LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (BI – 2105)
ISOLASI DNA PLASMID PGEMT-easy DAN AMPLIFIKASI PROMOTOR GEN MaEXPA1 PADA Eschericia coli DH-5α Tanggal Praktikum
: 24 Oktober – 7 November 2014
Tanggal Pengumpulan
: 21 November 2014
disusun oleh : Rahayu Jatiningsih 10612014 Kelompok 13
Asisten : Riesa K.W.R 10611047
PROGRAM STUDI BIOLOGI SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG BANDUNG 2014
BAB I PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang DNA merupakan komponen terpenting yang dimiliki oleh mahluk hidup,
karena DNA adalah satuan fungsional terkecil yang pasti dimiliki oleh makhluk hidup baik tanaman, binatang, manusia, bahkan bakteri. Untuk itulah, kegiatan mempelajari DNA sangat dibutuhkan terutama dalam perkembangan ilmu genetik. Tentunya ketika kita mempelajari DNA, isolasi terhadap DNA tersebut penting untuk dilakukan. Isolasi DNA juga dibutuhkan dalam menyelidiki kasus tertentu seperti pembunuhan, pencurian, dsb. (Haris et al., 2005). Pada praktikum kali ini hal yang dilakukan salah satunya adalah isolasi DNA. DNA yang digunakan bukanlah DNA genom melainkan DNA plasmid, karena Plasmid memiliki suatu kekhususan yaitu mudah disisipi oleh gen lainnya dan mampu bereplikasi beberapa kali dalam satu kali masa replikasi, menyebabkan jumlahnya dapat bertambah dengan sangat cepat (Szczepanowski, 2008). Dari sifat khas itu, plasmid sering dimanfaatkan untuk menjadi vektor suatu gen atau untuk menghasilkan ekspresi gen yang besar, seperti pada produksi insulin. Penjelasan tersebut cukup mendukung pemilihan DNA plasmid dalam percobaan dibandingkan DNA genom. Dalam mempelajari DNA tentu saja tidak terlepas dari adanya suatu gen. Pada gen terdapat urutan basa nukleotida yang membentuk rantai ganda yaitu DNA itu sendiri. Ketika melakukan Amplifikasi Gen, sequence DNA ikut diperbanyak. Amplifikasi gen sangat dibutuhkan dalam ilmu Rekayasa Genetika, pengetahuan dalam ilmu forensik, serta diagnosis penyakit. Amplifikasi gen dapat dilakukan dengan metode PCR.
Kegiatan PCR ini dilakukan karena merupakan solusi
terbaik untuk menyediakan jumlah DNA yang banyak dari sampel suatu segmen DNA yang tersedia dalam jumlah sedikit. Dalam waktu hitungan jam, sampel DNA yang diperbanyak bisa berkembang jumlahnya menjadi jutaan kali lipat, cukup untuk menyediakan DNA dalam sumber penelitian (Reece, 2012).
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan purifikasi dari molekul DNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar ultraviolet.
Cara pemisahan dengan elektroforesis ini
merupakan alat pendukung yang sangat fundamental dalam teknologi DNA rekombinan.
Elektroforesis
digunakan
untuk
pengamatan
DNA
dalam
penampakan flouresensinya. Dalam praktikum kali ini, tujuan dilakukannya elektroforesis yaitu untuk mengkonfirmasi DNA dan ukuran DNA hasil isolasi Plasmid PGEMT-easy serta amplifikasi promotor gen MaExpa1. (Cheng and Zhang, 2008).
1.2
Tujuan 1. Mengisolasi DNA plasmid PGEMT-easy dengan metode alkalin lisis 2. Mengamplifikasi promotor Gen MaEXPA1 dari DNA plasmid PGEMTeasy yang diisolasi dengan metode PCR
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Plasmid Plasmid sering disebut sebagai DNA sirkuler. Hanya beberapa organisme yang memiliki Plasmid tersebut, seperti tanaman yang memiliki klorofil, prokariot, dan mitokondria. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal, hal inilah yang membedakannya dengan DNA genom yang berada dalam kromosom (Alberts, 2012). Plasmid memiliki suatu kekhususan yaitu mudah disisipi oleh gen lainnya dan mampu bereplikasi beberapa kali dalam satu kali masa replikasi, menyebabkan jumlahnya dapat bertambah dengan sangat cepat (Szczepanowski, 2008). Plasmid pada umumnya memiliki struktur tersier yang sangat kuat dan kompak, yang biasanya membentuk sirkular. Sedangkan DNA genom jauh lebih longgar pada ikatan di kedua untaiannya sehingga menyebabkan DNA genom mudah sekali terdegradasi dibandingkan DNA plasmid (Susanto, 2012). Plasmid yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah PGEMT-easy yang digambarkan pada peta plasmid berikut,
Gambar 2.1 Peta Plasmid PGEMT-easy (GSL Biotech LLC, 2014)
Plasmid menurut Ahsan (2012) memiliki 4 konformasi utama yaitu nicked, supercoiled, linear, Supercoiled denatured dan relaxed circular, yang masingmasingnya memiliki ukuran sendiri. Konformasi dapat diurutkan dari yang paling berat ke ringan sebagai berikut: nicked,linear,supercoiled denatured, relaxed circular dan supercoiled. Plasmid sering digunakan dalam teknik DNA rekombinankarena sederhana, tidak terlalu panjang, dan mudah disisipkan gen yang diinginkan karena plasmid mudah dibuka dan ditutup. Untuk melakukan teknik rekayasa seperti itu, plasmid harus diisolasi dari bakteri terlebih dahulu.
2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction) Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu alat yang digunakan untuk memperbanyak DNA dalam suatu kondisi in vitro. Tekniknya adalah dengan memperbanyak suatu segmen spesifik dari DNA molekul tertentu. Alat ini dikenalkan oleh Kary Mullis pada tahun 1985 yang meraih penghargaan nobel
pada tahun 1993 atas hasil penemuannya ini. Masalah yang timbul sebagai awal penciptaan PCR ini adalah bagaimana cara meneliti tentang suatu rantai DNA, namun sumber DNA yang tersedia hanya sedikit. Maka diciptakanlah metode PCR yang bisa masih bisa dimanfaatkan oleh para ahli di bidang genetika sampai sekarang (Lo, 2006). Menurut Lo (2006), prinsip dasar yang dilakukan PCR sebenarnya sangat sederhana, karena PCR memiliki prinsip kerja berlandaskan terjadinya replikasi DNA yang terjadi selama proses pembelahan sel. Siklus PCR dapat dilihat pada gambar 2.2 berikut ini, 1 3 6 2
4
5
Gambar 2.2 siklus PCR (Sambrook, 2001)
Keterangan :
5. Elongasi n
1. Denaturasi 1
6. Cooldown
2. Denaturasi 2,3,...,n
Dari
profil
di
atas,
terjadi
3. Annealing
pengulangan proses 2 – 3 – 4
4. Elongasi 1,2,...,n-1
sebanyak 30 kali ( 30 siklus)
2.3 Elektroforesis Elektroforesis adalah suatu teknik yang dapat mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anoda). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi
dari
DNA.
Hasil
elektroforesis
yang
terlihat
adalah
terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994). Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu: 1. Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar. 2. Konsentrasi gel Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA.
Konsentrasi
agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar. 3. Bentuk molekul Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat. 4. Densitas muatan Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah. 5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA. 6. Voltase Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA. 7. Larutan buffer elektroforesis Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Wolfe, 1993).
BAB III METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan Pada praktikum isolasi DNA plasmid dan amplifikasi gen menggunakan PCR, alat dan bahan yang dibutuhkan adalah sebagai berikut Tabel 3.1 Alat dan Bahan
Alat
Bahan
Alat Sentrifuga
Vortex
Mikropipet
Mikrotube 1,5 ml
Tips
300 µl solution I
Inkubator
400 µl solution II
Alat Elektroforesis
200 µl solution III
-
Cetakan gel untuk
Isopropanol
membuat agarosa
EtOH 70 %
-
Alat pencetak sumur
TE 50 µl pH 8,0
-
Tangki elektroforesis
Dream Taq 5 µl
-
Sumber Arus
Primer forward 1 µl
1000 µl kultur bakteri Escherichia coli
Mesin PCR
Primer Reverse 1 µl
Tabung Eppendorf 0,2 ml
Deion
Alat pemanas
DNA template 1 µl
dNTPs
MgCl2
Agarosa
TAE 50x
-
100 ml = 24,2 g Tris
-
5,71 ml Asam Asetat glasial
-
10 ml 0,5 M EDTA
Loading buffer 6x
-
0,25 % bromfenol biru
-
40 % sukrosa
-
30 mg/ml methyl green
Etidium Bromida (0,2 – 0,5 mg/ml)
3.2 Cara Kerja 3.2.1 Isolasi DNA Plasmid 1000 µl kultur bakteri E.coli diambil dan dimasukan kedalam mikrotube 1,5 ml. Kemudian disentrifuga 14000 rpm selama 1 menit. Lalu supernatan dibuang dan diulang proses sebelumnya hingga kultur bakteri dalam tabung falcon habis. Setelah itu ditambahkan 300 µl solution I dan divorteks sampai pelet larut. Kemudian ditambahkan 400 µl solution II dan tabung dibolak-balik. Selanjutnya ditambahkan 200 µl solution III dan tabung dibolak-balik. Disentrifugasi 14000 rpm selama 5 menit. Kemudian diambil maksimal 300 µl supernatan, diusahakan gumpalan putih tidak terbawa. Selanjutnya dimasukan dalam mikrotube baru. Setelah itu ditambahkan isopropanol 300 µl sebanyak 1x volume sebelumnya. Lalu mikrotube dibolak-balik. Kemudian diinkubasi pada -80ºC selama 30 menit. Selanjutnya disentrifuga dan supernatan dibuang. Selanjutnya ditambah 600 µl EtOH 70% dan tabung dibolak-balik. Setelah itu disentrifuga 14000 rpm selama 5 menit. Di quick spin dan dikeringkan selama 10 – 3- menit. Setelah sampel berubah menjadi warna bening, EtOH sisa yang menempel di dinding mikrotube dibuang, dan ditambahkan 50 µl TE dengan pH 8,0. Kemudian di inkubasi pada – 20 ºC. Terakhir dilakukan elektroforesis konfirmasi.
3.2.2 PCR (tulis siklus amplifikasinya) Pada tabung Eppendorf dimasukan air deion, DNA target, Primer dan PCR mix. Tabung Eppendorf disentrifuga terlebih dahulu sebelum di PCR. Kemudian alat PCR dinyalakan. Setelah itu tabung Eppendorf yang telah
berisi sampel dimasukan kedalam mesin PCR. Lalu mesin PCR di running Reaksi yang pertama dimulai sesuai dengan siklus yang ada, yaitu denaturasi awal (suhu 92) selama 2 menit, kemudian diikuti 30 siklus yakni denaturasi selama 15 detik pada suhu 95, penempelan primer selama 30 detik pada 55, kemudian pemanjangan primer pada suhu 75 selama 2 menit. Lalu siklus ini akan diikuti dengan pemanjangan primer pada suhu 72 selama 7 menit.
3.2.3 Elektroforesis Cetakan gel diletakan pada pencetak sumur, kemudian dicampurkan Agarosa dan TAE 1x lalu di didihkan. Setelah itu ditambahkan 1 µl EtBr, di campur dan dituangkan. Kemudian didiamkan hingga gel mengeras. Setelah gel dalam cetakan mengeras, diletakan pada alat elektroforesis. Di tuang buffer TAE 1x hingga mencapai tinggi 1 mm diatas gel. Dilepaskan pencetak sumur dan dicampur dengan 10 µl DNA dengan 2 µl loading buffer. Setelah itu dimasukan ke dalam sumur gel lalu dihubungkan dengan alat elektroforesis dengan sumber arus pada 70 volt hingga bromfenol sampai ke ujung gel. Setelah itu sumber arus dimatikan dan dikeluarkan dari tangki gel. Jika jumlah DNA terlalu sedikit dengan pewarnaan “methyl green”, maka dicelupkan gel dalam 0,2 – 0,5 µg/ml EtBr dalam buffer TAE 1x selama 10 – 60 menit. Lalu EtBr dihilangkan dari gel dengan dipindahkan dalam buffer TAE 1x selama 10 - 60 menit
BAB IV HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan 4.1.1 Foto Elektroforesis Plasmid DNA Hasil yang di peroleh dari Elektroforesis terhadap plasmid PGEMTeasy pada kultur sel bakteri Escherichia coli DH5α ditunjukan dalam foto berikut ini,
Gambar 4.1 hasil elektroforesis DNA Plasmid pGEMT-easy (Dokumentasi pribadi, 2014)
4.1.2 Foto Elektroforesis Amplifikasi Promotor Gen Hasil Elektroforesis yang didapatkan dari Amplifikasi Promotor Gen Expansion Musa acumilata adalah sebagai berikut,
Gambar 4.2 Hasil Elektroforesis PCR Gen Expansion Musa acuminata (Dokumentasi Pribadi, 2014)
4.2 Pembahasan 4.2.1 Metode Isolasi dengan Alkalin Lisis Dalam praktikum kali ini, digunakan tiga jenis larutan yaitu solution I, solution II, dan solution III. Solution I berisi gabungan senyawa glukosa, Tris-Cl dan EDTA yang berfungsi secara keseluruhan untuk menjaga keutuhan DNA sel E.coli dengan membentuk resuspensi buffer antara larutan dan bakteri E.coli. Menurut Tyler Mall (2013), glukosa pada solution I berfungsi sebagi larutan isotonis yang menjaga tekanan osmotik pada sel E. coli.Larutan glukosa tidak dapat di simpan untuk waktu yang lama dan harus disimpan dalam suhu 4°C. Larutan EDTA merupakan larutan chelates yang menginaktivasi berbagai macam enzim yang dapat membahayakan DNA. Larutan Tris-Cl berfungsi sebagai agen larutan penyangga yang menjaga pH resuspensi agar tetap pada pH 8. Solution II terdiri atas larutan basa kuat NaOH dan SDS. Larutan basa kuat digunakan karena isolasi plasmid ini menggunakan metoda alkalin lisis sehingga DNA genome dan plasmid pada bakteri E.coli dapat terdenaturasi dengan
menggunakan senyawa basa kuat. SDS 1% merupakan senyawa detergen yang larut dengan fosfolipid sehingga berfungsi untuk melisiskan dinding sel bakteri. Selain itu larutan SDS juga berfungsi untuk membersihkan DNA dari senyawa protein, sehingga didapatkan plasmid dan DNA genome yang bersih tanpa protein (Tyler, 2013). Solution III merupakan larutan netralisasi yang mempunyai fungsi utama untuk merenaturasi plasmid oleh senyawa potasium asetat dan asam asetat glasial. Selain itu, fungsi dari larutan potassium asetat adalah untuk mengikat seluruh SDS (Sodium dodecyl sulfate) dan mengubahnya menjadi senyawa KDS (Potassium dodecyl sulfate). DNA tidak dapat terenaturasi karena selain memiliki rantai basa yang sangat panjang, DNA terendapkan oleh penambahan senyawa isopropanol. Kemudian, terdapat campuran senyawa EtOH dan TE pada solution III. EtOH berfungsi untuk memisahkan pelet dengan plasmid sehingga plasmid dapat bersih tanpa zat pengotor karena EtOH yang mudah menguap akan memangkat plasmid kearea supernatan. TE berfungsi untuk mengandung senyawa RNAses sehingga memotong seluruh RNA yang tersisa agar tidak terbaca saat dielektroforesis (Tyler, 2013). Secara garis besar terdapat lima tahapan utama dalam isolasi DNA plasmid, yaitu isolasi sel, lisis dinding sel dan membran sel, purifikasi, presipitasi, dan pencucian. Tahapan isolasi digunakan untuk mengisolasi sel yang akan digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel sehingga membentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA kromosomal, DNA plasmid, serta RNA. Selanjutnya dilakukan purifikasi dengan serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Setelah itu dilakukan presipitasi guna mengendapkan kembali DNA plasmid dan menghilangkan isolat lainnya diluar plasmid. Pencucian pun sama halnya untuk menghilangkan isolat lainnya seperti DNA kromosom serta RNA. (Schmid, 2003) Berdasarkan hasil elektroforesis yang didapatkan dari isolasi plasmid PGEMT-easy, kelompok kami yaitu kelompok 13 mendapatkan hasil yang
cukup baik, artinya keberadaan plasmid PGEMT-easy telah berhasil dikonfirmasi. Hal tersebut terlihat bahwa terdapat dua band yang mengindikasikan bahwa DNA plasmid telah berhasil di isolasi. Jika dicocokan dengan leader 1 kb yang ditunjukan pada gambar 4.3, terlihat bahwa hasil elektroforesis kelompok kami kurang lebih 1500 bp.
Gambar 4.3 Hasil elektroforesis kelompok 13 yang dicocokan dengan Leader (Dokumentasi pribadi, 2014) dan (thermosciencetificbio, 2012)
Jika dibandingkan dengan kelompok lain pun terlihat hasil yang sama, plasmid telah berhasil di isolasi, hanya saja kelompok 11 menunjukan hasil yang smear. Menurut Dube (2010), penyebab munculnya smear pada percobaan elektroforesis DNA diantaranya adalah: 1. Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis. Hal ini dapat diatasi dengan mengurangi jumlah DNA yang digunakan. Dengan membatasi jumlah komponen DNA yang diteliti, hasil elektroforesis yang didapat tentu akan lebih akurat.
2. Terlalu banyak garam pada DNA. Seharusnya garam digunakan pada takaran yang memang dianjurkan dan sesuai literature selama proses elektroforesis DNA. Kelebihan garam malah akan mengganggu proses elektroforesis dan memengaruhi hasil yang akan didapat. Kondisi ini dapat diatasi dengan teknik presipitasi garam berlebih menggunakan etanol. 3. DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease. 4. Ban DNA kecil berdifusi ketika pewarnaan. Kondisi ini dapat diatasi dengan cara menambahkan etidium bromida saat elektroforesis. 5. Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. Penggunaan voltase listrik yang lebih dari 20 V/cm selama proses elektroforesis dapat memengaruhi hasil yang didapat di akhir percobaan. Oleh sebab itu, selalu gunakan voltase listrik dalam rentang di bawah 20V/cm serta selalu ingat untuk menjaga temperature lingkungan tetap di bawah 300 C selama elektroforesis berlangsung, tujuannya adalah agar DNA tidak terdenaturasi akibat suhu yang terlalu tinggi. 6. DNA terkontaminasi protein.Protein dan zat organik lainnya (bahkan fenol sekalipun) akan menyebabkan hasil elektroforesis yang didapat menjadi smear karena kesemua bahan tersebut akhirnya menjadi kontaminan bagi DNA. Kontaminan tersebut yang menyebabkan hasil elektroforesis yang didapattidak jelas dan buruk akibat DNA yang dielektroforesis tidak sepenuhnya DNA murni.Hal ini dapat diatasi dengan cara
ekstraksi
protein menggunakan fenol.
4.2.2 Amplifikasi PCR Dalam percobaan ini digunakan beberapa komponen untuk membantu mempermudah proses PCR. Komponen yang digunakan diantaranya adalah enzim Taq-pol, dNTPs, DNA template, dan primer. Taq polimerase atau Taq pol adalah salah satu DNA polimerase yang diambil dari bakteri termofilik yaitu Thermus aquaticus. Bakteri ini dipilih karena mampu hidup dalam suasana ekstrem berupa suhu yang sangat panas, sama seperti kondisi
saat DNA template terjadi denaturasi, sehingga mampu mencegah kerusakan pada DNA template (Cheng dan Zhang, 2008). Komponen kedua yang digunakan adalah dNTPs atau deoxynucleoside triphosphates yang terdiri atas unit-unit basa adenin, guanin, timin, dan sitosin. Menurut Cheng dan Zhang (2008), dNTPs ini berfungsi sebagai building blocks, agar mencegah terjadinya smear. Komponen selanjutnya adalah DNA template sebagai sampel yang mengandung sekuensi DNA target. Pada reaksi awalnya, suhu yang tinggi diberikan pada DNA rantai ganda mejadi rantai tunggal. Komponen terakhir adalah primer yang berperan sebagai untaian DNA tunggal yang pendek dan berperan sebagai komplementer yang mengisi DNA template. Menurut Lo (2006), pada dasarnya PCR terjadi dalam tiga tahap, yakni Denaturasi akibat adanya panas yang diberikan kepada DNA, Annealing atau penempelan DNA primer dalam temperatur yang sangat dingin, dan yang terakhir adalah pemanjangan/ekstensi dari DNA primer yang telah dilakukan proses annealing dengan menggunakan DNA polimerase. Berikut ini adalah tahap-tahap yang terjadi dalam PCR :
Gambar 4.4
DNA template disiapkan
(Campbell, 2007)
Gambar 4.5 Proses denaturasi memisahkan rantai ganda DNA (Campbell, 2007)
Gambar 4.6 Primer menempel (annealing) pada masing-masing DNA template (Campbell, 2007)
Gambar 4.7 Rantai nukleotida yang baru terbentuk sebagai hasil ekstensi (Campbell, 2007)
Gambar 4.8 Amplifikasi atau perbanyakan rantai nukleotida (Campbell, 2007)
Kelima gambar di atas telah berurutan untuk menunjukkan satu siklus amplifikasi atau perbanyakan nukleotida DNA. Menurut Campbell (2007), pada gambar 4.5, terlihat proses denaturasi, yaitu pemecahan rantai ganda DNA menjadi rantai tunggal, agar lebih mudah untuk ditempeli primer pada proses selanjutnya. Gambar 4.6 memperlihatkan proses annealing atau penempelan primer pada ujung 5’ dalam setiap rantai DNA nya. Setelah itu terjadi ekstensi yang ditunjukkan oleh gambar 4.7, ekstensi ini merupakan pemanjangan primer ke arah yang berlawanan dengan arah saat penempelan primer (annealing). Berdasarkan hasil elektroforesis PCR gen Expansi Musa acuminata, kelompok kami yaitu kelompok 13, tidak mendapatkan hasil yang baik. Seperti yang ditunjukan pada gambar 4.9 berikut,
Gambar 4.9 Hasil elektroforesis PCR kelompok 13 yang dicocokan dengan Leader (Dokumentasi pribadi, 2014) dan (thermosciencetificbio, 2012)
Diduga kami tidak berhasil dalam memperoleh amplifikasi DNA dari gen tersebut. Hal ini dapat terjadi karena kesalahan dalam penentuan konsentrasi bahan yang digunakan dalam pembuatan PCR mix. Serta pengambilan sampel DNA yang tidak baik, sehingga konsentrasi DNA kurang bahkan tidak ada. (Dube, 2010). Kelompok yang sama kondisinya seperti kelompok kami adalah kelompok 11, 12, dan 14. Sedangkan kelompok lainnya telah berhasil mengamplifikasi gen Expansi Musa acumilata karena terdapatnya dua band yang ditunjukan pada hasil elektroforesis.
4.2.3 Elektroforesis Beberapa reagen yang digunakan dalam percobaan elektroforesis diantaranya agarosa, TAE, loading buffer, dan Etidium Bromidam, masingmasing reagen memiliki peran dan fungsi tersendiri yang amat mendukung dan menentukan hasil akhir dari percobaan. Reagen loading dye memiliki tiga fungsi utama yaitu untuk menterminasi
reaksi
enzimatik
sebelum
elektroforesis,
menyediakan
kerapatan agar sampel dapat bergerak dalam sumur gel, dan menyediakan cara untuk melihat pergerakan molekul DNA saat elektroforesis (Surzycki, 2003). Loading dye mengandung bromofenol biru, xylene cyanol, dan orange G yang digunakan untuk memvisualisasi sampel DNA. Pada agarosa 1 %, xylene cyanol bergerak dengan kecepatan setara dengan 4000 bp DNA, bromofenol biru bergerak dengan kecepatan setara dengan 200 bp DNA, dan orange G bergerak dengan kecepatan setara dengan 200-400 bp DNA. Biasanya loading dye juga mengandung gliserol atau sukrosa untuk meningkatkan kerapatan DNA sehingga dapat masuk dan bergerak dalam sumur gel (Elkins, 2013).
Buffer TAE (Tris-Asetat-EDTA) berperan dalam pemberian sensitivitas dan kemampuan pemisahan yang tinggi. Buffer TAE memberikan ion untuk konduktivitas listrik sehingga molekul-molekul DNA dapat bererak dengan baik di dalam gel (Mitchelson and Cheng, 2001) selain itu larutan TAE juga berperan sebagai penghantar arus pada media (Yuwono, 2005). Setelah dielektroforesis, DNA divisualisasi menggunakan pewarna etidium bromida.Etidium bromida dapat berikatan dengan kuat pada DNA dan menghasilkan pendar sinar orange ketika dilihat dibawah sinar ultraviolet (Cheng and Zhang, 2008). Karenanya, larutan etidium bromide dapat dikatakan memiliki fungsi sebagai reagen pembantu visualisasi dalam proses elektroforesis DNA (Marks et al, 2000). Terkadang hasil elektroforesis yang didapatkan tidak sesuai dengan yang diharapkan, baik berupa band fragmen yang tidak terlihat maupun muncul smear. Berikut ini hal-hal yang menyeabkan band yang muncul pucat atau bahkan tidak muncul band (Dube, 2010): 1) Kurangnya jumlah atau konsentrasi DNA, dapat diatasi dengan menambahkan jumlah DNA asalkan tidak melebihi 50 ng/ban. 2) DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease. 3) Voltase yang digunakan terlalu rendah. 4) Panjang gelombang sinar ultraviolet yang tidak tepat untuk visualisasi menggunakan pewarna etidium bromida. Untuk hasil yang baik gunakan panjang geombang 254 nm. Hasil lain yang seringkali muncul pada percobaan elektroforesis yang gagal adalah smear. Masih menurut Dube (2010), penyebab munculnya smear pada percobaan elektroforesis DNA diantaranya adalah: 1) DNA terdegradasi akibat kontaminasi nuklease. 2) Terlalu banyak DNA yang dielektoforesis 3) Kondisi elektroforesis yang tidak tepat. 4) Terlalu banyak garam pada DNA 5) DNA terkontaminasi protein 6) Band DNA kecil berdifusi ketika pewarnaan
BAB V KESIMPULAN
Berdasarkan hasil percobaan isolasi DNA plasmid dan amplifikasi gen menggunakan PCR kali ini, dapat ditarik kesimpulan yaitu; 1. DNA plasmid PGEMT-easy telah berhasil di isolasi menggunakan metode alkalin lisis dengan panjang 1500 bp. 2. Amplifikasi promotor gen MaEXPA1 dari DNA plasmid PGEMT-easy yang di isolasi dengan metode PCR tidak berhasil dilakukan.
DAFTAR PUSTAKA Campbell, N., et al. 2007 Biology : Eight Edition. California : Pearson. Cheng, L., Zhang D. Y. 2008. Molecular Genetic Pathology. New Jersey : Humana Press. Haris N ., et al. 2005. Konstruksi Pusaka cDNA dari daun klon karet AVROS 2037 yang Diinfeksi Patogen Corynespora cassiicola. Menara Perkebunan, Volume 2 (73), pp. 44-62. Lo, Dennis., et al. 2006. Clinical Applications of PCR : Second Edition. New Jersey : Humana Press. Reece, J. B., et al. 2012. Campbell Biology Concept and Connections : Concept and Connection. California : Pearson.
