Manual de Laboratorio de Biología Para Ingenieros[94]

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA PARA INGENIEROS

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BIOLOGÍA PARA INGENIEROS MEDELLÍN 2017

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA Facultad de Ingeniería Departamento de Ingeniería Química

LABORATORIO DE BIOLOGÍA PARA INGENIEROS

ÍNDICE

1.

Normas generales y de bioseguridad en el laboratorio.

2.

Identificación de matrices con presencia de macromoléculas.

3.

Manejo de materiales y equipos de laboratorio.

4.

Determinación de aminoácidos y proteínas.

5.

Actividad catalítica de la α-amilasa y variables que la afectan.

6.

Determinación de algunas propiedades y aplicaciones industriales del almidón.

7.

Transesterificación para producción de biodiesel.

8.

Aislamiento de microorganismos con aplicaciones en la ingeniería química

9.

Caracterización macro y microscópica de los microorganismos

10.

Preparación de medios de cultivo específicos

11.

Determinación de cinética de crecimiento y capacidad metabólica de microorganismos

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ÍNDICE

1.

Normas generales y de bioseguridad en el laboratorio.

2.

Identificación de matrices con presencia de macromoléculas.

3.

Manejo de materiales y equipos de laboratorio.

4.

Determinación de aminoácidos y proteínas.

5.

Actividad catalítica de la α-amilasa y variables que la afectan.

6.

Determinación de algunas propiedades y aplicaciones industriales del almidón.

7.

Transesterificación para producción de biodiesel.

8.

Aislamiento de microorganismos con aplicaciones en la ingeniería química

9.

Caracterización macro y microscópica de los microorganismos

10.

Preparación de medios de cultivo específicos

11.

Determinación de cinética de crecimiento y capacidad metabólica de microorganismos

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1.

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO E IDENTIFICACIÓN DE MATRICES CON PRESENCIA DE MACROMOLÉCULAS.

NORMAS GENERALES EN EL LABORATORIO a. Llegar puntualmente. Todas las prácticas están programadas para ser realizadas en el tiempo previsto. b. Llevar las guía de la práctica a realizar, esta debe ser leída con anticipación. c. Tenga en cuenta las instrucciones dadas en cada sesión. El profesor puede preguntar cualquier información que esté contenida en ellas. d. No es permitido el uso de radios, walkman, celulares o equipos puedan interrumpir el desarrollo de la práctica. e. Es prudente usar pantalón largo y evitar las faldas y pantalonetas. f. Usar zapatos cerrados adelante, evitar sandalias o calzado similar. g. No es permitido el ingreso al laboratorio de personas diferentes a los matriculados en el curso. h. Desarrollar las actividades con calma, tome el tiempo necesario para hacer los distintos procedimientos para que los resultados sean buenos. bue nos. i. Analice los resultados obtenidos durante la práctica. Confíe en sus propias observaciones. j. Está prohibido fumar dentro del laboratorio. k. Utilícelos reactivos adecuados en cantidades y concentraciones indicadas. No desperdicie el material. l. El material de trabajo es propiedad dela universidad y debe ser devuelto en buenas condiciones y limpios. Usted es responsable y debe reponer y pagar todo el material que sea dañado o extraviado. m. La limpieza, el cuidado al trabajar, el empleo correcto de las técnicas enseñadas y el interés son factores que contribuyen al éxito de la práctica. n. No emplee material sucio o contaminado para extraer reactivos de los recipientes. o. No se retire del laboratorio sin justificación. p. Dejar los puestos de trabajo limpios después de terminar la práctica.

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD La bioseguridad, se define como el conjunto de medidas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo en el laboratorio procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la salud y seguridad de estudiantes, docentes, monitores y el medio ambiente (Forero (Forero de Saade, 1997).

a. Evitar contacto de piel o mucosas con líquidos. b. Lavado de manos al inicio de la sesión y al finalizar la misma para remover todo tipo de contaminante químico y/o biológico. c. Usar guantes si es necesario o se sugiere por el instructor d. Usar la mascarilla si se recomienda. e. Usar la bata cerrada durante toda la práctica para evitar contacto de la ropa con los reactivos y microorganismos usados durante la sesión. a limentos (chicles, bebidas, frutas, entre otros) durante d urante el f. No es permitido el consumo de alimentos desarrollo de la práctica. g. El cabello debe estar recogido. h. No usar gorros que no sean apropiados para la práctica. i. Si hay derrame de alguna sustancia química, el sitio debe ser limpiado inmediatamente, para evitar que de forma accidental accide ntal otra persona pueda tocarla. j. Si alguna sustancia química entra en contacto con la piel, ojos, lavar Con agua durante unos minutos. Nota: En caso de accidentes consulte con el instructor o docente encargado. k. Tenga un uso adecuado de los residuos generados durante la práctica. Si tiene dudas pregunte al docente o al monitor encargado.

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2.

IDENTIFICACIÓN DE MATRICES CON PRESENCIA DE MACROMOLÉCULAS

OBJETIVO Identificar cual(es) macromolécula(s) se encuentran en cada una de las matrices mostradas.

PREGUNTAS I. II. III.

¿Qué es una macromolécula? ¿Cuáles son los tipos de macromoléculas? ¿Dónde se pueden encontrar las macromoléculas?

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3.

MANEJO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO

OBJETIVOS 





Conocer y/o familiarizarse con los diferentes equipos de laboratorio, a través del desarrollo de actividades que involucren manejo de material de vidriería (probetas, erlenmeyers, pipetas, etc.) y equipos de laboratorio (balanzas analíticas, pH metro, espectrofotómetro, micropipetas, filtros). Realizar la medición de biomasa por medio de las técnicas de peso seco y turbidimetría (absorbancia). Realizar la determinación de azúcares reductores por el método espectrofotométrico del DNS.

MARCO TEÓRICO Para lograr resultados confiables en el laboratorio, es indispensable conocer tanto el funcionamiento de los instrumentos y los equipos de laboratorio, como los principios teóricos que los rigen. Durante el desarrollo de esta práctica se construirán dos curvas de calibración para las cuales se utilizarán micro pipetas, balones volumétricos, balanzas analíticas, espectrofotómetro, baño maría, entre otros. A continuación se describen algunos aspectos generales relacionados con la práctica: Micropipeta: Es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir

pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas científicas. Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20, 200 y 1000 μl, respectivamente. Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos

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líquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plástico, que habitualmente son estériles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las amarillas para pipetear volúmenes pequeños (por ejemplo, 10 μl), y las azules para pipetear volúmenes grandes (por ejemplo, 800 μl).

Tipos: Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un botón en su parte superior que está conectado a un sistema analógico de confirmación de volumen, y automáticas, en las cuales dicho sistema es digital. Hay micropipetas simples, que sólo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar múltiples puntas (por ejemplo, ocho), absorbiendo el mismo volumen en todas ellas. Operación del Equipo a. Se presiona el botón superior suavemente hasta el primer tope. b. Se sumerge la punta, en la solución que se necesita pipetear estando seguros que la punta este bien colocada y que no haya ningún tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la pipeta. c. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solución, soltando el botón suavemente. d. Para descartar la solución de la punta presione el botón hasta el segundo tope. e. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas, ver figura 3 (Micropipetas).

Figura 6. Micropipeta uso y partes Espectrofotometría: La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite

determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Para cuantificar la absorbancia se puede usarla ley de Lambert-Beer, esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:

 =  () =  ·  ·

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La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración, a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución, a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y por último, depende de ε, una constante

de proporcionalidad, denominada coeficiente de extinción, que es específica de cada cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l. La

segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre q ue sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en términos de unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por

desconocerse el peso molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de extinción específico (εs). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas. La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros constan de:

1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno. 2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de difracción. 3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV. 4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales eléctricas. 5. Un registrador o sistema de lectura de datos. Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de ésta. (Ver figura 4) (Abril, Bárcena, Fernández, Galván, Jorrín, Peinado, Meléndez &Túnez).

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Figura 7. Funcionamiento de espectrofotómetro Turbidimetría: La turbidimetría es un campo analítico relacionado con la colorimetría,

tanto en el aspecto teórico como experimental. La turbidimetría determina la cantidad de luz no dispersada, el fundamento de esta técnica es la dispersión de la luz por partículas no transparentes suspendidas en un líquido, como por ejemplo, precipitado y suspensiones coloidales. Cuando se utiliza esta técnica con fines cualitativos se suelen construir curvas de calibrado con muestras de concentraciones conocida. Estas muestras (precipitados o suspensiones) deben prepararse bajo condiciones rigurosamente controladas ya que la cantidad de luz dispersada depende no solo de la concentración sino también del tamaño y número de partículas implicadas. Para que la luz dispersada pueda utilizarse comparativamente es necesario que tanto el número de partículas como su tamaño sean del mismo orden. Además, la longitud de onda de luz que es dispersada más eficazmente depende también del tamaño de las partículas. Bajo condiciones controladas, se puede lograr que el tamaño de partícula en la suspensión sea reproducible y en consecuencia que esta técnica sea de aplicación analítica. Las aplicaciones de la turbidimetría son muy variadas, algunos sistemas son turbios al llegar al laboratorio analítico, como en el análisis de los materiales de suspensión en las aguas. En la industria se utiliza en la medición de la transparencia de bebidas y productos farmacéuticos. (Merino, 1996)

MATERIALES    

Micropipeta de 1000µL Micropipeta de 200µL Micropipeta de 100µL Baño termostático

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        

Vórtex. Espectrofotómetro Baño de hielo Tubos tapa rosca Gradillas Balones volumétricos de 100 ml Glucosa DNS Solución madre de levadura.

PROCEDIMIENTO Elaboración de la curva estándar de glucosa Preparar una solución madre de glucosa a 0.5g/L en un balón de 100 ml. Hacer las siguientes diluciones en tubos de ensayo usando las micropipetas.  

Solución Blanco 1 2 3 4 5 

 





 



Concentración (g/L)

Volumen de solución madre (µL) 0 125 250 500 750 1000

Volumen de agua destilada (µ L) 1000 875 750 500 250 0

Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 1000 µL de DNS, incluyendo al blanco. Tapar cada tubo para evitar pérdidas de muestra por evaporación. En el caso de no poder trabajar inmediatamente con las soluciones, guardar todos los tubos en un lugar oscuro para evitar que el DNS comience a reaccionar. Llevar todas las soluciones al baño termostático a una temperatura de 80-90°C durante 5 minutos. Pasados los 5 minutos exactos, llevar las soluciones a un baño de hielo durante 5 minutos o hasta el momento que se vaya a realizar las lecturas de las absorbancias. Leer las absorbancias de las soluciones a 540 nm. Realizar una curva de calibración de concentración de glucosa en g/L versus absorbancia. Hacer un ajuste lineal de los datos.

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Cuantificación de biomasa por el método del peso seco 

A partir de la solución madre de levadura, adicionar los siguientes volúmenes en balones volumétricos aforados de 25 ml Solución 1 2 3 4 5

          

Volumen de solución madre (mL) 20 16 12 8 4

Secar los filtros en estufa por 10 minutos a 90-100 °C. Dejar enfriar. Pesar en balanza analítica (usar siempre la misma). Filtrar 15 ml de la solución preparada. Llevar a estufa el filtro durante 30 minutos. Enfriaren desecador. Pesar nuevamente el filtro. Determinar la concentración en g/L. Tomar una muestra de 1 ml de solución y depositarla en una celda. Leer absorbancia en el espectrofotómetro a 600 nm. Hacer una curva de calibración de absorbancia versus concentración de levadura (g/L).

Nota: Recuerde que las soluciones deben estar homogéneas en los momentos de hacer diluciones y hacer las lecturas de absorbancias. Los filtros nunca deben ser tocados directamente, use siempre pinzas dispuestas en el laboratorio. 



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4.

DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

OBJETIVO Reconocer la presencia de algunos aminoácidos en las proteínas, a través de reacciones específicas que permiten su identificación.

MARCO TEÓRICO Proteínas

Las proteínas son los materiales que desempeñan un mayor número de funciones en las células de todos los seres vivos. Por un lado, forman parte de la estructura básica de los tejidos (músculos, tendones, piel, uñas, etc.) y, por otro, desempeñan funciones metabólicas y reguladoras (asimilación de nutrientes, transporte de oxígeno y de grasas en la sangre, inactivación de materiales tóxicos o peligrosos, etc.). También son los elementos que definen la identidad de cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del código genético (ADN) y de los sistemas de reconocimiento de organismos extraños en el sistema inmunitario. Aminoácidos

Son macromoléculas orgánicas, constituidas básicamente por carbono (C), hidrógeno (H), oxígeno (O) y nitrógeno (N); aunque pueden contener también azufre (S) y fósforo (P) y, en menor proporción, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I), entre otros. Se clasifican, de forma general, en holoproteínas y heteroproteínas según estén formadas respectivamente sólo por aminoácidos o bien por aminoácidos más otras moléculas o elementos adicionales no aminoacídicos (Proteínas).

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Reacciones características de los aminoácidos y proteínas. 







Prueba Biuret : Es una prueba general para proteínas, no especifica. Cuando una proteína reacciona con sulfato de cobre (II) (color azul) se forma como respuesta positiva un complejo color violeta. La prueba Biuret trabaja para cualquier tipo de compuesto que posea uno o más de los grupos siguientes:

Prueba de Ninhidrina: Es positiva para aminoácidos y proteínas que tengan un grupo NH2 libre. Cuando el grupo -NH2 reacciona con ninhidrina, se forma un complejo azulvioleta. Prueba Xantoprotéica: Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser nitrados produciendo un compuesto amarillo. La producción de un producto coloreado amarillo al añadir ácido nítrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptófano en una proteína. La adición de base fuerte hace que el color se torne más oscuro hacia anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por ácido nítrico son el resultado de la reacción Xantoprotéica. Prueba para metales pesados: Los metales pesados tienen el efecto de precipitar proteínas de sus soluciones creando enlaces (cross-linkings) entre los grupos amino libres y los grupos carboxilo libres. Los iones más comúnmente usados para detector la presencia de proteínas incluyen Zn 2+, Fe 3+ , Cu 2+ , Sb 3+ , Ag 1+ , Cd 2+ y Pb 2+

Entre los metales, Hg 2+, Cd 2+, y Pb 2+ tienen una alta toxicidad. Estos pueden causar serios daños a las proteínas (especialmente enzimas) desnaturalizándolas. Victimas que han ingerido iones de mercurio o plomo se tratan con un antídoto de algún alimento rico en proteínas. La proteína se combina con los iones de mercurio y plomo minimizando la absorción de tales iones. Los alimentos más usados son leche y clara cruda de huevo. La proteína que se precipita es removida inmediatamente del estómago mediante un lavado estomacal (Alices. 2009). 

Prueba Hopkins Cole: Es específica del grupo indol característico del Triptófano. El anillo del indol se hace reaccionar con ácido Glioxálico en presencia de ácido Sulfúrico concentrado para formar un compuesto violeta que se forma en la interfase entre la solución de proteína y el ácido sulfúrico. La reacción de Hopkins Cole es positiva sólo para las proteínas que contienen Triptófano. Se supone que el ácido concentrado hidroliza las proteínas en la interfase liberando el Triptófano para dar el producto violeta. Sin embargo, el Triptófano puro en solución no da positiva la reacción, a menos que se agreguen agentes oxidantes, por lo que es de suponer que el Triptófano de las

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



proteínas no se libera como tal, por lo cual la reacción presentada es sólo parcialmente correcta. Prueba para aminoácidos azufrados: Esta reacción detecta la cisteína y metionina y proteínas que la contengan. En medio fuertemente alcalino el radical mercapto de la cisteína metionina se desprenden como ácido sulfhídrico que se pone en evidencia añadiendo sales de plomo para que se forme de un precipitado negro de sulfuro de plomo (Ordorica & Velázquez. 2012). Desnaturalización: Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija. La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:  Cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión.  Una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie.  Pérdida de las propiedades biológicas (Desnaturalización).

MATERIALES       

Leche Harina de trigo Huevo Gelatina sin sabor Tubos de ensayo Baño termostático. Ácido nítrico concentrado

     

Hidróxido de sodio al 25% Hidróxido de sodio al 50% Sulfato de cobre al 1% Acetato de plomo al 2% Ácido clorhídrico concentrado Etanol

PROCEDIMIENTO Preparar las siguientes soluciones: Solución de albúmina 30% v/v. Solución de harina de trigo 1% v/v. Solución de gelatina sin sabor 3%p/v.   

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Reacción Xantoprotéica

Tubo 1 2 3 4    

Solución Albúmina Leche Harina de trigo Gelatina sin sabor

Cantidad (mL) 2 2 2 2

A cada uno de los tubos adicione 5 gotas de ácido nítrico concentrado. Caliéntelos al baño maría hasta cambio de coloración. Alcalinice la mezcla adicionando gota a gota de hidróxido de sodio al 25%. Observe y anote los resultados.

Prueba de los aminoácidos azufrados

Tubo 1 2 3 4    



A cada tubo adicione 3 gotas de hidróxido de sodio al 25%. Agregue 5 gotas de acetato de plomo al 2%. Caliéntelos al baño maría por 10 min. Observe y anote los resultados.

Prueba de Biuret

Tubo 1 2 3 4   



A cada tubo adicione 5 gotas de hidróxido de sodio al 25% Adicione 5 gotas de sulfato cúprico al 1%. Observe y anote los resultados.

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Desnaturalización

Tubo

Solución

Cantidad

1

Albúmina

10 gotas

2 3 4

Albúmina Albúmina Albúmina

10 gotas 10 gotas 10 gotas

Procedimiento Calentar gradualmente y observe temperatura de coagulación 20 gotas de etanol 5 gotas de HCl concentrado 5 gotas de hidróxido de sodio al 50%

Agite los tubos y observe si se produce coagulación. Para todas las reacciones anteriores, reporte los datos y observaciones en la siguiente tabla:

Reacción

Leche

Albúmina

Harina

Xantoprotéica

Aminoácido azufrados

Biuret

Desnaturalización

Conclusiones

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PREGUNTAS I. II. III. IV. V.

¿Qué es un péptido? ¿Qué es un enlace peptídico? ¿Cuál es la estructura de una proteína? ¿Cuáles son las reacciones de cada una de las pruebas realizadas en el laboratorio? ¿Existen otras pruebas cualitativas y/o cuantitativas diferentes para la identificación de aminoácidos en proteínas? ¿Cuáles?

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5.

ACTIVIDAD CATALÍTICA DE LA Α -AMILASA Y VARIABLES QUE LA

AFECTAN

Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: Una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. Las enzimas son un ejemplo de que no sólo es importante lo que comemos sino que además es indispensable una buena capacidad de absorber esos nutrientes.

OBJETIVOS  



Experimentar sobre diferentes aspectos de la actividad enzimática. Comprender la forma como diversos factores influyen sobre la actividad catalítica de las enzimas. Evaluar la dependencia que puede presentar una reacción enzimática con respecto a la acidez del medio y a la temperatura.

MARCO TEÓRICO Constituye la forma más generalizada, aunque no la única, de reserva energética en vegetales. Se almacena en forma de gránulos, y puede llegar a constituir hasta el 70% del peso de granos (maíz y trigo) o de tubérculos (patata). El análisis minucioso de la estructura del almidón demuestra que es una mezcla de otros dos polisacáridos: la amilosa y la amilopectina. La proporción de ambos polisacáridos varía según la procedencia del almidón, pero por lo general, la amilopectina es la más abundante. Los almidones constituyen la principal fuente de nutrición glicídica para la humanidad. El almidón puede ser degradado por muchas enzimas. En los mamíferos, estas enzimas se llaman amilasas, y se producen sobre todo en las glándulas salivares y en el páncreas. La amilosa es un polímero lineal formado por unidades de α-D-glucopiranosa, unidas exclusivamente por enlaces (1α-4). El número de monómeros de la molécula depende de la

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procedencia del almidón: alrededor de 1000 en el caso de la papa y 4000 en el caso del trigo. La amilosa se disuelve fácilmente en agua, adquiriendo una estructura secundaria característica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de la hélice comprende 6 unidades de glucosa. La amilopectina tiene un peso molecular mucho mayor que la amilosa y puede contener cientos de miles o millones de monómeros de α-D-glucopiranosa. Es un polímero ramificado, en el que las cadenas principales están formadas por mosacáridos unidos mediante enlaces glucosídicos (1α-4) y donde cada rama se une a la cadena principal mediante enlaces glucosídicos (1α-6). Estas ramificaciones están regularmente espaciadas (cada 25-30 residuos de glucosa) y cada rama contiene únicamente uniones (1α-4) (Almidón). Termamyl 120L es un producto enzimático líquido que contiene α-amilasa sobresaliente

termoestable expresada en y producida mediante una cepa genéticamente modificada de Bacilluslicheniformis . Se utiliza en las industrias de: Almidón: Licuefacción continúa del almidón en cocedores a presión o en equipos que operan a similar temperatura. Alcohol: Adelgazamiento del almidón en los macerados de la destilación. Cervecería: Licuefacción del almidón. Azúcar: Rompimiento del almidón presente en el jugo de caña. Por lo que el contenido de almidón en el azúcar crudo se reduce y la filtración en la refinería se facilita. La enzima es una endoamilasa que hidroliza las uniones 1,4α-glucosídicas de la amilosa y amilopectina. Por lo que el almidón se rompe rápidamente en dextrinas solubles y oligosacáridos (Termamyl 120L). Los pasos para transformar el almidón en jarabe glucosado son dos: licuefacción, y sacarificación. Durante el proceso de licuefacción se obtienen malto dextrinas empleando la enzima alfa amilasa. Estas malto dextrinas contienen diferentes oligosacáridos y dextrinas y es ligeramente dulce. Luego se puede continuar la conversión a glucosa usando la enzima amiloglucosidasa conocida también como glucoamilasa. Esta última etapa se conoce como sacarificación, donde la amiloglucosidasa puede transformar las malto dextrinas casi completamente en glucosa; en la práctica se produce también un poco de maltosa (Cruz, 2012). 

  

MATERIALES    

Almidón soluble. DNS Lugol Soluciones Buffer 0.1 M  Citrato con pH:3.5  Fosfato con pH:6.3  Fosfato con pH:9

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PROCEDIMIENTO 1. Preparar las siguientes soluciones:    

2. 

25 ml de Almidón al 0.5% m/v en buffer citrato pH 3.5 25 ml de Almidón al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 9 50 ml de Almidón al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 6.3 50 ml de enzima diluida 1:150 (Preparada por el monitor) Evaluación del cambio del pH sobre la actividad de la enzima amilasa Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2,5 mL de la solución de almidón, de acuerdo a la siguiente tabla: Número de tubo 1 2 3 4 5 6

        

3.  

pH 3,5 6,3 9 3,5 6,3 9

Llevar los tubos de ensayo por 3 minutos a baño de 90oC para temperar. Agregar 0.5 mL de la enzima diluida a los tubos a los 1,2 y 3. Agregar 0.5 mL agua destilada a los tubos a los 4, 5 y 6. Agitar y dejar los 6 tubos en el baño de 90 oC por 30 minutos. Agregar 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos, para parar la reacción. Tomar 0,5 mL de cada uno de los tubos y agregar 30µL de lugol. Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio. Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores. Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la del DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6. Evaluación del cambio de temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa. Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2.5ml de la solución de almidón de pH 6.3. Temperar cada uno de los tubos por 3 minutos así: Número de tubo 1 2 3 4

°C 25 60 90 25

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5 6        

60 90

Agregar 0.5ml de la enzima diluida a los tubos 1, 2, y 3. Agregar 0.5 mL agua destilada a los tubos a los 4, 5 y 6. Agitar y llevar cada tuvo nuevamente a la temperatura correspondiente por 30 minutos. Parar la reacción agregando 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos. Tomar 0,5 mL cada uno de los tubos y agregar 30µL de lugol. Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio. Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores. Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la del DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6.

Nota: La actividad enzimática será reportada como µmol de azucares formados por litro de solución por minuto por cantidad de enzima. Procedimiento para determinar el porcentaje de azúcares reductores utilizando DNS

a. b. c. d. e.

Tomar 1 ml de solución problema. Adicionar 1 ml de reactivo DNS. Tapar los tubos con papel para film y ponerlos en baño a ebullición por 5 minutos. Pasar los tubos a un baño de hielo, dejarlo por 5 minutos. Leer absorbancia de todas las soluciones a 540 nm.

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6.

DETERMINACIÓN DE ALGUNAS PROPIEDADES DEL ALMIDÓN Y POSIBLES APLICACIONES INDUSTRIALES

OBJETIVOS 



Determinar propiedades del almidón tales como el punto de gelatinización e índice de hinchamiento. Evaluar la aplicabilidad del almidón en la elaboración de pegantes y adhesivos.

MARCO TEÓRICO Los gránulos de almidón, que se producen en las plantas a partir de la fotosíntesis de dióxido de carbono, están formados por polímeros de glucosa y sirven como reservas de energía. Hacia el final de la temporada de cultivo, el almidón se acumula en las ramas de los árboles, cerca de las yemas. También se encuentra en frutas, semillas, rizomas y tubérculos. Los gránulos de almidón son muy adecuados para el almacenamiento a largo plazo, debido a que es un material compacto, la sequedad relativa y alta estabilidad. La transformación del almidón crudo en agua caliente se llama gelatinización: los gránulos se hinchan y estallan, formando una pasta. Durante el almacenamiento prolongado o refrigeración, la pasta de almidón a menudo se espesa debido a un fenómeno llamado retrogradación. Gelatinización y retrogradación, que corresponden a modificaciones estructurales en los gránulos, afectan el comportamiento del almidón que contienen los sistemas. En consecuencia, el almidón es excelente para modificar la textura de muchos procesados y los alimentos cocinados en casa (por ejemplo, como harina de maíz o harina para espesar las salsas) y también ha sido utilizado durante siglos para otros fines, incluida la fabricación de papel, colas o refuerzos de la tela. Hoy en día, las nuevas aplicaciones del almidón son emergentes, incluyendo las fibras de las dietas bajas en calorías, los materiales biodegradables, envases, películas delgadas y materiales termoplásticos. Los gránulos de almidón nativos varían enormemente de forma y de tamaño (desde 0,1 a 200 nm), pero todos tienen una característica común: bajo el microscopio e iluminados con luz polarizada, granos de almidón teñidos con yodo presentan una "cruz de Malta" distintiva lo que indica la existencia de algún orden interno común. Cuando los gránulos se

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calientan en exceso de agua, la “cruz” comienza a desaparecer, lo que demuestra que este

orden molecular se está interrumpido (Almidón: un misterio estructural).

Figura 1. Almidón visto al microscopio. 400x MATERIALES   

Almidón Agua. Lugol

PROCEDIMIENTO Preparar 100 ml de una solución de almidón al 10% p/v, con la cual se realizaran cada uno de los siguientes procedimientos: a) Capacidad de retención del agua.  Pesar un tubo de ensayo vacío  Tomar 10 mL de la solución preparada y agregarlos al tubo.  Pesar nuevamente.  Centrifugar a 3500 rpm por 30 minutos.  Pesar otro tubo limpio y seco.  Pasar el sobrenadante al tubo anterior.  Pesar sistema con el sobrenadante.  Pesar el precipitado.  Calcular la capacidad de retención del agua mediante:

 ó  −    100 %=        b) Determinación y microscopia del punto de gelatinización  Llevar 90 mL de la solución a un beaker.  Calentar con agitación constante midiendo la temperatura periódicamente.  Tomar muestras de la suspensión a las temperaturas de 30, 60, 70 ºC en porta objetos.  Teñir con lugol las muestras tomadas

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LABORATORIO DE BIOLOGÍA PARA INGENIEROS  

Observar cambios en microscopio para cada una de las muestras utilizando un objetivo de 40x. Determinar la temperatura de gelatinización.

c) Aplicación: Evaluación de pegantes. Con el gel formado, realizar los siguientes procedimientos:  Rotulado de botellas.  Agregar gel sobre el papel kraft.  Dejar secar por 1 minuto.  Adherir el papel a una botella.  Dejar secar por 5 minutos (Hacer uso del secador).  Retirar papel.  Sellos de papel.  Esparcir gel sobre una tira de papel kraft.  Dejar secar por 10 minutos (utilizar secador).  Humedecer el papel.  Colocar la tira de papel sobre otro papel seco.  Dejar secar.  Retirar el papel. d) Índice de hinchamiento. Añadir 3 g de almidón en una probeta de 10 mL. Medir el volumen ocupado por el almidón. Agregar agua destilada hasta completar un volumen de 10 mL. NO AGITAR. Dejar reposar. Medir el volumen de almidón cada 10 o 15 minutos hasta observar que no haya variación.      

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7.

TRANSESTERIFICACIÓN PARA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

OBJETIVO 



Producir biodiesel a partir de aceite de palma, mediante una reacción de transesterificación con metanol. Determinar el índice de acidez de algunos aceites mediante la norma NTC por el método con etanol caliente usando indicador.

MARCO TEÓRICO La transesterificación es un término general que se utiliza para designar a las reacciones orgánicas en las cuales se produce un intercambio o sustitución del grupo acilo o alquilo de un éster. Desde una perspectiva más contextualizada, podríamos definir la transesterificación como la reacción mediante la cual, los triglicéridos (TG) presentes en los aceites vegetales y grasas animales se combinan con un alcohol de bajo peso molecular usualmente metanol o etanol en presencia de un catalizador adecuado, para formar glicerina y ésteres metílicos o etílicos. Los alquil ésteres grasos obtenidos a partir de la reacción anterior, poseen propiedades y tamaño similares a los constituyentes del combustible diesel, y es lo que se conoce como biodiesel. Los catalizadores que se suelen utilizar a escala comercial son los catalizadores homogéneos básicos. Se ha reportado que la síntesis de biodiesel catalizada por bases es 4000 veces más rápida que al usar ácidos, pero tiene la desventaja que necesita materias primas refinadas con un contenido de agua menor al 0,5 % p/p y de ácidos grasos menor al 1,0% p/p. Entre las ventajas de utilizar un catalizador heterogéneo frente al homogéneo y enzimas, se puede mencionar: reutilización del catalizador, facilidad de procesos continuos, uso de materias primas de diversa fuentes, no se forman jabones, purificación más sencilla, no se necesita neutralizar, tiempo de reacción menores. Entre los posibles inconvenientes, podrían presentarse: resistencia a la transferencia de masa, mayor temperatura de reacción y lixiviación de las especies activas. En la síntesis de biodiesel, el uso de catalizadores estructurados permitirá eliminar algunos pasos del proceso, como neutralización y lavado en el caso de los catalizadores

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homogéneos, filtrados para los heterogéneos. Este ahorro de etapas podría compensar el mayor costo del catalizador si se superan los problemas operativos que imponen entre otros aspectos la posibilidad de regeneración y reuso del catalizador. El depósito de catalizador en polvo sobre el monolito debe cumplir tres requisitos fundamentales: asegurar una cantidad suficiente de catalizador, formar una capa homogénea y tener una adherencia suficiente para su manipulación y uso (Damiani, Reinoso & Tonetto. 2011) Los ésteres grasos obtenidos a partir de la reacción dada, poseen propiedades y tamaños similares a los constituyentes del combustible diesel, y es lo que se conoce como Biodiesel (Torossi. 2006)

Figura 1. Reacción para producción del biodiesel Principales variables que afectan la reacción de transesterificación

Figura 2. Principales variables que afectan la reacción de transesterificación. 

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Tanto la acidez del aceite como su contenido acuoso, son parámetros importantes para tener en cuenta, por lo que una valoración previa de la acidez del aceite, es importante para determinar la cantidad de catalizador capaz de neutralizarla sin disminuir su acci ón catalítica. Para el aceite de palma a usar, se supondrá un índice de acidez de 1.5 mg NaOH/g aceite (Torossi. 2006) La relación molar entre el alcohol y el aceite es una de las variables más influyentes en el rendimiento de la reacción y en la viscosidad final del biodiesel. El alcohol más utilizado es el metanol debido a su polaridad y a su estructura de cadena corta. Si bien la estequiometria para la reacción requiere tres moles de alcohol por mol de aceite, en la práctica, se incrementará (9:1) para desplazar el equilibrio hacia una mayor formación de ésteres metílicos (Torossi. 2006).

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Los catalizadores a utilizar, son catalizadores básicos, como el hidróxido de sodio o de potasio. Es de suma importancia utilizar reactivos concentrados, para minimizar la presencia de agua. La cantidad de catalizador a usar el 1% p/p con respecto a la cantidad de aceite más la cantidad de catalizador necesario para neutralizar el ácido presente en el aceite (índice de acidez) (Torossi. 2006).

Definiciones Acidez: contenido de ácidos grasos libres determinados de acuerdo con el procedimiento especificado en la norma NTC 218. La acidez se expresa como porcentaje en masa. Si el resultado de la determinación se reporta como acidez, sin explicación adicional, ésta es, por convención, la acidez expresada con base en ácido oleico.2) Si la muestra contiene ácidos minerales, por convención, se determinan ácidos grasos. Índice de acidez: número de miligramos de hidróxido de potasio requeridos para neutralizar los ácidos grasos libres presentes en 1 g de grasa, cuando se determina de acuerdo con el procedimiento especificado en la norma NTC218. El Índice de acidez se expresa en miligramos por gramo Cálculos previos a la práctica Realizar los cálculos correspondientes para procesar 50 gramos de aceite de palma (100% de pureza, densidad 856 g/mol) con la relación anteriormente indicada. Calcular el peso de catalizador necesario en la reacción y para neutralizar la acidez del aceite. 



PROCEDIMIENTO Transesterificación 1. Pesar el catalizador y disolverlo en el metanol. 2. Pesar 50 gramos de aceite y calentarlo para climatizar (60 grados centígrados). 3. Agregar la solución de catalizador-Metanol al aceite de palma. 4. Pasar mezcla a un balón volumétrico con un magneto y poner en el montaje esquematizado en la figura 3.

Figura 3. Montaje transesterificación

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5. Asegúrese de que la mezcla se mantenga aproximadamente a 60 grados centígrados mediante un calentamiento en baño María con agua caliente. 6. Encender el sistema de agitación y de reflujo. 7. Dejar reaccionar por 45 minutos. 8. Desmontar y pasar la mezcla a un embudo de decantación para separar las fases. 9. Recuperar el biodiesel (fracción liviana). 10. Purificar el biodiesel mediante lavado con agua a 100 grados centígrados. Determinación del índice de acidez por Método con etanol caliente usando indicador. Materiales Etanol 95% v/v neutralizado según la norma NTC. 2,5g de aceite. Solución de NaOH al 0,25M normalizada. Bureta.    

Procedimiento 1. Pesar 2,5g de aceite en un Erlenmeyer de 100 ml. 2. Agregar 50 ml de etanol neutralizado (según la norma NTC.) a 75ºC 3. Mezclar y llevar a ebullición. 4. Titular con NaOH a 0,25 M, agitando vigorosamente. 5. Determine el índice de acidez (ecuación 1). 6. Calcular la acidez (ecuación 2).

Í   = 56,1   1    2  =  10

Donde V: volumen usado de NaOH 0,25M en la titulación (mililitros). c: concentración exacta de NaOH (moles/Litro). m: masa de aceite (gramos). M: masa molar del aceite (gramos/mol) (Tabla 1).

Tabla 1. Masa molar de aceites Tipo de grasa Expresada como Masa molar (g/mol) Aceite de coco, de palmiste y similares Ácido láurico 200 Aceite de palma Ácido palmítico 256 Aceites de algunas crucíferas Ácido erúcico 338 Todas las otras grasas Ácido oleico 282 En el caso de semillas de colza con un contenido máximo de ácido Eurico de 5%(m/m), la acidez se debe expresar como ácido oleico.

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PREGUNTAS I. II. III. IV.

¿Que son las normas NTC y que utilidad tienen? ¿Cómo se neutraliza el etanol según la norma NTC 218 (Numeral 4.7.2)? ¿Cómo determinaría si los productos de la transesterificación si son los productos esperados? ¿Qué se esperaría si se le mide el índice de acidez y la acidez a la glicerina obtenida en la transesterificación? ¿Tiene algún sentido medirlas?

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8.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS CON APLICACIONES EN LA INGENIERÍA QUÍMICA

En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mínimos para el manejo de microorganismos. Todo microorganismo en el laboratorio se debe manipular como si fuera potencialmente perjudicial para la salud. En la práctica cuando se manipulan microorganismos provenientes de muestras ambientales se debe tener especial cuidado en no perder microorganismos en las diferentes etapas de aislamiento, como tampoco permitir la contaminación.

OBJETIVOS  

Demostrar la presencia de diversos tipos de microorganismos en la naturaleza. Aislar microorganismo de diferentes microambientes.

MARCO TEÓRICO Cualquier ser vivo necesita tomar del ambiente una serie de compuestos que se emplean como fuente de energía, y para sintetizar los constituyentes celulares. Estos compuestos se denominan nutrientes. Los nutrientes deben contener agua, C, N, S, P, Ca, K, Na, Mg, Mo, Cu y Zn. En función de la fuente de energía, los microorganismos se clasifican en: · Fotótrofos: utilizan la luz como fuente de energía · Quimiótrofos: Oxidan compuestos químicos inorgánicos para obtener energía. En función de la fuente de carbono, los microorganismos se clasifican en: · Autótrofos: CO2 · Heterótrofos: Compuestos orgánicos carbonados. Los microorganismos en estado natural crecen de forma heterogénea o mixta. Cuando queremos estudiar un microorganismo dado, debemos aislarlo. Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula (son clones). Hay diferentes métodos para obtenerlas.

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METODOLOGÍAS EMPLEADAS PARA EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS: 1. método de siembra por agotamiento o en estría

Figura 1. Siembra por estría o agotamiento Encienda el mechero y realice el procedimiento cerca de este. Con el asa estéril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensión anterior en otra dirección. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensión en otra dirección. Esterilizamos y repetimos la operación. Incubamos a 37 º durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la segunda, parte de la primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún. Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa Petri, tendremos un cultivo puro.

2. Siembra por el método de las diluciones sucesivas

Figura 2. Siembra por el método de las diluciones sucesivas

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Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas células que, tras inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas. Metodología: Tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa Petri con medio de cultivo. Con un asa se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubamos a 37 ºC durante 24 horas. En la primera dilución habrá un amasijo de colonias. En la siguiente habrá diez veces menos número de colonias, y así sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas.

PROCEDIMIENTO Muestreo. 1. Tomar una muestra de suelo de 10-15cm de profundidad. Preferiblemente donde se encuentren cultivos de plantas leguminosas (ej. Maní forrajero), para el aislamiento de bacterias solubilizadoras de fosforo. 2. Tomar una muestra de agua (lago, laguna, rio, fuente), para el aislamiento de microalgas (ej. lago del parque norte). Tomar la muestra en un frasco coprológico estéril. 3. Tomar una muestra de bagazo de caña, para realizar el aislamiento de levaduras. Guardar el bagazo de caña en una bolsa. 4. Tomar una muestra de madera colonizada por hongos Macromicetos o Micelio. Guardar el madero con el hongo en una bolsa. 5. Todas las muestras deben estar frescas, es decir debe ser tomada un día antes de la práctica, en su defecto se debe guardar en nevera. Metodología de Cultivo: 



Bacterias: 1. Tomar 5g de tierra y diluir en 45ml de agua destilada estéril (solución madre) 2. A partir de la solución madre realizar diluciones sucesivas, Tomando 1ml de solución madre y diluyéndola en 9ml de agua destilada estéril y así sucesivamente hasta obtener una dilución 10-3. 3. Tomar de cada uno de los tubos con el aza de aro una gota y proceder a sembrar por agotamiento en la caja de Petri con medio de cultivo NBPRI. 4. Incubar a 37 ºC durante 24 horas. Hongos: 1. Tomar un trozo pequeño de madera invadida por el hongo, o cortar un pedazo de hongo (por las lamelas). 2. Realizar el lavado del hongo para disminuir posibles contaminantes así:  Llevarlo a una solución de etanol, dejar 1 minuto, sacar y secar en papel absorbente.  Introducirlo en una solución de hipoclorito, por 1 minuto, sacar y secar en papel.  Lavar finalmente en una solución de agua destilada estéril por 1 min, sacar y secar en papel.

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3. Llevar el trozo de hongo lavado a la caja de Petri con medio de cultivo KIMURA, y sembrarlo en el centro de la caja realizando un poco de presión para hundir un poco el hongo en el agar. 4. Incubar a 37 ºC durante 24 horas. 



Levaduras: 1. Tomar un trozo de bagazo de caña y sumergirlo en 25 ml de agua destilada estéril y homogenizar (solución madre) 2. A partir de la solución madre realizar diluciones sucesivas, Tomando 1ml de solución madre y diluyéndola en 9 ml de agua destilada estéril y así sucesivamente hasta obtener una dilución 10-3. 3. Tomar de cada uno de los tubos con el aza de aro una gota y proceder a sembrar por agotamiento en la caja de Petri con medio de cultivo PDA. 4. Incubar a 37 ºC durante 24 horas. Microalgas: 1. La muestra de agua con microalgas será la solución madre. 2. A partir de la solución madre realizar diluciones sucesivas, Tomar 1ml de solución madre y diluirla en 9 ml de medio de cultivo CHU13 y así sucesivamente hasta obtener una dilución 10-3. 3. Incubar a temperatura ambiente e iluminación por 7 días.

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9.

CARACTERIZACIÓN MACRO Y MICROSCÓPICA DE LOS MICROORGANISMOS.

OBJETIVOS    

Aprender a manejar adecuadamente el microscopio compuesto binocular. Observar y describir las características morfológicas de las colonias. Utilizar el método de coloración de Gram para caracterizar una colonia bacteriana. Clasificar microorganismos de acuerdo con las características morfológicas.

MARCO TEÓRICO Las células son las unidades básicas de los seres vivos. La mayoría de ellas son de tamaño muy pequeño por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su visualización. El microscopio óptico, utiliza la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Actualmente existen diferentes tipos de microscopios: Microscopio óptico, simple, compuesto, de luz ultravioleta, de fluorescencia, petrográfico, de campo oscuro, de contraste de fase, de luz polarizada, confocal, electrónico, electrónico de transmisión, electrónico de barrido y otros aún más complejos.

Nota: En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mínimos para el manejo de microorganismos. Sobra decir que todo microorganismo en el laboratorio se debe manipular como si este fuera potencialmente perjudicial para la salud. En la práctica cuando se manipulan microorganismos provenientes de muestras ambientales se debe tener especial cuidado en no perder microorganismos en las diferentes etapas de aislamiento, como tampoco permitir la contaminación. Caracterización de microorganismos La observación de los microorganismos se valora en dos aspectos: El aspecto macroscópico, en el que se evalúa color, forma y tamaño de las colonias. El aspecto microscópico en el que se evalúa la forma, el tamaño y propiedades de la pared del microorganismo como tal.  

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Estas apreciaciones le permitirán al microbiólogo determinar aspectos como: Pureza del cultivo, ya que las colonias observadas deben ser de un solo tipo La morfología microscópica debe presentar uniformidad en el tamaño, absorción de la coloración y forma de los microorganismos evaluados. Composición de la pared, ya que la coloración de Gram utilizada para la observación microscópica, da cuenta de los componentes presentes en la pared celular; puesto que al ser negativa el microorganismo en esta tendría mayor porcentaje de lipopolisacáridos, mientras que al ser positiva, indicaría que el microorganismo en esta estructura presenta mayor porcentaje de péptidoglicanos. Viabilidad, dado que la observación en fresco, permite ver el movimiento microbiano.  

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

Morfología bacteriana La forma de la célula bacteriana es una característica que está determinada genéticamente, por ello es constante para cada especie (a pesar que existen pequeñas variaciones durante los ciclos reproductivos) y es una característica fundamental en taxonomía e identificación de especies a nivel de laboratorio. Su morfología puede agruparse en tres formas básicas (ver tabla 1):

a. Cocos (esféricas): Presentan forma esférica o casi esférica ya que sus diámetros (largo y ancho) son casi iguales. En algunos casos se observan formas ovoides, arriñonadas, o lanceoladas. La forma celular está directamente relacionada con las estructuras de envoltura de la célula. b. Bacilos o Bastones (cilíndricas): células con una morfología más variable, caracterizada porque uno de los ejes o diámetro es notablemente mayor que el otro, de tal manera que se observan como bastoncitos de diferente ancho y longitud. Al observar algunas especies bacterianas, éstas presentan diferentes formas durante su multiplicación siendo posible observar células filamentosas, bacilos cortos, ovoides, etc.; a esta propiedad se le denomina pleomorfismo o polimorfismo. En otros casos las formas bacilares se acortan en forma notable llegando casi a adoptar la forma ovoide (morfología cocobacilar). c. Helicoidales o curvas (espirales): Generalmente células aislada; muy largas en relación a su ancho y se observa una torsión alrededor de su eje (espiras) en un número característico para cada especie (ejemplo: Spirochaeta, Treponema, Leptospira). Las bacterias cortas y de espiral incompleto se denominan bacterias en comma o vibriones. d. Bacilos miceliares: Entre las bacterias, existen algunas capaces de desarrollar en un comienzo un micelio rudimentario, el que luego se fragmenta, ejemplo: Streptomyces sp., entre otras.

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Tabla 1. Formas de las bacterias de acuerdo al tipo celular. Tipo Celular

Forma Diplococos

Descripción Células agrupadas en pares.

Tetracocos

Cocos

Bacilos

Células se agrupan de a cuatro en un solo plano. Células agrupadas en cadenas cortas (2-6) y largas (10Estreptococos 20) debido a la división celular en plano vertical. Células se dividen en plano horizontal y vertical en Estafilococos forma simultánea originando agrupación de células. La división celular ocurre en diversos planos Sarcina formándose verdaderos cubos de células. En la agrupación celular no existe un orden aparente o regular. Al realizar preparaciones que deban ser Micrococos sometidas a tinción, se debe ser cuidadoso ya que esta agrupación suele desarticularse. Células aisladas en parejas, ejemplo Klebsiella Diplobacilos pneumoniae. Estreptobacilos Células bacilares en cadenas, ejemplo: Lactobacillus Disposición celular, una al lado de la otra, ejemplo: Empalizada Corynebacterium sp. En grupos de a Semejando ramificaciones, ejemplo: Mycobacterium sp. tres

Figura 1. Morfología Bacteriana

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Morfología de hongos y levaduras Los hongos son los descomponedores primarios de la materia muerta de plantas y de animales en muchos ecosistemas, y como tales poseen un papel ecológico muy relevante en los ciclos biogeoquímicos. Los hongos se presentan bajo dos formas principales: hongos filamentosos (antiguamente llamados “mohos”) y hongos levaduriformes. El cuerpo de un hongo filamentoso tiene dos porciones, una reproductiva y otra vegetativa. La parte vegetativa, que es haploide y generalmente no presenta coloración, está compuesta por filamentos llamados hifas (usualmente microscópicas); un conjunto de hifas conforma el micelio (usualmente visible). A menudo las hifas están divididas por tabiques llamados septos. El ciclo de vida del hongo puede ser Anamorfo, fase del ciclo de vida con reproducción asexual, o Teleomorfo, fase del ciclo de vida con reproducción sexual. Según lo anterior las Esporas, elementos de perpetuación de la especie, pueden ser: Mitosporas (asexuales): Artrosporas, Clamidiosporas, Blastosporas, Conidiosporas. 



Meiosporas (sexuales): Oosporas, Zigosporas, Ascosporas, Basidiosporas.

Los hongos levaduriformes — o simplemente levaduras — son siempre unicelulares, de forma casi esférica. No existen en ellos una distinción entre cuerpo vegetativo y reproductivo. Para determinar el tipo de hongo se deben observar las características de la colonia: Si la colonia es cremosa de color rosado o crema, se puede tratar de levadura. Si la colonia es algodonosa se trata de un hongo filamentoso. Si se observa setas u orejas se trata de Basidiomicetes. Microscópicamente se pueden seguir algunas claves: 1a. Células gemantes sin micelio vegetativo......................................................... Levaduras 1b. Micelio vegetativo abundante, con conidios o esporas.................................................... 2 2a. Esporas en ascos............................................................................................ Ascomicetes 2b. Esporas o conidias no originadas en ascas....................................................................... 3 3a. Micelio con pocos septos. Esporas asexuales en esporangios y presencia de zigosporas............................................................................................................ Zigomicetes. 3b. Micelio septado conidios no originados en esporangios.......................... Deuteromicetes. Las principales características de los hongos representativos que se observaran en el laboratorio son: Rhizopus: micelio no tabicado y algodonoso, esporangios muy anchos y oscuros. La base del esporangio en forma de copa. Presencia de rizoides y zigospora. Mucor : micelio claro y no tabicado, columnillas redondas u ovoides, esporas oscuras y de apariencia lisa. No poseen rizoide.

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Aspergillus: micelio ramificado y cenocítico conidióforos tabicados o no tabicados, fialides implantadas sobre una vesícula. Penicillum: micelios vegetativos tabicados, fialides ramificadas. Levaduras: células individuales en forma ovoide, con cicatrices por la gemación.

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Figura 2. Morfología de hongos y levaduras Morfología de microalgas y protozoos Las algas son organismos fotosintetizadores que habitan principalmente cuerpos de aguas dulces y saladas. Dependiendo de la especie, existen algas unicelulares, coloniales y multicelulares. La gran mayoría de algas presentan tamaños microscópicos que varían desde 1 µm hasta 300 µm, sin embargo existen algunas especies microscópicas que incluso pueden alcanzar dimensiones superiores a los 50 m. Tradicionalmente se han divido en grupos basados en su coloración así: algas verdes (Clorofitas), algas oscuras (Feofitas), algas rojas (Rodofitas) y algas pardas (Crisofitas). Las “algas verdeazules - Cianofitas”, son microalgas procariotas. Ciertas algas se pueden encontrar asociadas en la naturaleza con diferentes tipos de hongos. A dicha asociación simbiótica se le conoce como líquenes. El hongo proporciona el soporte y absorbe minerales y nutrientes del suelo, mientras que el alga a través de su acción fotosintética, aporta las moléculas orgánicas.

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Figura 3. Morfología de microalgas

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Figura 4. Morfología de microalgas Preparaciones

Preparaciones no coloreadas: Con este método se observan los microorganismos vivos, lo que permite detectar el tipo de movilidad y la viabilidad de los mismos. Preparaciones coloreadas: Como los microorganismos son incoloros y tienen el mismo índice de refracción del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlos visualizar. Los métodos para observar los microorganismos proporcionan las siguientes ventajas:  Un contraste entre la bacteria y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar los tipos morfológicos microbianos.  Una visualización de las estructuras internas y externas tales como. Espora, equivalente nuclear, gránulos citoplasmáticos, pared celular, cápsula y flagelo. Una de las coloraciones más utilizadas en el laboratorio, para la identificación de microorganismos es la coloración de Gram, por tal razón se verá en detalle. 

Coloración de Gram

La coloración de Gram es un método que ha permitido la división de las bacterias en dos grupos: El de Gram positivas y el de las Gram negativas. La técnica está basada en la capacidad de las bacterias para retener el colorante cristal violeta durante la decoloración con el alcohol acetona. Las bacterias Gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo el color púrpura propio del cristal violeta (Figura 2).

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Figura 5. Esquema de bacterias Gram Negativas Las bacterias Gram positivas no se decoloran y retiene el color violeta. Después de la decoloración, se utiliza la safranina, que es un colorante de contraste de color rojo, dicho colorante da un color rosado a las células decoloradas (Figura 3).

Figura 6. Esquema de bacterias Gram Positivas Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de péptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmática, y las Gram negativas, encima de ésta, presentan una delgada capa de péptidoglicano, a la que se superpone una capa de lipopolisacáridos-lipoproteína, denominada membrana externa. La presencia de esta membrana diferencia actualmente dos divisiones en sistemática bacteriana: las que no lo poseen, Gram (+) y las que sí, Gram (-). La diferencia entre ambos grupos es pues de enorme importancia taxonómica. En el comportamiento como patógenos y en la sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ahí que la realización rápida de una coloración de Gram, reviste enorme importancia en los procesos biotecnológicos y en la bacteriología clínica (Facultad de química farmacéutica).

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MATERIALES         

Cajas Petri con colonias microbianas. Colorantes Gram. Azul de metileno Mecheros. Microscopio. Estereoscopio. Porta objetos. Cubre objetos. Aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO 1. Observe la morfología de las colonias a nivel macroscópico, descríbalas según su forma, borde, elevación y superficie.

2. Observe la morfología de las colonias a nivel microscópico y descríbalas según tamaño, color y forma. 1. Observación en fresco. Se realiza un frotis, el cual consiste en tomar con un asa una muestra de la colonia y esparcirla en el porta objetos, previamente humedecido con una gota de agua, realizando movimientos horizontales. Se adiciona una muestra de colorante (azul de metilo) a la muestra fresca. La observación en fresco se utiliza para hongos y levaduras (cristal violeta o azul de metilo), micro algas (lugol), células vegetales o bacterias coloreadas.

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2. Coloración en seco. Es necesario fijar la muestra después de haber realizado el frotis, para fijar se flamea el portaobjetos, teniendo precaución de no quemar la muestra, hasta que se evapore todo el agua, posteriormente se adicionan los colorantes, según el método de tinción a utilizar. 

Coloración de Gram: Tome colonias separadas de acuerdo a su morfología y realice coloración de Gram: a. Teñir con cristal violeta durante 1 minuto. b. Retirar el colorante con agua. c. Cubrir con lugol durante 1 minuto. d. Lavar con agua. e. Decolorar con alcohol cetona 30 segundos. f. Contrastar con safranina durante 1 minuto. g. Lavar con agua. h. Secar el exceso de agua.

Describa su forma (cocos, bacilos, espiral) tipo de agrupación y clasifíquelas según la absorción de la coloración en Gram (+ o -).

PREGUNTAS I. II. III. IV. V.

¿Cómo actúan cada uno de los reactivos utilizados en la tinción de Gram? ¿Qué relación existe entre la morfología macroscópica y la microscópica? ¿Cuáles son los tipos de tinción y para que se utilizan? ¿Por qué es importante la observación microscópica en un proceso biotecnológico? Identifique las partes del microscopio óptico compuesto.

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Manejo del equipo. Antes de hacer uso del microscopio reconozca sus componentes y sus funciones. El microscopio es un instrumento delicadamente ajustado que se debe manejar con mucho cuidado. Conecte el microscopio a una fuente de energía Gire el control de luz hasta alcanzar la intensidad deseada. Ubique el especímen que desea observar en la platina Enfoque con el objetivo de 10X Ajuste la distancia interpupilar Ajuste la apertura del diafragma Direccione la placa que tiene el especímen con los mandos de movimiento del portaobjetos Seleccione el objetivo que necesita (Aplique aceite de inmersión cuando use el objetivo de 100X). Cuando finalice la observación, asegúrese de limpiar el lente del objetivo y cualquier parte del microscopio que esté cubierta con aceite.       



Al finalizar su uso: Cúbralo para protegerlo del polvo, Los lentes no se deben tocar con los dedos. El polvo en el lente ocular debe limpiarse con una brocha de cerdas finas o un paño.

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De manera similar si una superficie de cristal requiere limpieza. También puede limpiarse con un paño o tela de textura suave o con papel especial para lentes. Las partes metálicas pueden limpiarse con un paño humedecido. El alcohol no es recomendable para la limpieza de ninguna de las partes del microscopio.

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10.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ESPECÍFICOS

OBJETIVOS  

Preparar medios de cultivo sólidos y líquidos. Reconocer algunos ambientes que permiten evidenciar la existencia de microorganismos.

MARCO TEÓRICO Los ambientes capaces de albergar vida microbiana reflejan el amplio espectro de la evolución de estos organismos. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación y el punto de ebullición del agua, en agua salada y en agua dulce, en presencia y en ausencia de aire. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse a muchos ambientes diferentes. Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes de aire y estar en todas partes, pero las características del ambiente determinan cuáles especies pueden multiplicarse. Existen varias clases de microorganismos: Hongos, levaduras, bacterias, actinomicetos, protozoos, algas, virus. El suelo es uno de los ambientes donde un conjunto ingobernable de microorganismos compiten entre sí para obtener lo que todos ellos necesitan: nutrientes y energía. Al mismo tiempo, los productos de su metabolismo alteran la composición química del suelo donde habitan. Más aún, los propios microorganismos evolucionan en respuesta a la presión del ambiente. Numerosas especies bacterianas y algunas veces incluso algas microscópicas o protozoos, proliferan en las superficies expuestas a la humedad formando una biopelícula de microorganismos contenidos en una matriz de polisacáridos, cuyo espesor puede oscilar entre algunos micrómetros y pocos milímetros, que se adhiere fuertemente a la base. Las biopelículas se forman en todas las superficies sumergidas, tanto en agua dulce como de mar, o bien sobre soportes constantemente húmedos tales como paredes de la cañería de agua, pisos o dientes. El 99% de toda la actividad microbiana en un ecosistema abierto ocurre sobre las superficies (Carrillo, 2003). Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe

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sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias. Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. Los medios de cultivo se pueden clasificar según la origen, consistencia y composición (López & Torres. 2006). Los medios de cultivo pueden ser: • Líquidos: Se preparan todos los constituyentes en una disolución acuosa (agua destilada). Una vez disueltos, se reparten en matraces o tubos de ensayo que tapamos y esterilizamos con calor. • Sólidos: Hacemos lo mismo que para los medios líquidos, pero, al disolver en agua destilada, añadimos de 15 a 20 g/l de agar. Lo esterilizamos y lo depositamos en placas Petri cuando está a unos 60º. Cuando alcance los 50º, ya será sólido. • Semisólidos: Su apariencia es de gel. Sólo llevan 5 g/l de agar. En función de su composición, distinguimos dos grupos de medios de cultivo: Medios sintéticos o definidos: Son aquellos que contienen cantidades precisas de sustancias orgánicas e inorgánicas puras disueltas en agua destilada. Medios complejos o indefinidos: Contienen sustancias altamente nutritivas, pero de composición indefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona, extractos de levadura, bovril... La ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos factores de crecimiento, por lo que podemos cultivar en él gran número de microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo que el microorganismo está consumiendo.


Erlenmeyer Cajas Petri Tubos de ensayo Incubadora

  

Mechero Cámara de flujo laminar Autoclave

PROCEDIMIENTO Preparación de medios de cultivos sólidos y líquidos: 

Preparar los medios de cultivo (PDA, NBPRI, KIMURA) de acuerdo a las composiciones de la siguiente tabla y seguir las indicaciones que se den para su preparación.

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Medio de NBPRI. Bacterias solubilizadoras ( Composiciones de medios específicos)

Composición del medio Glucosa Ca3(PO4)2 MgCl2*6H2O MgSO4*7H2O NBPRI (medio con fosfato insoluble) KCl (NH4)2SO4 Agar pH Cloruro de sodio Extracto de levadura Caldo LB Peptona de caseína pH

Concentración (g/L) 10 5 5 0,25 0,2 0,1 13 7 5.0 5.0 10.0 7.2 ± 0.2

Medio de mantenimiento – levaduras

Reactivo Glucosa MgSO4.7H2O KH2PO4 (NH4)2 SO4 Extracto de levadura Peptona universal

Cantidad (g/L) 60 1 2 3 4 3,6

Medio Kimura – Hongos

Reactivo Glucosa Peptona universal Extracto de levadura KH2PO4 MgSO4.7H2O Agar pH

Medio sólido (g/L) 20 5 2 1 0.5 15 5.5

Medio líquido (g/L) 20 5 2 1 0.5 No 5.5

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Colorantes

Colorante Orange II Azul índigo

Concentraciones (ppm) 100 200 100 200

Medio CHU 13. Microalgas

Sln 1. Sln 2. Sln 3. Sln 4. Sln 5. CHU 13 Sln.6 NaHCO3

1ml/L 1ml/L 1ml/L 2 ml/L 2 ml/L 2 ml/L 0,4 g/L (preparar y esterilizar aparte)

Stock

Sustancia

Concentración(g/L)

1

FeSO4. 7H2O Na2EDTA H3BO3 NaMoO4. 2H2O CoCl2. 6H2O. Mn Cl2 CuCl2. 2H2O ZnSO4 K2HPO4 MgSO4. 7H2O CaCl2.2H2O KNO3

7,5*10-3 9,16*10-3 2,859*10-3 0,05 *10-3, 0,081*10-3 1,146*10-3 0,054*10-3 0,1234*10-3 0,04 0,1 0,08 0,2

2

3 4 5 6

1. Preparación del medio de cultivo solido (Agar):  Disolver todos los ingredientes de la tabla en 1 litro de agua destilada, agitar, ajustar pH y calentar hasta su completa disolución.  Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 min y 15psi.  Verter el medio en cajas de petri estériles  En la caja Petri con medio sólido, correspondiente a cada estudiante, inocule las cajas con microorganismos obtenidos y aislados.  Luego incube dejando la caja invertida a 37°C de 24 a 48 horas. 2. Preparación del medio de cultivo liquido:  Disolver todos los ingredientes de la tabla en 1 litro de agua destilada, agitar y ajustar pH de acuerdo con el medio de cultivo.  Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 min y 15psi.

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11.

DETERMINACIÓN DE CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y CAPACIDAD METABÓLICA DE MICROORGANISMOS

OBJETIVOS 

Caracterizar microorganismos con capacidad solubilizadora de fosfatos, degradadores de colorantes, productores de bioetanol y productores de biomasa y pigmentos.

NOTA: Los ítems marcados con * deben ser consultados por cada equipo de trabajo. MARCO TEÓRICO La Cinética de crecimiento celular para microorganismos está dada por la ecuación:

/∗=

Dónde: dN/dt: cambio del número de microorganismos en el tiempo μ: velocidad especifica de crecimiento celular (horas-1) N: número de microorganismos (número de células) Si integramos la ecuación en los límites de No (microorganismo iníciales) y N (microorganismos en un tiempo t).se obtiene Ln(N/No)=μt

Es posible identificar fases de crecimiento y parámetros cinéticos que son característicos de cada microorganismo.

Producción de etanol* Producción de biomasa y pigmentos* Solubilización de fosfatos* Remoción de colorantes*

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Microorganismo 1. Levadura 2. Microalgas objetivo proceso de Producción de Producción de interés etanol biomasa y pigmentos Fuente de Puestos de Lago Jardín búsqueda jugos de caña botánico o parque norte Medio de PDA CHU13 líquido selección Método de siembra en caja Diluciones aislamiento seriadas Ensayo de aplicaciones

fermentación alcohólica, medición de biomasa

3. Bacterias

4. Hongos

Solubilización de fosfato. Biofertilizante Suelo

Remoción de colorantes

NBRIP o PVK

Madera en pudrición Kimura

Diluciones siembra en seriadas placa siembra en placa Cultivo de Cultivo en cultivo en microalgas placa medición placa medición de de halo de medición de biomasa y crecimiento y halo de pigmentos por solubilización crecimiento y espectrofotometría de fosfato. degradación Cultivo líquido de colorante medición de biomasa


Cajas Petri con medios de cultivo específicos incubadas. Fermentómetros Espectrofotómetro Colorantes

PROCEDIMIENTO Realizar seguimiento cinético del cultivo, observar variaciones en el medio de cultivo específico y crecimiento del microorganismo y de acuerdo con el sustrato empleado. Luego de registrar los datos tanto de absorbancia como del conteo celular de los diferentes tiempos, construir las siguientes graficas: 1. Abs vs t, Numero de células/ml vs t, cm/t (según el caso) 2. Calcular µmax y tiempo de duplicación

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Bacterias solubilizadoras de fosfato

Preparación del inóculo. Se toma una colonia aislada de una cepa pura de bacterias solubulizadoras sembrada por estrías por agotamiento en placa de agar a 30º C Curvas de crecimiento se cultiva en matraces Erlenmeyer de 500mL (con 300 ml de medio de cultivo), incubados en shaker por 24 horas. Para obtener la cinética toman muestras cada 2 horas midiendo Se siembra 0,1 ml en caja de Petri para determinar Unidades formadoras de colonias/ml, realizando diluciones en caso de ser necesario. (Consultar el procedimiento)*, o realizar conteo en cámara de Neubauer. Microalgas 







Inocular con un 10% V/V de la microalga, con un cultivo que tenga una buena densidad celular. Tomar muestras de 1 mililitro de biomasa durante 10 días de crecimiento (homogenizar el sistema antes de tomar la muestra) para Densidad óptica y conteo celular. Leer absorbancia a 438nm (Recuerden tomar un mililitro agua destilada como blanco) Realizar conteo en cámara de Neubauer:

Conteo en cámara de Neubauer Se cuentan las células en los 4 cuadros L y se calcula el promedio, teniendo en cuenta que Promedio Células x 10000=X cel/ml

Figura 1. Cámara de Neubauer

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Hongos degradadores de colorantes

Medio sólido 

Cada caja Petri contiene aproximadamente 20 ml de medio de cultivo Kimura estéril .más el colorante a la concentración correspondiente.



Sembrar el hongo que corresponde, transfiriendo un trozo circular de agar colonizado.



Incubar por 15 días a 30ºC en estático.



Medir la velocidad de crecimiento y de decoloración, midiendo en cada caja Petri el crecimiento radial y el halo de decoloración

Levaduras

Preparación del inóculo. Activar la levadura a las siguientes condiciones: 30°C y 150 rpm durante 24 horas. Curvas de crecimiento: Montaje en batch en erlenmeyers de 500ml, con un volumen de fermentación de 300 mL, se adicionan 270 mL de medio de cultivo y 30 mL levadura, libre de glucosa. Se debe tomar muestra cada dos horas, en los cuales se realizará el siguiente procedimiento: 1. Tomar el cultivo del agitador y llevarlo a la cámara de flujo laminar. 2. Tomar una muestra de 1 ml con micro pipeta en epperndorf de 2mL. 3. Para cuantificar la biomasa. Medir absorbancia a 600 nm para determinar concentración de biomasa. 

Montaje para la determinación de etanol.

La cantidad de etanol producido se cuantifica de manera indirecta a partir del CO 2 liberado durante la fermentación, apoyados en la relación estequiométrica:

0 +.→2+ La determinación de etanol se realizara en erlenmeyers de 100 mL con un volumen de fermentación de 60 mL, se adiciona 54 mL de medio de cultivo y 6 mL de biomasa, libre de glucosa. Al igual que para la determinación de biomasa y consumo de sustrato se realizan tres montajes con diferentes concentraciones. La diferencia del montaje para la determinación con respecto al montaje para la determinación de biomasa y consumo de sustrato es que este montaje lleva un fermentómetro (ver figura 5 y 6)

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Manual de Laboratorio de Biología Para Ingenieros[94]

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