). Los polisacáridos forman mediante la hidrólisis un gran número de moléculas de monosacáridos. Ellos poseen una masa molecular muy elevada, son insolubles en agua o forman disoluciones coloidales. Los hidratos de carbono están muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el reino vegetal. Ellos constituyen los productos finales de la síntesis fotoquímica en las plantas verdes. Los animales, no aptos a tal acumulación de energía solar, aprovechan las sustancias acumuladas por las plantas. Los hidratos de carbono participan en la construcción de las estructuras del organismo vivo, sirven de material para la biosíntesis de los compuestos de otras clases y juegan un papel importante en la bioenergética de la célula. Los hidratos de carbono entran en la composición de los ácidos nucleicos, las glicoproteínas, los glicolípidos y en algunas vitaminas y coenzimas. Adaptado de PRACTICAS DE BIOQUÍMICA DEL GANADO Y AVES DE CORRAL, 1984. A.V. CHECHETKIN et. al. Editorial MIR, Moscú. 2


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Como componentes integrantes de las glicoproteínas, los hidratos de carbono participan en la formación de la capa exterior adyacente a la membrana, que desempeña un papel importante en la protección de las células contra la penetración en ellas de microorganismos y virus. Con tales hidratos de carbono están relacionadas las propiedades inmunoquímicas de los tejidos.

2.1. Reacciones de reconocimiento de los hidratos de carbono Reacción con α-naftol Esta reacción es general para los hidratos de carbono y se aplica para detectar la presencia de éstos en los materiales biológicos. El quimismo de la reacción se reduce al hecho de que mediante la acción del ácido sulfúrico concentrado se forma furfural a partir de las pentosas; 5-hidro-ximetilfurfural

a

partir de las

hexosas;

Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Reactivos, a- Naftol, disolución al 0.2%. Timol, disolución al 1% en alcohol

etílico. Acido sulfúrico concentrado. Sacarosa, disolución al 1%.

Marcha de los trabajos. En dos tubos de ensayo se vierten 2 ml de disolución de sacarosa en cada uno. En el primer tubo de ensayo se añaden de 4 a 6 gotas de disolución de α-náftol y en otro, igual cantidad de disolución de timol. En ambos tubos de ensayo se vierten con cuidado, por la pared, 1 ó 2 ml de ácido sulfúrico concentrado sin mezclarlo con la capa acuosa. En el contacto de las capas aparece una coloración violeta (en el caso de a-naftol) y roja (en el caso de timol).

2.2. Prueba con naftorresorcina La reacción se basa en la capacidad de los hidratos de carbono de condensarse con los sistemas aromáticos, formando sustancias coloreadas. Así, el ácido



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glucurónico al condensarse con naftorresorcina, forma derivados de dinaftil-metano o xantina:

Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Reactivos. Glucosa, disolución al 5%.

Naftorresorcina, disolución alcohólica al 1%.

Ácido clorhídrico concentrado. Éter.

Benceno.

Marcha de los trabajos. En un tubo de ensayo se vierten de 5 a 6 mi de disolución de glucosa, se añade 1 mi de disolución de naftorresorcina y 1 mi de ácido clorhídrico concentrado. La mezcla se calienta con cuidado y se hierve durante 1 min. Luego se enfría, se le añade de 1 a 2 mi de éter o benceno y agita. La capa etérica (bencénica) se tiñe de color verde azulado. Igual coloración dan la galactosa y la mañosa, mientras que la xilosa y la arabinosa proporcionan una coloración azul oscura y los ácidos urónicos, una coloración violeta.

2.3. Monosacáridos Los monosacáridos en disoluciones acuosas, se encuentran en diferentes formas tautoméricas, entre las cuales se establece un equilibrio dinámico:



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Aldohexosas En los organismos de los animales y del hombre la glucosa la galactosa se encuentran con mayor frecuencia.

2.4. Reacciones de reconocimiento le los hidratos de carbono reductores Los hidratos de carbono cuya molécula contiene un grupo carbonilo libre, se denominan reductores. Estos azúcares en medio alcalino tienen la capacidad de oxidarse, reduciendo a su vez las sales de óxido cúprico (valencia +2) a sales de óxido cuproso (valencia +1) a sales de plata, hasta plata metálica; las sales de óxido de bismuto, hasta bismuto metálico.

Prueba con el hidróxido cúprico (II), reacción de Trommer En disolución alcalina los mono y disacáridos reductores reducen el hidróxido cúprico (II) a óxido cuproso (I):



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Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Reactivos.

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Glucosa, disolución al 1%.

Hidróxido sódico, disolución al 10%. Sulfato cúprico, disolución al 1%.

Marcha de los trabajos. En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 ml de disolución de glucosa, un volumen igual de disolución de hidróxido sódico y, agitándolo, se añade, gota a gota, la disolución de sulfato cúprico. En presencia de la glucosa, el precipitado de hidroxido cúprico (II) formado se disuelve, coloreando el líquido de color azul claro. La capa superior del líquido se calienta hasta la ebullición. La aparición de un precipitado amarillo (hidróxido cuproso (I)) y luego rojo (óxido cuproso) indica que la reacción de Trommer es positiva. En otro tubo de ensayo se mezclan 2 ó 3 ml de disolución de hidróxido sódico con varias gotas de disolución de sulfato cúprico. Disolución de glucosa no se añade. Se forma un precipitado de hidróxido cúprico de color azul claro. Al calentar esta disolución, se forma un precipitado negro de óxido cúprico. Por lo tanto, en la reacción de Trommer debe evitarse el exceso de sulfato cúprico, ya que la reacción entre el hidrato de carbono reductor y el hidróxido cúprico transcurre cuantitativamente. El exceso del último durante el calentamiento pierde agua y se transforma en óxido cúprico negro, lo que oscurece la reacción principal y constituye un defecto del método: Cu (OH)2→ CuO + H2O.

2.5. Reacción con el licor de Fehling La reacción con el licor o reactivo de Fehling se basa en mismo principio que la reacción de Trommer. La diferencia consiste en que en las reacciones no se emplea hidróxido cúprico libre. Este último se encuentra en estado combinado y forma parte del reactivo de Fehling. El licor de fehling representa un compuesto complejo de cobre con tartrato de sodio y potasio de color azul. En su composición ion cobre en estado de oxidación « + 2» se encuentra forma de un compuesto complejo con



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tartratos. Por eso durante el calentamiento, incluso con exceso del reactivo dado, no se forma el precipitado negro de CuO y no oscurece la reacción con pequeñas cantidades de glucosa. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Reactivos. Glucosa, disolución al 1%. Reactivo de Fehling (preparación: disolución 1. En

un matraz de 500 ml se disuelven 34.65 g de cristales no aireados de vitriolo azul (CuSO4.5H2O), primero en una pequeña cantidad de agua destilada y al disolverse los cristales, el volumen se lleva hasta la raya de enrase. Disolución 2. En un matraz de 500 ml se disuelven, en pequeña cantidad de agua destilada, 173 g sal de Rochelle (tartrato sodico-potásico), se añaden 62.5 g de sosa caústica disuelta en 100 ml de agua destilada, se mezcla bien y el volumen se lleva hasta la raya de enrase. Antes de utilizarse las disoluciones 1 y 2 se mezclan en proporciones iguales).

Marcha de los trabajos. A 1 ó 2 ml de disolución de glucosa se añade igual volumen de reactivo de Fehling y se agita. La capa superior del líquido se calienta hasta la ebullición. Aparece, al igual que en la reacción de Trommér, un precipitado amarillo de hidróxido cuproso CuOH o bien precipitado rojo de óxido cuproso Cu2O.

2.6. Reacción con las sales de bismuto Para detectar los azúcares reductores se emplean frecúentemente las sales de bismuto. En la composición del reactivo Nylander, análogo al de Fehling, entra nitrato dibásico de bismuto que, en presencia de hidróxido sódico, forma hidrodróxido de bismuto. Este último se encuentra en estado combinado con el tartrato sodo-potásico. Al reaccionar con la glucosa, el hidróxido de bismuto se reduce a bismuto metálico y el líquido adquiere color negro. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Reactivos. Glucosa, disolución al 1%. Reactivo de Nylander (preparación: 2 g de

nitrato dibásico de bismuto y 4 g de tartrato sodo-potásico (sal de Rochelle) se disuelven en 100 ml de sosa cáustica al 10% y se hierven hasta disolverse la mayor parte de la sal de bismuto. El precipitado formado se enfría y se separa por filtración).



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Marcha de los trabajos. A 2 ml de disolución de glucosa se añade 1 ml de reactivo de Nylander y se hierve durante 2 ó 3 min. El líquido oscurece debido a la formación de un precipitado n egro de bismuto metálico.

2.7. Reacción con fenilhidrazina Una particularidad importante de los monosacáridos consiste en su capacidad de entrar en reacción con la fenilhidrazina y formar fenilhidrazonas y osazonas. La reacción de formación de osazonas transcurre en tres etapas. Al reaccionar los monosacáridos con la fenilhidrazina, en la primera etapa se forman fenilhidrazonas solubles en agua (reacción de sustitución). En la segunda etapa, con la fenilhidrazonas solubles en agua (reacción de sustitución). En la segunda etapa, con la fenilhidrazona formada reacciona otra molécula de fenilhidrazina y, oxidándola, transforma el grupo hidroxilo en grupo carbonilo. La tercera molécula de fenilhidrazina entra en reacción de sustitución con el grupo carbonilo recién formado, lo que conduce a la formación de compuestos poco solubles en agua: osazonas, que producen cristales de color amarillo, de forma característica. La forma de los cristales de osazonas es variable y depende de la estructura de los monosacáridos, de los cuales se forman las osazonas. Las osazonas de diferentes monosacáridos se distinguen por la forma de los cristales, punto de fusión, solubilidad y actividad óptica. Por eso, estas propiedades se utilizan para aislar los monosacáridos de la disolución, como también para distinguir unos azúcares de otros (fig. 10).



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2.8. Reacción de reconocimiento de la sacarosa La sacarosa es un disacárido no reductor y durante la hidrólisis (por ácido o enzimáticos) su molécula se descompone en glucosa y fructosa:

Sacarosa



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La sacarosa da con el sulfato de cobalto en un medio alcalino un complejo de color violeta. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Reactivos. Sacarosa, disolución al 1%. Sulfato de cobalto, disolución al 2%.

Hidróxido sódico, disolución al 10%.

Marcha de los trabajos. En un tubo de ensayo se vierten de 2 a 3 ml de disolución de sacarosa, se añaden varias gotas de disolución de sulfato de cobalto. Al añadir exceso de hidróxido sódico (1 mi) el líquido adquiere un color violeta.

2.9. Reacciones de fermentación de los hidratos de carbono La fermentación es un proceso complejo de descomposición de los hidratos de carbono bajo la acción de las enzimas producidas por diferentes microorganismos. En la mayoría de los casos este proceso va acompañado con el desprendimiento de productos gaseosos (CO2, H2, etc.)- La fermentación conduce, al fin y al cabo, a la formación de productos tales como alcohol etílico, ácido láctico, etc. Según los tipos de microorganismos y de los productos finales se distinguen varias formas de fermentación. La fermentación alcohólica se utiliza en la industria con el fin de obtener alcohol etílico; la fermentación láctica, en la industria alimenticia para la obtención de diferentes productos lácteos y en la ganadería en el proceso de ensiláje. La fermentación acética, propiónica, butírica, láctica tienen lugar en el rumen de los rumiantes. La fermentación metánica produce la timpanitis (distensión) en los rumiantes. A la fermentación alcohólica se someten solamente las hexosas a diferencia de otros monosacáridos, por ejemplo, de las pentosas. Esto se aprovecha para distinguir las hexosas de las pentosas. La maltosa y la sacarosa se fermentan fácilmente con las levaduras, mientras que la lactosa no se fermenta. En las levaduras están presentes las enzimas maltasa y sacarasa, pero no tienen la enzima lactasa. La lactosa bajo la acción de las bacterias que la desdoblan, puede someterse a la fermentación alcohólica, láctica y butírica.



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Polisacáridos Éstos son hidratos de carbono de elevado peso molecular e mediante la hidrólisis se desdoblan en gran número restos de monosacáridos. Cada resto del monosacárido á unido con los restos vecinos por enlaces glicosídicos. Por lo tanto, los polisacáridos pueden considerarse como glicosídicos. Las cadenas poliglicosídicas que forman las moléculas de los polisacáridos pueden ser no ramificadas celulosa) o ramificadas (glicógeno). Las unidades de los inosacáridos que forman parte de la composición de la molécula del polisacárido pueden ser iguales (homopolisácárídos) ó diferentes (heteropolisacáridos). La celulosa, el almidón y el glicógeno son homopolisacáridos típicos.

Almidón El almidón es el producto final de la síntesis fotoquímica que se verifica en las hojas verdes, un polisacárido de reserva. Para el organismo de los animales el almidón constituye una sustancia nutritiva importante. El almidón es una sustancia heterogénea. Está compuesto de dos fracciones: la amilosa (de 10 a 20%) y la amilopectina (de 80 a 90%). La amilosa incluye de 1000 a 6000 unidades de a-D-glocosa unidas por enlaces glucosídicos 1-4. Ella tiene forma de molécula alargada lineal no ramificada, es soluble en agua. La amilopectina también está compuesta de un gran número de unidades de a-Dglucosa unidas, como en la amilosa, por enlaces glucosídicos 1-4. Sin embargo, las cadenas de amilopectina son muy ramificadas y tienen en los puntos de ramificación enlaces glucosídicos 1-6. En el agua la amilopectina se hincha y produce un engrudo.

2.10. Reacciones coloreadas del almidón Una reacción característica para reconocer el almidón es la aparición de una coloración azul al combinarse con la disolución de iodo en ioduro potásico. La reacción de los polisacáridos, en particular del almidón, con iodo es un proceso complejo. La coloración que aparece depende de la estructura de polisacárido. En el curso de la reacción se forma un complejo del polisacárido con iodo. Este proceso



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es bien expresado en el caso de la amilosa. En el caso de los polisacáridos de cadenas ramificadas, por ejemplo, la amilopectina y el glicógeno, junto con el proceso de formación del complejo, tiene gran importancia también el proceso de adsorción de iodo sobre la superficie de las moléculas ramificadas. Se ha demostrado la relación entre la longitud de las cadenas laterales y la coloración resultante de la reacción con yodo. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Reactivos. Almidón, disolución al 1 %. Disolución de Lugol (preparación: en 100 ml de

agua se disuelven 20 g de ioduro potásico y 10 g de iodo. Para la reacción con

el almidón la disolución obtenida sé diluye con agua destilada en proporción 1:5). Hidróxido sódico, disolución al 10% Alcohol etílico. Marcha de los trabajos. En un tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 ml de disolución de almidón y se añade 1 gota de disolución de Lugol. El líquido se colorea de azul. El contenido del tubo de ensayó se divide en tres partes: a la primera parte se le añade 1 ó 2 ml de disolución de hidróxido sódico, a la segunda, 2 ó 3 ml de alcohol etílico, la tercera parte se calienta. La coloración desaparece siempre. En la tercera muestra la coloración vuelve a aparecer después del enfriamiento. Esto indica que la prueba con iodo debe realizarse sólo con disolución de almidón fría. Debido a la inestabilidad del complejo de adsorción entre iodo y almidón, esta reacción es sensible a la presencia de alcohol, al calentamiento y a la acción de los álcalis con los cuales el iodo forma hipoioditos.

2.11 Hidrólisis acida escalonada del almidón En el curso del calentamiento del almidón con ácido clorhídrico diluido, él se descompone con la formación de los fragmentos de diferente tamaño llamados dextrinas. Éstas se distinguen entre sí en cuanto a la masa molecular y al carácter de la coloración que surge al tratarlas con la disolución de iodo. Más abajo se da el esquema de la hidrólisis acida del almidón:



Instrumentos. Reactivos.

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Soporte con tubos de ensayo. Pipetas.

Almidón, disolución al 1%. Ácido clorhídrico concentrado. Disolución

de Lugol. Papel de tornasol. Hidróxido sódico, disolución al 10%. Licor de Fehling. Marcha de los trabajos. En un tubo de ensayo se vierten de 3 a 5 ml de disolución de almidón y se añaden varias gotas de ácido clorhídrico concentrado. Se mezcla cuidadosamente y se hierve a fuego abierto. Luego de 1 ó 2 min iniciada la ebullición se toma una muestra para la reacción con iodo. Para esto se extraen varias gotas de disolución una pipeta y se vierten en un tubo de ensayo que contenga 5 ó 6 ml de agua destilada, se añaden 1 ó 2 gotas de disolución de Lugol. La coloración violeta azul aparecida indica presencia de las amilodextrinas en disolución. El tubo de ensayo con la disolución de almidón se hierve 1 ó 2 min mas y se repite la misma prueba con iodo; aparece una coloración rojiparda condicionada



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por la presencia de las en dextrinas. Se hierve nuevamente la disolución y pasados 2 ó 3 min se repiten las pruebas con iodo. El almidón se desintegra al final hasta la glucosa, produciendo como productos intermedios acrodextrinas, maltodextrinas y maltosa. La reacción con iodo será negativa: el líquido adquiere un color amarillo a cuenta de la coloración de la disolución de Lugol. El hidrolizado de almidón se neutraliza, según un papel de tornasol, con disolución de hidróxido sódico, se añade licor de Fehling y se calienta. Se forma un precipitado amarillo de hidróxido cuproso, o rojo, de óxido cuproso que indica la presencia en la disolución de productos de la hidrólisis que poseen propiedades reductoras.

2.12. Hidrólisis enzimática del almidón Bajo la influencia de la enzima amilasa el almidón se desdobla con la formación de un disacárido, la maltosa, luego se descompone por la maltasa hasta la glucosa. Instrumentos.

Soporte con tubos de ensayo. Pipetas. Baño maría con

termómetro. Reactivos.

Preparado de saliva (1 ó 2 ml de saliva se coloca en un vaso y se

diluyen 5 veces con agua destilada, se mezclan cuidadosamente). Los demás reactivos son los mismos que en el experimento anterior. Marcha de los trabajos. En un tubo de ensayo se vierten 3 a 5 ml de disolución de almidón y se añaden 0.5 ó 1 ml de saliva, se mezcla cuidadosamente y se pone en ei baño maría durante 10 ó 15 min a una temperatura de 37 a 40° C. Se hacen repetidamente las pruebas con iodo; la ausencia de coloración característica demuestra que la hidrólisis ha finalizado. La presencia de la glucosa se confirma por la reacción positiva con el licor de Fehling.

Glicógeno El glicógeno sirve de reserva principal de hidratos de rbono en el organismo de los animales. Él se deposita casi en todos los órganos y tejidos. El depósito principal



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de glicógeno son el hígado (de 2 a 5%) y los músculos (de 0.5 a 2%) en los cuales esta acumulado hasta 60% de su contenido en el organismo. El glicógeno es un polímero de a-D-glucosa en que las unidades de glucosa están unidas entre sí por los enlaces glicosídicos 1-4 y 1-6; por su constitución química el glicógeno se asemeja a la amilopectina. Igual que el almidón, en el curso de la hidrólisis el glicógeno da una serie de productos

intermedios, las

dextrinas, luego el disacárido la maltosa y, finalmente, el monosacárido la glucosa. Al añadir iodo, la disolución de glicógeno adquiere una coloración rojiparda de diferentes intensidades y matices, lo que depende de la estructura del glicógeno que difiere para distintas especies de animales y se determina según al grado de ramificación de la macromolécula.

2.13 Reacción del glicógeno con el iodo Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Reactivos. Glicógeno, disolución al 1%. Disolución de Lugol. Cloruro sódico cristalino.

Hidróxido sódico, disolución al 10%.

Reconocimiento del glicógeno en los tejidos animales Instrumentos. Soporte con probetas de centrífuga y tubos de ensayo corrientes.

Pipetas. Varillas de vidrio. Vaso con hielo. Centrífuga. Baño María. Reactivos. Hidróxido potásico, disoluciones al 15% y al 60%. Muestra pesada de hígado

(de 1.5 a 2 g). Etanol. Ácido clorhídrico, disolución al 2,5%. Hidróxido sódico, disolución al 10%. Licor de Fehling.

Marcha de los trabajos. En una probeta centrífuga se ponen 1,5 ó 2 g de hígado y se vierten 2 ml de disolución de hidróxido potásico al 60%. La probeta se coloca en el baño maría hirviendo, el contenido de la probeta se remueve frecuentemente con una varilla de vidrio. Luego la probeta se quita del baño, se enfría y se le añaden de 8 a 10 ml de etanol. La probeta se pone en el vaso con hielo donde se mantiene durante 20 ó 30 min. Se sedimenta el precipitado del glicógeno. Éste se separa mediante la centrifugación durante 5 ó 10 min a 3000 r.p.m. Se extrae el líquido, que se encuentra encima del precipitado, el precipitado se disuelve en 2 ml de



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disolución de hidróxido potásico al 15%, se añaden 8 ó 10 ml de etanol y la mezcla obtenida se enfría. El precipitado formado del glicógeno se separa mediante la centrifugación. Luego el precipitado del glicógeno se hidroliza y se demuestra la presencia de la glucosa en su composición. Para ello se añaden al precipitado 3 ó 4 ml de disolución de ácido clorhídrico y se hierve durante 15 ó 20 min en el baño de María. Acto seguido, el contenido se enfría, se neutraliza con la disolución de hidróxido sódico, se le añade igual volumen de licor de Fehling y la mezcla se hierve. Se forma un precipitado rojo de óxido cupr oso .


Serie de Prácticas 3 Lípidos


febrero 2006

3. Los lípidos y su metabolismo Facultad de Zootecnia, Universidad Autónoma de Chihuahua Responsable: Dr. Claudio Arzola Alvarez Número de alumnos por práctica: Tres Propósito de la práctica: Al terminar esta práctica, serás capaz de manejar con propiedad el análisis de los lípidos y sustancias afines. Podras constatar algunos fenómenos de importancia en cuanto a la respuesta física de los lípidos y relacionar esta con fenómenos de producción agropecuaria. Al mismo tiempo, tendrás la habilidad de elaborar un protocolo para emprender el estudio sistemático del grupo de sustancias alimenticias que contribuyen significativamente con la aportación energética de las dietas de los animales con lo que lograrás una eficiente comunicación con colaboradores y colegas, puesto que la práctica se llevará a cabo en grupo. Sin embargo, el protocolo deberá ser entregado en forma individual para su evaluación. Al terminar, deberás entregar un informe del desarrollo y resultados de la práctica, el cual deberá ser individual. En caso de presentarse duplicidad del informe con otros del grupo o de otros grupos, obtendrás menor calificación. Puesto que el desarrollo de esta práctica se considera una actividad integradora, deberás de observar una conducta adecuada durante la misma, con actitudes de respeto a tus compañeros y maestros. La pulcritud y el orden será un factor que te permita desarrollar la habilidad requerida para el desarrollo de este tipo de actividades, con miras a que tu posterior desempeño profesional sea de alto nivel.



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Los lípidos y sus metabolitos Glicéridos (grasas) 3

Se denomina lípidos un grupo numeroso de sustancias constituidas como los esteres y caracterizadas por su solubilidad en disolventes orgánicos y por su insolubilidad en agua. A ellos pertenecen los glicéridos (grasas), las ceras, los esteróles (estearinas), fosfolípidos y glicolípidos (cerebrosidos, gangliósidos). Los lípidos desempeñan un papel muy importante en calidad de componentes estructurales de las membranas celulares, como fuente de energía, disolvente para las sustancias orgánicas y como precursores de otros componentes de la célula (vitaminas del grupo D, ácidos biliares y hormonas de naturaleza de esteroides). En el organismo de los animales casi todos los lípidos se encuentran en complejo con las proteínas, los hidratos de carbono y otras sustancias. A los complejos se les atribuye una gran significación en el cumplimiento de una serie de funciones importantes. Así, son ricas en lipoproteínas las mitocondrias, que son elementos estructurales de las células, en los cuales se verifican los procesos de oxidación libre y conjugada con la fosforilación, como también una parte considerabl e de los procesos de metabolismo intermedio. Las grasas son esteres de un alcohol trivalente (la glicerina y los restos de ácidos grasos de cadena larga que tienen la estructura general siguiente:

Adaptado de PRACTICAS DE BIOQUÍMICA DEL GANADO Y AVES DE CORRAL, 1984. A.V. CHECHETKIN et. al. Editorial MIR, Moscú. 3


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En la composición de la molécula de una grasa natural entran, corrientemente, los restos de ácidos grasos saturados y no saturados (palmítico, esteárico, oleico, linoleico, etc. En el organismo de los animales los glicéridos son en su mayoría mixtos, y sólo un 2 ó 3% de ellos son glicéridos simples (tripalmitato, triestearato, trioleato). Como regla, todas las grasas n aturales (el sebo de res, la manteca de cerdo, los aceites, etc.) constituyen una mezcla compleja de varios glicéridos, proteínas, ácidos grasos libres, vitaminas, carotinoides y pigmentos. Las grasas tienen gran importancia para el organismo como una de las fuentes de energía (grasa de reserva). A más, ellas sirven de componentes estructurales del protoplasma celular (grasa estructural), participan en la termorregulación del organismo, protegen los órganos, nervios y vasos los deterioros mecánicos, favorecen la asimilación de vitaminas liposolubles A, D, E y K, y de otras sustancias biológicamente activas. Los ácidos grasos no saturados presentes en las grasas linoleico, linolénico, araquidónico, son necesarios parí regulación de los procesos de oxidación-redución en las células, como también para la biosíntesis de las prostaglandinas que constituyen un gran grupo de hormonas de gran actividad biológica.

Reacciones de reconocimiento de las grasas. 3.1. Reacción de la grasa y el aceite con el Sudán III Instrumentos. Vidrio de reloj o placas de vidrio. Reactivos. Sudán III, disolución al 0.2% (preparación: en 200 mg de Sudán III se

añaden 100 ml de alcohol etílico al 70% calentado en un baño maría, se mezcla y se deja en reposo durante 24 h por lo menos). Aceite vegetal.

Marcha de los trabajos. Sobre el vidrio de reloj se aplica una gota de aceite, se añade una gota de Sudán III y se mezcla. Se observa la aparición de una coloración naranja de la mezcla. El colorante Sudan III se aplica en las investigaciones histológicas para localizar las grasas en los tejidos.



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3.2. Determinación de la glicerina en las grasas En el curso del calentamiento de una grasa en presencia de agentes deshidratantes, en particular, de hidrosulfatos de potasio o sodio se desprenden fácilmente de la glicerina dos moléculas de agua, y ella se convierte en acroleína, que es un aldehido no saturado,

La reacción de formación de la acroleína se hace con el propósito de reconocer la glicerina libre o ligada en la molécula de grasa. Los lípidos que no contienen glicerina (ceras, esterinas, inositolfosfolípidos y esfingolípidos) dan reacción de acroleína negativa. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Mechero de gas o infer-nilla. Ractivos. Grasa o aceite vegetal. Cera. Hidrosulfato potásico (sódico), cristalino.

Marcha de los trabajos. El experimento debe realísarze en la campana de humos. En un tubo de ensayo se vierte ó 10 gotas de aceite, en el otro se pone de 0.3 a 0.5 g de aceite. En ambos tubos se añade aproximadamente 1 g de hidrosulfato potásico. La mezcla en los tubos de ensayo se calienta con cuidado pero fuertemente. La formación de la acroleina en el tubo de ensayo con la grasa se reconoce por la aparición de un olor característico, acre intenso. Énel otro tubo de sayo no se forma acroleína.

3.4. Solubilidad de las grasas El trabajo se realiza con el aceite vegetal y diferentes solventes. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Reactivos. Aceito de girasol. Alcohol etílico. Benceno. Cloroformo

Marcha de tos trabajos. En cuatro tubos de ensayo se vierten de 5 a 7 gotas de aceite dé girasol. En el primer tubo añaden 2 ml de agua, en el segundo 2 ml de alcohol, en el tercero 2 ml de benceno y en el cuarto 2 ml de cloroformo, mezcla en los tubos de ensayo se agita enérgicamente. Se observan los siguientes cambios: en el primer tubo se forma una emulsión inestable que se separa rápidamente; en el



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segundo una disolución turbia, que indica la mala solubilidad del aceite en alcohol; en el tercero y el cuarto tubos de ensayo se forman disoluciones transparentes debido debido a una buena solubilidad del aceite en ben ceno y clor oformo.

3.5. Determinación de la temperatura de fusión La temperatura de fusión de una grasa es uno de los indicadores que permite, en cierta medida, juzgar sobre su asimilación. Las grasas que funden a baja temperatura se emulsifican más fácilmente y, en consecuencia, se asimilan con mayor facilidad. La temperatura de fusión de los glicéridos es condicionada por sus ácidos grasos constituyentes. Como regla, el punto de fusión de la grasa es tanto más bajo cuanto más alto es el contenido de los ácidos de cadena corta o no saturados. A la temperatura ambiente las grasas de origen vegetal son líquidos, puesto que en su composición la cantidad de ácidos grasos no saturados alcanza un 95 ó 97%. En la composición de las grasas sólidas poco fusibles de origen animal prevalecen los ácidos grasos de cadenas de carbono largas. Las grasas naturales no poseen un punto de fusión determinado, ya que no son sustancias químicas individuales, sino mezcla de diferentes glicéridos, ácidos grasos libres, pigmentos, vitaminas y otras sustancias. La temperatura de fusión de las grasas depende de la especie del animal y oscila dentro de límites siguientes en °C: ovejas 49—54, venados 48—52, ganado vacuno 48—50, cabras 46—48, camellos camellos 36-48, cerdos37— 45, caballos28—32,perros23—27, conejos 22- 25. Instrumentos. Capilar de vidrio de 1.5 ó 2 mm en diámetro. Termómetro. Tubo

de ensayo. Vaso químico. Lupa. Reactivos. Grasa de origen animal (fundida y filtrada).

Marcha de los trabajos. El capilar limpio y seco se llena de grasa a una altura de unos 2 cm y se mantiene durante 1 h sobre hielo o en agua corriente fría. Terminado el enfriamiento, la parte del capilar llenada de grasa se corta, dejando la columna de grasa de 0.5 cm de altura. El capilar se ajusta mediante un anillo de goma en la parte inferior del termómetro de tal manera que su punta llena de grasa



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sea dirigida hacia arriba y su otro extremo libre de grasa, hacia abajo. El termómetro con capilar se mete en el tubo de ensayo donde se ajusta con ayuda de un tapón. El tubo de ensayo se sumerge en el vaso con agua y se sujeta en la patilla del soporte en posición vertical. El nivel de agua en el vaso debe ser más alto que el término superior del capilar. El agua se calienta poco a poco, removiéndola frecuentemente, y a través de la lupa. Se observa el aumento de la temperatura y el estado columna de grasa en los capilares. La indicación del termómetro en el momento cuando la grasa empiece a fluir por el capilar y en la parte superior de este último se forme un espa espació ció libre, se an ota como la tempera tura de fusión. Entre el inicio y el final de la transición de la grasa desde el estado sólido al líquido transcurre cierto tiempo. Por lo tanto, para evitar errores, la temperatura de fusión grasa se determina por lo menos dos veces, y el resultad o se calcula como promedio.

3.6. Determinación del número acídico El número acídico caracteriza la presencia de ácidos grasos libres en la grasa. El número acídico se expresa en cantidad de miligramos de hidróxido potásico necesarios para neutra neutralizar lizar los ácidos á cidos grasos graso s libres en e n 1 g de grasa. Este índice es uno de los indicadores más importantes la calidad de la grasa. El número acídico de la grasa fresca de distintos tipos no sobrepasa, comúnmente, una magnitud de 1.2 a 3.5. En el curso de almacenaje de la grasa tiene lugar la hidrólisis de los glicéridos y acumulación de los ácidos grasos libres. Una elevada acidez de una grasa indica indica la pérdida de su calidad. Instrumentos. Matraz Erlenmeyer. Bureta. Pipetas de 1 y 10 ml. Reactivos. Aceite de girasol. Mezcla neutralizada de alcohol con éter (mezcla de

alcohol con éter 1:2 que se neutraliza con disolución 0.1 N de hidróxido potásico según la fenolftaleina). Hidróxido potásico, disolución 0.1 N. Fenolftaleina, disolución 0.1%.

Marcha de los trabajos. En el matraz Erlenmeyer se vierte 1 g de aceite de girasol,

se

añaden

10

ml

de

mezcla

de

alcohol

con éter, el contenido se agita cuidadosamente. Se agregan 2 ó 3 gotas de



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fenolftaleína, y la disolución se valora rápidamente con la disolución de hidróxido potásico potá sico 0,1 N, con c on agitación, agitación, hasta hasta la aparición aparición de una coloración coloración rosa que persista persista más de 1 min. El número acídico se calcula según la fórmula

donde x es el número acídico, en mg; a es el volumen de disolución de hidróxido potásico de 0.1 N consumido para la valoración de la prueba a investigar, en ml; 5.6 es la cantidad de hidróxido potásico (mg) que se contiene en 1 ml de disolución dé hidróxido potásico 0.1 N; K es el coeficiente de corrección dé la disolución de 0.1 N de hidróxido potásico; c es la muestra pesada de aceite, en g.

3.7. Determinación del índice de iodo Se denomina índice de iodo la cantidad de gramos de iodo que pueden combinarse con 100 g de grasa. Este número permite evaluar el grado de insaturación de la grasa provocado por la presencia de glicéridos con ácidos grasos de dobles enlaces, la capacidad de la grasa para la oxidación, para la reducción y otras reacciones. Cuanto mayor es el contenido de ácidos grasos no saturados en la grasa, tanto mayor es su índice de iodo. El índice de iodo dé algunas grasas y aceites oscila dentro de los siguientes límites: de res, 27—47;de carnero,31—46; de cerdo, 46—66;de perro, 56—67; aceite de girasol, 129—136; aceite de cáñamo, 145—162; aceite de linaza, 175—201.

El principio del método . La determinación del índice de iodo se basa en la reacción de adición del iodo al lugar de ruptura de los dobles enlaces en las moléculas de ácidos grasos, que se verifica cuantitativamente según el esquema:

El iodo que no ha reaccionado se valora con tiosulfato.



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Instrumentos. Matraces Erlenmeyer de 50 ml con tapones. Bureta. Pipeta de 10

ml. Reactivos. Aceite de girasol. Cloroformo. Iodo, disolución 0.1 N en alcohol (la

preparación: 12.691 g de iodo recién sublimado se disuelven en 1 l de alcohol etílico al 96%). Tiosulfato sódico, disolución 0.1 N. Almidón, disolución al 1%.

Marcha de los trabajos. En un matraz (prueba experimental) se pone 0.1 g de aceite de girasol (se pesa en una balanza analítica), en el otro (prueba de control) 0.1 mi de agua, y se añaden de la bureta 5 ml de cloroformo en cada uno. Cuando la muestra de aceite sea disuelta, en los matraces se añaden con la pipeta 10 ml (¡exactamente!) de disolución 0.1 N de iodo en alcohol, los matraces se cierran con tapones, el contenido se remueve agitándolo, y los se dejan en la oscuridad. Al cabo de 5 min las pruebas se evalúan, agitando permanentemente, con disolución de tiosulfato sódico 0.1 N, primero hasta que la coloración se ponga amarilla clara, y luego al añadir 1 ml de disolución de almidón al 1% desaparición de la coloración azul. El índice de iodo (x,g) se calcula según la fórmula: donde b es el volumen de disolución de tiosulfato sódico 0.1 N, consumido en la valoración de lá prueba de control en ml; a es el volumen de la disolución de tiosulfato sódico 0.1 N consumido en la valoración de la prueba experimental, en ml; K es el coeficiente de corrección del título de la disolución 0.1 N de tiosulfato sódico;

0.01269 es la cantidad de iodo (g) equivalente a 1 ml de disolución de tiosulfato sódico 0.1 N; 100 es el coeficiente de recuento para los 100 g de grasa; c es la muestra pesada de grasa, g.

3.8. Determinación del número (índice) de saponificación Número de saponificación se denomina el núnero de miligramos de hidróxido potásico que se necesitan para neutralizar todos los ácidos grasos (libres y ligados en forma de glicéridos) que se contienen en 1 g de grasa. El número de saponificación de algunos aceite de buena calidad tiene los valores siguientes: grasa de res, 190—200; grasa de carnero, 192—198; manteca de cerdo, 200; manteca de vaca, 212—247; aceite de linaza, 187-195.



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Instrumentos. Baño de maría. Matraces Erlenmeyer refrigerantes de reflujo.

Bureta. Pipetas graduadas de 1 ml. Reactivos. Aceite de girasol. Hidróxido potásico alcohólica 0.5 N (la preparación:

30 g de hidróxido de potasio quimicamente puro se disuelven en 30 ml de agua destilada, y el volumen se lleva a 1l con alcohol etílico al 96%; al cabo de 24 h se filtra). Ácido clorhídrico, disolución 0.5 N. Fenolftaleína, disolución al 0.1%.

3.9. Determinación cuantitativa de la grasa en el hígado y los músculos El contenido de la grasa se determina mediante la extracción de una muestra pesada de los tejidos a investigar en el aparato Soxhlet. El aparato consiste de tres partes: matra (7), extractor (2) y refrigerante de reflujo (3) unidos ajuste damente mediante conexiones esmeriladas (fig. 11). Principio del método. El método se basa en la determinación de la masa de los

tejidos antes y después de la extracción de la s grasa s con disolvente. Instrumentos. Aparato Soxhlet. Balanza analítica. Estufa, a 106 °C. Baño maría.

Cartuchitos para extracción hechos d papel de filtro denso desgrasado (los cartuchitos se secan, se pesa y se guardan en el desecador). Tijeras curvas. Mortero de porcelans Vidrios de reloj. Pesafiltros. Reactivos. Hígado y músculos frescos. Éter dietílico.

Marcha de los trabajos. Se toman muestras pesadas de hígado y músculos (hasta 3 g de cada tejido), se desmenuzan con tijeras sobre un vidrio de reloj, se ponen en los pesafiltros se secan en el armario secador a una temperatura de 102 106 °C hasta una masa constante. Las muestras secadas se trituran en el mortero y se trasladan en cartuchitos de papel de filtro. Los cartuchitos con el material a investigar se pesan y se meten en el extractor del aparato Soxhlet. Todas las partes del aparato se unen herméticamente, éste se coloca en el baño maría. A través de la boca superior del refrigerante el extractor y el matraz se llenan de éter en una cantidad igual a dos volúmenes del extractor. Se deja pasar el agua por el refrigerante, y el matraz se calienta en el baño de María.



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Durante la extracción se observa que la cantidad del disolvente en el matraz no sobrepase 2/3 de su capacidad y que

Aparato Soxhlet

el disolvente que se condensa no suba demasiado en el refrigerante. La extracción se prolonga durante 5 ó 6 h. La plenitud de la extracción de la grasa desde los tejidos se establece por la ausencia de manchas grasosas sobré papel de filtro tras la evaporación de varias gotas de éter tomado del extractor. Después de la extracción los cartuchitos con el material se quitan del aparto Soxhlet y se secan primero en la campana de humos y, al vaporizarse el éter, en el armario secador a una tempetarura de 102 a 106° C durante 4 ó 5 h hasta la masa constante. Los cartuchitos se pesan en la balanza analítica y a partir de la diferencia entre la masa del cartuchito antes y después de la extracción se determina la cantidad de la grasa en las muestras pesadas. La cantidad de la grasa x (en %) se calcula según la fórmula



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donde a es la masa del cartuchito con la muestra antes de la extracción, en g; b es la masa del cartuchito con la muestra después de la extracción, en g; c es la muestra pesada del material a investigar, en g; 100 es el coeficiente por centual de recuento.


Serie de Prácticas 5 Enzimas


febrero 2006

4. Enzimas4 Facultad de Zootecnia, Universidad Autónoma de Chihuahua Responsable: Dr. Claudio Arzola Alvarez Número de alumnos por práctica: Tres Propósito de la práctica: Al terminar esta práctica, serás capaz de manejar con propiedad las enzimas. Podrás constatar algunos fenómenos de importancia en cuanto a la respuesta física de las enzimas y relacionar esta con fenómenos de producción agropecuaria. Al mismo tiempo, tendrás la habilidad de elaborar un protocolo para emprender el estudio sistemático del grupo de moléculas mas represenativas de la bioquímica, con lo que lograrás una eficiente comunicación con colaboradores y colegas, puesto que la práctica se llevará a cabo en grupo. Sin embargo, el protocolo deberá ser entregado en forma individual para su evaluación. Al terminar, deberás entregar un informe del desarrollo y resultados de la práctica, el cual deberá ser individual. En caso de presentarse duplicidad del informe con otros del grupo o de otros grupos, obtendrás menor calificación. Puesto que el desarrollo de esta práctica se considera una actividad integradora, deberás de observar una conducta adecuada durante la misma, con actitudes de respeto a tus compañeros y maestros. La pulcritud y el orden será un factor que te permita desarrollar la habilidad requerida para el desarrollo de este tipo de actividades, con miras a que tu posterior desempeño profesional sea de alto nivel.

Adaptado de PRACTICAS DE BIOQUÍMICA DEL GANADO Y AVES DE CORRAL, 1984. A.V. CHECHETKIN et. al. Editorial MIR, Moscú. 4


Enzimas…

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Se llaman enzimas las proteínas específicas que poseen función catalítica. Con participación de las enzimas se verifican numerosos procesos químicos, el conjunto de los cuales constituye la esencia del metabolismo. Influyendo en la velocidad de las reacciones metabólicas, las enzimas son capaces de regular efectivamente los procesos de vitalidad. Semejantemente a los catalizadores inorgánicos, las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones químicas a cuenta de la disminución de la energía de activación. Sin embargo, los catalizadores biológicos poseen una eficiencia mayor en la disminución de la energía de activación y, como regla general, desempeñan su función a una temperatura moderada, presión baja y unos valores de pH cercanos al neutro. Al mismo tiempo, las enzimas son sensibles a las variaciones de las condiciones del medio en que están funcionando y tienen una serie de particularidades relacionadas a su naturaleza proteínica.

Propiedades generales de las enzimas Las particularidades características de las enzimas, su especificidad, sensibilidad al cambio de la temperatura y el pH del medio así como también a la presencia de los activadores e inhibidores, son condicionadas por la naturaleza proteínica de los catalizadores biológicos. La actividad catalítica de la enzima está relacionada con a presencia en su molécula de unas regiones especiales responsables de la fijación y la activación del sustrato: el centro de sustrato y el centro activo. Ellos consisten en una combinación única do los restos de aminoácidos situados en la cadena polipéptida a larga distancia uno del otro.



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Acercándose, ellos dan lugar a un centro catalítico, al formarse una estructura terciaria de la molécula. En cuanto a las enzimas, que son proteínas conjugadas, en la formación del centro catalítico participan también los componentes no proteínicos directamente afines a la región activa del glóbulo. Cualquier influencia exterior que altera la conformación nativa de la molécula proteínica conduce a la inactivación de la enzima.

4.1 La labilidad térmica de las enzimas La temperatura del medio influye mucho en la actividad de las enzimas. La temperatura óptima para la acción de enzimas es Ja temperatura de cuerpo de los animales que oscila en el intervalo de 36 a 41 °C. Con cierto aumento de la temperatura del medio ocurre aceleración de la reacción a consecuencia de la activación de las moléculas de sustrato. A la vez, incluso un aumento pequeño de la temperatura conduce al debilitamiento de los enlaces que mantienen la conformación de la molécula de enzima, necesaria para la manifestación de su actividad catalítica. Empieza, gradualmente, la desnaturalización de la enzima que se acelera bruscamente a la temperatura que sobrepase 50°C. La inactivación de la enzima con aumento de la temperatura del medio es irreversible. Al bajar la temperatura la enzima disminuye su actividad también. El mecanismo de este proceso no está claro. Sin embargo, el enfriamiento no causa desnaturalización de la enzima y por lo tanto su inactivación puede ser reversible.

Principio del método. Se investiga la influencia del camino de Ja temperatura del medio exterior sobre la actividad de la enzima amilasa de la saliva. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Vaso do 50 ml. Infernilla. Termostato (37 °C). Vaso con hielo. Reactivos. Saliva diluida (se enjuaga la boca con agua destilada y luego, al tomar en la boca de 20 a 25 ml de agua, la colectan en un vasito). Cloruro sódico, disolución al 0.3%. Almidón, disolución al 1% en disolución do cloruro sódico al 0,3%. Reactivo do Lugol. Marcha de los trabajos. En tres tubos de ensayo se vierten de 2 a 3 ml de saliva diluida (amilasa) en cada uno; La saliva en el tubo de ensayo 1 se hierve durante 1 min. Luego en todos los tubos de ensayo se añaden 4 ml de disolución



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de almidón. Los tubos de ensayo 1 y 2 si colocan en el termostato (37 DC), donde se mantienen 10 mín. El tubo de ensayo 3 se sumerge en hielo y se tiene durante 10 min. Al transcurrir este tiempo, en el tubo de ensayo se añade 1 gota de reactivo de Lugo. Los resultados del experimento se anotan en la tabla de lab] térmica de las enzimas y se sacan conclusiones: Número del tubo de ensayo

1 2 3

Enzima

Amilas a Amilasa Amilas a

Condiciones del experimento

Sustrato

nz ma desnaturalizada Enzima nativa Enzima

Almid ón Almidó n Almidó

Incubación;

Coloracion con iodo

10 miB, 37°€ la min, 37°C-10 min, 0°C

Conclusiones:

4.2 Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas Para cada enzima existe un óptimo del pH a que crean las condiciones más favorables para el mantenimienato de la conformación funcionalmente activa de la molécula. Los grupos amino y carboxilo de los restos de aminoácidos ionizados a una magnitud de pH determinada, participan en el mantenimiento de la conformación de la molécula proteínica necesaria para la formación de los centros catalíticos de enzima y favorecen también a su ligación con el sustrato. A una magnitud de pH distinta se altera la ionización de los grupos correspondientes, y como resultado sse rompen los enlaces que aseguran la formación de los centro catalíticos, y la enzima se inactiva. A los valores de pH muy altos o muy bajos las enzimas se desnaturalizan.

Principio del método. Se investiga la actividad de la amilasa de la saliva a diferentes magnitudes de pH del medio. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Pipetas. Termostato (37 °C). Reactivos. Forsfato sódico disustituido, disolución 0.2 M (A). Acido cítrico (C eH8O7H2O), disolución 0.1 M (B). Disoluciones amortiguadoras (pH 5.0; se mezclan 515 ml de disolución A con 485 ml de disolución B; pH 6.8: se mezclan 772.5 ml de disolución A con



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227.5 ml de disolución B; pH 8.0, se mezclan 972.5 mi de disolución A con 27.5 ml de disolución B). Saliva diluida. Almidón, disolución al 1%. Reactivo de Lugol.

Marcha de los trabajos. En tres tubos de ensayo se vierten de 2 a 3 ml de disoluciones amortiguadoras de distintos pH (5.0; 6.8; 8.0). En todos los tubos de ensayo se añaden de 2 a 3 ml de saliva diluida (amilasa) y de 4 a 5 ml de disolución de almidón, se mezcla y se incuba durante 10 min en el termostato (37°C). Luego, en cada tubo de ensayo se añade 1 gota de reactivo de Lugol. Los resultados de la observación se anotan en una tabla que indica la influencia del pH sobre la ac tivi da d de la amilasa de la saliva: N mero de tubo

Enzima

pH e medio

Sustrato

Incubació n

o orac n con iodo

de ensayo 1

Amilasa

5,0

Almidó

10

min

37° C

2 3

Amilasa

68 8,0

Almidó

1 10

min

37° C 37° C

Conclusiones:

4.3 Especificidad de las enzimas Las enzimas se distinguen

de los catalizadores inorgánicos por su especificidad excepcionalmente alta. La etapa inicial del acto catalítico consiste en la formación del complejo enzima-sustrato, es decir, la ligación del sustrato con el centro catalítico de la enzima. La conformación espacial del centro de sustrato debe estar en la correspondencia geométrica exacta con la estructura de la molécula de sustrato. Solamente en este caso es posible la formación del complejo enzima-sustrato y el cumplimiento de la función catalítica de la enzima. Do tal modo, la esencia de la especificidad de enzimas consiste en el hecho de que el sustrato le corresponde a la enzima, como una llave a cerradura.

Principio del método. Se investiga la influencia de enzimas amilasa y sacarasa sobre diferentes sustratos: el almidón y la sacarosa. Instrumentos. Soporte con tubos de ensayo. Pipetas. Termos (37 °C). Infemilla. Reactivos. Almidón, disolución al 1%. Sacarosa, disolucion al 2%. Saliva diluida. Sacarasa, disolución (10 g levadura se homogeneiza en 100 ml de agua). Reactivo de Lugol. Reactivo de Fehling.



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Marcha de los trabajos. En los tubos de ensayo 1 y 2 vierten de 4 a 5 ml de disolución de almidón, en tubos ensayo 3 y 4, de 4 a 5 ml de disolución de sacarosa. En tubos de ensayo 1 y 3 se añaden de 2 a 3 ml de saliva diluída (amilasa), y en los tubos de ensayo 2 y 4, de 2 a 3 ml de disolución de sacarasa. El contenido de los tubos de ensayo mezcla y se incuba durante 10 min en el termostato (37°( Luego en los tubos de ensayo 1 y 2 se añade 1 gota de reactivo de Lugol, en cada una y en los tubos de ensayo 3 y 4, de 1 a 2 ml de reactivo de Fehling y se calienta. Las observación se anotan en la tabla de especificidad de las enzimas amila y sacarasa: Número del tubo de ensayo

1 2 3

Enzima

Amilas a Amilasa Amilas a

Condiciones del experimento

Sustrato

Enzima desnaturalizada Enzima nativa Enzima

Almid ón Almidó n Almidó

Incubación;

Coloracion con yodo

10 miB, 37°€ la min, 37°C-10 min, 0°C

Conclusiones:

4.4 Influencia de los activadores e inhibidores La regulación de la actividad de las enzimas se realiza tanto en la célula como fuera de ella, mediante la fijación sobre la molécula de enzima de una serie de sustancias d bajo peso molecular. Tales sustancias pueden causar efecto

Determinación de la actividad de las enzimas Según la clasificación elaborada por la Comisión Internacional de Enzimas, todas las enzimas se subdividen en seis clases principales en correspondencia con el carácter de la reacción catalizada por ellas: oxidorreductasas, trans-ferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas (sintetasas).

Oxidorreductasas Las oxidorreductasas son una clase de enzimas que catalizan las reacciones de oxidación-reducción.



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4.5 Determinación de la actividad de la dehidrogenasa de ácido succínico La dehidrogenasa de ácido succínico (succinato dehidrogenasa) es una enzima que cataliza la oxidación del ácido succínico. De coenzima sirve el dinucleótido de flavina-adenina (FAD). En las células la enzima está unida establemente con la membrana de mitocondrias. La enzima redunda devuelve fácilmente el hidrógeno cuyo aceptor pueden ser los colorantes aptos para la reducción.

Principio del método. El hidrógeno que se desprende del ácido succínico bajo la influencia de la enzima dehidro-fenasa, reduce el azul de metileno (AM) transformándolo en un compuesto incoloro (AMH 2).

Instrumentos. Mortero con machaca. Arena de vidrio. Soporte con tubos de ensayo.

Pipetas. Baño de María (50 °C). Termómetro. Reactivos. Músculo fresco (desmenuzado en picadora de carne). Hidróxido sódico,

disolución al 10%. Acido succínico, disolución al 3% (3 g de ácido succínico se disuelven en 97 ml de agua y se neutraliza con disolución de hidróxido sódico al 10% hasta el pH 7.4 según el papel indicador). Azul de metileno, disolución acuosa al 0.001%. Aceite de vaselina o vegetal. Acido tricloroacético, disolución al 20%.

Marcha de los trabajos. En el mortero se tritura cuidadosamente, con la arena de vidrio, aproximadamente 1 g de tejido de músculo desmenuzado, añadiendo de 3 a 4 ml de disolución de ácido succínico. La masa homogeneizada obtenida se reparte en dos porciones iguales que se ponen en dos tubos de



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ensayo. En el tubo de ensayo 1 (de control) se añade 1 ml de disolución de ácido tricloroacético para destruir la enzima. En el tubo de ensayo 2 (experimental) la enzima es activa. En ambos tubos de ensayo se añade 1 ó 2 gotas de disolución de azul de metileno, se mezcla, y sobre la superficie de líquido se vierte de 0.5 a 1 ml de aceite para aislar del oxígeno de aire. Ambos tubos de ensayo se incuban en el baño maría (50°C) durante 10 min. Al pasar este tiempo, en el tubo de ensayo 2 se observa la descoloración del azul de metileno.


BIBLIOGRAFIA BIOQUIMICA H.R. HORTON et al DE. PRENTICE HALL HISPANOAMERICANA, S.A. 1993 BIOQUIMICA. J. DAVID RAWN AD. INTERAMERICANA Mc. GRAW - HILL 1989 BIOQUIMICA LUBERT STRYER AD. REVERTE, S.A. 3a. DE. EN ESPAÑOL 1993 BIOQUIMICA DE HARPER ROBERT K MURRAY AD. MANUAL MODERNO, S.A. DE C.V. 1994 BIOQUIMICA: LAS BASES MOLECULARES DE LA ESTRUCTURA Y FUNCION CELULAR. ALBERT LEHNINGER EDICIONES OMEGA, S.A. 7a. REIMPRESION 1983 PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY ALBERT LEHNINGER AD. WORTH PUBLISHERS, INC. 1980.


ANEXOS NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD E HIGIENE 1. El uso de bata es obligatorio. 2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos de seguridad disponibles. 3.

Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como conocer la localización exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.

4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se esté en el laboratorio. 5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las salpicaduras de productos químicos o sus vapores pueden pasar detrás de las lentes y provocar lesiones en los ojos antes de poder retirar las lentes. En estos casos es recomendable el uso de gafas graduadas o de gafas de seguridad cerradas.

6. Sí un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción. Actúa siempre con urgencia, en menos de 10 segundos. No dirijas una corriente de alta presión de agua de un grifo directamente al ojo porque podrías lesionarlo. Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es necesario pide asistencia médica. 7. El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos químicos son inevitables. 8. Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias. 9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los alimentos o bebidas se hayan contaminado con productos químicos.



Seguridad…

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10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservación de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios. 11. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir del laboratorio. 12. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio. 13. Está prohibido fumar en el laboratorio por razones higiénicas y de seguridad. 14. No inhales, pruebes o huelas productos químicos si no estás debidamente informado. 15. Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de utilizarlos. 16. Para pipetear los líquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, no absorber directamente con la boca. 17. Cuando caliente tubos de ensaye hágalo siempre en la parte superior del líquido y con agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y no apuntar hacia ninguna persona. 18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro del laboratorio. Sí tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales deben ser siempre transportadas cogiéndolas por el fondo, nunca por la boca de la botella. 19. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros, abrigos, bolsas, productos químicos vertidos. 20. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar, etc. 21. No se puede hacer ningún experimento no autorizado. 22. No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. 23. No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes. 24. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto estado de uso. 25. Todos los productos químicos tienen que ser manejados con mucho cuidado de acuerdo con las Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias.



Seguridad…

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26. No inhales los vapores de productos químicos y trabaja siempre en vitrinas extractoras, especialmente cuando manipules productos tóxicos, irritantes, corrosivos o lacrimógenos.

MEDIDAS GENERALES EN CASO DE ACCIDENTE PLAN GENERAL DE EMERGENCIA: •

Dar la alarma.

•

Ponerse a salvo.

•

Ayudar a las personas.

•

Luchar contra el fuego.

•

Avisar al responsable del departamento.

•

Evacuación del edificio en caso necesario.

•

Avisar a ambulancias, bomberos.

FUEGO EN EL LABORATORIO:


Manual del laboratorio de Bioquimica •

Seguridad…

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Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por la salida principal o por la salida de emergencia, sí la principal está bloqueada.

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Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y conservando siempre la calma.

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Sí el fuego es pequeño y localizado, apagarlo utilizando un extintor adecuado, arena o cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue.

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Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un disolvente.

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Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, sí el fuego no se puede controlar rápidamente accionar la alarma de fuego, avisar al servicio de extinción de incendios y evacuar el edificio.

FUEGO EN EL CUERPO: •

Sí se te incendia la ropa, pide inmediatamente ayuda.

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Estírate en el suelo y rueda sobre ti mismo para apagar las llamas.

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No corras ni intentes llegar a la ducha de seguridad si no es que está muy cerca de ti.

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Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se está quemando, cúbrele con una manta antifuego, condúcele hasta la ducha de seguridad, si está cerca, hazle rodar por el suelo, no utilices nunca un extintor sobre una persona.

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Una vez apagado el fuego, mantén a la persona tendida, procurando que no coja frío y proporciónale asistencia médica.

QUEMADURAS: •

Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se tratarán lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.

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Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata.

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No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves.



Seguridad…

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CORTES: •

Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el laboratorio.

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Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como mínimo.

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Sí la cortada es pequeña y deja de sangrar en poco tiempo, lávala con agua y jabón y tápala con una venda.

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Sí la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia médica inmediata.

DERRAME DE PRODUCTOS QUÍMICOS SOBRE LA PIEL: •

Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15 minutos.

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Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en una pila.

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Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo antes posible mientras esté bajo la ducha.

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Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensión de la herida.

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Proporcionar asistencia médica a la persona afectada.

CORROSIONES EN LA PIEL POR ÁCIDOS Y ÁLCALIS: •

Cuando ocurre una corrosión por ácidos, corta lo más rápidamente posible la ropa, lave con agua abundantemente la zona afectada, neutralice la acidez con bicarbonato de sodio durante 15-20 minutos, sacar el exceso de pasta formada, seca y cubra la parte afectada con linimento óleo-calcáreo o parecido.


Manual Pract Bioquimica

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