LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM FARMAKOGNOSI FITOKIMIA “ISOLASI SENYAWA MURNI DARI RIMPANG BANGLE (Zingiber purpureum Roxb.)” Roxb.)”
Disusun oleh: (Kelompok 3 A) Batari Wulanning D. S.
1113102000001
Ratih Dara Syadillah
1113102000003
Rahma Atikah Okdiza
1113102000021
Muhammad Akbar S.
1113102000022
Putri Agni Kreativita I.
1113102000023
Visilphy Dimalia
1113102000040
Silviana Adithya
1113102000043
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA DESEMBER/2015
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ................................................................................................................................................. 1 ABSTRAK .................................................................................................................................................... 2 PENDAHULUAN ........................................................................................................................................ 3 1.1.
Latar Belakang .............................................................................................................................. 3
1.2.
Rumusan Masalah ......................................................................................................................... 4
1.3.
Tujuan ........................................................................................................................................... 4
1.4.
Manfaat ......................................................................................................................................... 4
TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................................................... 5 2.1
Uraian Tanaman ............................................................................................................................ 5
2.2
Ekstraksi ........................................................................................................................................ 9
2.3
Partisi .......................................................................................................................................... 11
2.4
Kromatografi ............................................................................................................................... 13
METODOLOGI PRAKTIKUM ................................................................................................................. 31 3.1.
Waktu dan Tempat ...................................................................................................................... 31
3.1.
Alat dan Bahan ............................................................................................................................ 31
3.2.
Metode Praktikum ....................................................................................................................... 32
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................................................... 38 4.1
Hasil ............................................................................................................................................ 38
4.2
Pembahasan ................................................................................................................................. 44
PENUTUP .................................................................................................................................................. 61 5.1.
Kesimpulan ................................................................................................................................. 61
5.2.
Saran ........................................................................................................................................... 61
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................................. 62
1
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ................................................................................................................................................. 1 ABSTRAK .................................................................................................................................................... 2 PENDAHULUAN ........................................................................................................................................ 3 1.1.
Latar Belakang .............................................................................................................................. 3
1.2.
Rumusan Masalah ......................................................................................................................... 4
1.3.
Tujuan ........................................................................................................................................... 4
1.4.
Manfaat ......................................................................................................................................... 4
TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................................................... 5 2.1
Uraian Tanaman ............................................................................................................................ 5
2.2
Ekstraksi ........................................................................................................................................ 9
2.3
Partisi .......................................................................................................................................... 11
2.4
Kromatografi ............................................................................................................................... 13
METODOLOGI PRAKTIKUM ................................................................................................................. 31 3.1.
Waktu dan Tempat ...................................................................................................................... 31
3.1.
Alat dan Bahan ............................................................................................................................ 31
3.2.
Metode Praktikum ....................................................................................................................... 32
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................................................... 38 4.1
Hasil ............................................................................................................................................ 38
4.2
Pembahasan ................................................................................................................................. 44
PENUTUP .................................................................................................................................................. 61 5.1.
Kesimpulan ................................................................................................................................. 61
5.2.
Saran ........................................................................................................................................... 61
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................................. 62
1
ABSTRAK
Bahan alam selama ini telah selalu menjadi hal yang menarik bagi dunia sains terutama dunia farmasi sendiri. Berbagai penelitian terhadap bahan alam terus dilakukan, salah satunya pada tanaman bangle. Bangle ( Zingiber Zingiber cassumunar ) adalah salah satu tanaman obat tradisional Indonesia. Isolasi senyawa dilakukan untuk mempelajari lebih lanjut senyawa-senyawa yang terdapat dalam bahan alam. Praktikum ini dilakukan untuk mempelajari proses isolasi senyawa dari bahan alam, salah satunya adalah pada rimpang bangle. Metode yang digunakan untuk mengekstraksi senyawa metabolit sekunder rimpang bangle pada praktikum ini adalah maserasi dengan menggunakan pelarut metanol menghasikan rendemen sebesar
0,941% dilanjutkan
partisi dengan n-heksan kemudian dipartisi kembali dengan etil asetat. Pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan Kromatografi Kolom (KK), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dan Kromatografi Lapis Tipis (KLTP). Berdasarkan hasil KLT, dipilih fraksi N-Heksan untuk dilanjutkan pemisahan dengan kromatografi kolom diperoleh 36 vial vial terbagi kedalam 7 fraksi bereda dari hasil pemisahan dengan kromatografi kolom (n-heksan 100%, n-heksan: etil asetat (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6)). Fraksi yang digunakan untuk kromatografi lapis tipis preparatif adalah fraksi 13 dan 14 menghasilkan 2 pita yang berfosforesensi pada UV 254 berwarna keabuabuan dan 1 pita berflourorsensi berwarna biru pada UV 365. Hasil uji kemurnian senyawa terhadap 3 isolat yang didapatkan menggunkan KLT menunjukkan bahwa dari 3 isolat yang didapat dengan proses kromatografi lapis tipis preparative, hanya 1 isolat yang sudah murni, sedangkan isolat lainnya masih terdiri dari beberapa senyawa. Selain itu, dari 3 isolat tersebut juga terdapat senyawa yang berfluoresensi pada 2 dari 3 isolat tersebut.
2
BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Indonesia dikenal sebagai negara yang sumber daya hayati terbesar yang tersebar dari sabang hingga marauke, oleh karena itu, indonesia memiliki potensi yang sangat besar dalam penyediaan bahan baku obat. Kekayaan alam tumbuhan obat Indonesia terdiri atas 30.000 jenis tumbuhan dari total 40.000 jenis tumbuhan di dunia, dimana 940 jenis diantaranya merupakan tumbuhan berkhasiat obat dan jumlah ini merupakan 90% dari jumlah tumbuhan obat di kawasan asia (BPOM RI,2009: Nugroho,2010). Bahan alam selama ini telah selalu menjadi hal yang menarik bagi dunia sains terutama dunia farmasi sendiri. Berbagai penelitian terhadap bahan alam terus dilakukan, salah satunya pada tanaman bangle. Bangle ( Zingiber cassumunar ) adalah salah satu tanaman obat tradisional Indonesia. Masyarakat Indonesia sering menggunakan bangle untuk pengobatan karena dipercaya memiliki khasiat sebagai obat penurun panas, sakit kepala, masuk angin, batuk berdahak, konstipasi, dan perut nyeri. Bangle digolongkan sebagai rempah-rempah yang memiliki khasiat obat. Masa panen dilakukan setelah tanaman berumur satu tahun. Perkembangbiakan dengan stek rimpang (Depkes RI, 1977).Tanaman ini diduga mengandung zat anti bakteri sehingga dimungkinkan untuk digunakan sebagai pengganti antibiotika konvensional (Raharjoyo dan Gunardi, 2009). Rimpang Bangle mengandung beberapa senyawa kimia antara lain alkaloid, flavonoid, minyak atsiri, saponin, pati, tanin, steroid/triterpenoid, lemak dan gula (Wijayakusuma et al., 1997). Alkaloid secara umum bersifat detoksifikasi yang dapat menetralisir racun di dalam tubuh. Senyawa golongan flavonoid asal tanaman bangle merupakan senyawa peluruh lemak melalui aktivitas lipase (Darusman et al., 2001). Flavonoid berfungsi sebagai antioksidan, sistem kekebalan tubuh, melancarkan peredaran darah ke seluruh tubuh dan mencegah terjadinya penyumbatan pada pembuluh darah (Harmanto, 2004). Saponin menjadi sumber antibakteri dan antivirus, meningkatkan sistem kekebalan tubuh, mengurangi kadar gula dalam darah (Robinson, 1995).
3
Dari hal tersebut, praktikum ini dilakukan untuk mengetahui teknik isolasi senyawa bahan alam yang terkandung dalam rimpang bangle (Zingiber cassumunar) antara lain adalah senyawa fenilbutanoid. Metode yang digunakan untuk mengekstraksi senyawa metabolit sekunder pada rimpang bangle adalah maserasi dengan menggunakan pelarut metanol menghasikan rendemen sebesar 0,941% dilanjutkan partisi dengan n-heksan kemudian dipartisi kembali dengan etil asetat. Pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan Kromatografi Kolom (KK), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dan Kromatografi Lapis Tipis (KLTP). Berdasarkan hasil KLT, dipilih fraksi N-Heksan untuk dilanjutkan pemisahan dengan kromatografi kolom diperoleh 36 vial terbagi kedalam 7 fraksi bereda dari hasil pemisahan dengan kromatografi kolom (n-heksan 100%, n-heksan: etil asetat (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6)). Fraksi yang digunakan untuk kromatografi lapis tipis preparatif adalah fraksi 13 dan 14 menghasilkan 2 pita yang berfosforesensi pada UV 254 berwarna keabu-abuan dan 1 pita berflourorsensi berwarna biru pada UV 365. 1.2. Rumusan Masalah
Bagaimana metode untuk melakukan isolasi senyawa murni pada tanaman Bangle ( Zingiber cassumunar )
1.3. Tujuan
1. Mampu melakukan isolasi senyawa murni dari tanaman Bangle ( Zingiber cassumunar ) 2. Mengetahui dan memahami teknik-teknik yang digunakan untuk mengisolasi senyawa murni dari bahan alam, salah satunya rimpang tanaman Bangle ( Zingiber cassumunar )
1.4. Manfaat
Mendapatkan senyawa murni hasil isolasi dari tanaman Bangle (Zingiber cassumunar )
4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Tanaman 2.1.1 Deskripsi Tanaman Bangle
Bangle tumbuh di daerah Asia tropis, dari India sampai Indonesia. Di Jawa dibudidayakan atau ditanam di pekarangan dan pada tempat-tempat yang cukup mendapat sinar matahari, mulai dari dataran rendah sampai 1.300 m d.p.l. Pada tanah yang tergenang atau becek, pertumbuhannya akan terganggu dan rimpang cepat membusuk (Depkes RI, 1977). Bagian tanaman bangle yang umumnya digunakan oleh masyarakat yaitu daun dan rimpang bangle. Bangle telah lama digunakan sebagai obat tradisional dalam bentuk jamu dan dipercaya dapat menyembuhkan penyakit secara alami dan aman, dapat melangsingkan perut. Rasa rimpangnya tidak enak, pedas dan pahit. Bangle digolongkan sebagai herba yang memiliki khasiat obat. Panenan dilakukan setelah tanaman berumur satu tahun. Perbanyakan dengan stek rimpang. 2.1.2 Morfologi dan Taksonomi Bangle
Bangle merupakan herba semusim, tumbuh tegak, tinggi 1 - 1,5 m, membentuk rumpun yang agak padat, berbatang semu, terdiri dari pelepah daun yang di pinggir ujungnya berambut sikat. Daun tunggal, letak berseling. Helaian daun lonjong, tipis, ujung runcing, pangkal tumpul, tepi rata, berambut halus, jarang, pertulangan menyirip, panjang 23 - 35cm, lebar 20 - 40 mm, warna hijau. Bunganya bunga majemuk, bentuk tandan, keluar diujung batang, panjang gagang sampai 20 cm. bagian yang mengandung bunga bentuknya bulat telur atau seperti gelondong, panjang 6 - 10 cm, lebar 4 - 5 cm (Depkes RI, 1977). Bibir bunga bentuknya bundar memanjang, warnanya putih atau pucat. Bangle mempunyai rimpang yang menjalar dan berdaging, bentuknya hampir bundar sampai jorong atau tidak beraturan, tebal 2-5 mm. permukaan luar tidak rata, berkerut, kadangkadang dengan parut daun, berwarna cokelat muda kekuningan, bila dibelah berwarna kuning muda sampai kuning kecokelatan. Rasanya tidak enak, pedas dan pahit. Bangle digolongkan sebagai rempah-rempah yang memiliki khasiat obat. Masa panen dilakukan 5
setelah tanaman berumur satu tahun. Perkembangbiakan dengan stek rimpang (Depkes RI, 1977). Berikut merupakan taksonomi dari tanaman bangle:
Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi
: Angiospermae
Kelas
: Monocotyledoneae
Bangsa
: Zingiberales
Suku
: Zingiberaceae
Marga
: Zingiber
Jenis
: Zingiber purpureum Roxb (Backer, 1968)
Sinonim
: Zingiber Cassumunar Roxb (Syamsuhidayat dan Hutapea,
(1991).
Nama Daerah
: mugle (Aceh), banlai (Minangkabau), bungle (Batak),
panglai (Sunda), kunyit bolai (Melayu), bengle (Jawa Tengah), unir pakei
(Ambon).
Nama Asing
: purple ginger (Inggris).
Gambar. 1 Rimpang dan Tanaman Bangle
(http:tanamanobatherbal.com/2009/06/bangle.html)
6
2.1.3 Kandungan Kimia dan Manfaat Bangle
Kandungan kimia dari rimpang bangle adalah minyak atsiri (sineol, pinen), damar, pati dan tanin. Rimpang bangle mengandung saponin, flavonoid dan minyak atsiri (DepKes RI, 1991). Kandungan minyak atsiri rimpang bangle berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Gunardi (2002) antara lain β Pinen, α terpinen, ocimen, terpinen-4-
ol-caren, α Zingiberen dan trans β fasnesen. Rimpang Bangle berfungsi untuk mengobati demam, sakit kepala, batuk berdahak, perut nyeri, masuk angin, sembelit, sakit kuning, cacingan, rheumatik, ramuan jamu pada wanita setelah melahirkan, mengecilkan perut setelah melahirkan dan kegemukan. Zingiber cassumunar Roxb memiliki aktivitas sebagai Antimikroba, insektisida,
antikanker, anti oksidan, Anti inflamasi, dan Antikolinesterase. (Cb Singh, dkk . 2015)
Antimikrobial
Terpineol-4-ol
Sabinene Zerumbone
Antikanker
(+/-)trans-3-(3′,4′-dimethoxyphenyl)-4- [(E) 3′′′, 4′′ dimethoxystyryl] cyclohex-1-ene
7
Antioksidan
Cassumunarin A
Cassumunarin B
Cassumunarin C
Antiinflamasi
(E)-4-(4-Hydroxy-3- methoxyphenyl) but-2-en-1-ol
(E)-1-(3, 4-Dimethoxyphenyl) butadiene, DMPBD;
8
2.2 Ekstraksi
Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat aktif terdapat di dalam sel, namun sel tanaman dan hewan berbeda demikian pula ketebalannya, sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut tertentu dalam mengekstraksinya. Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan substansi dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Ekstraksi adalah pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan dengan bantuan pelarut. Ekstraksi juga merupakan proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agen. Pemisahan terjadi atas dasar kemampuan larut yang berbeda dari komponen-komponen dalam campuran. Ekstraksi merupakan proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang berbeda (Rahayu, 2009). Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditentukan. Sebagian besar ekstrak dibuat dengan mengekstraksi bahan baku obat secara perkolasi. Seluruh perkolat biasanya dipekatkan secara destilasi dengan menggunakan tekanan (Ditjen POM, 1995). 2.2.1 Metode Ekstraksi
Jenis ekstraksi bahan alam yang sering dilakukan adalah ekstraksi secara panas dengan cara refluks dan penyulingan uap air dan ekstraksi secara dingin dengan cara maserasi, perkolasi dan alat soxhlet. (Dirjen POM, 1986) Adapun cara-cara ekstraksi, yaitu : a. Ekstraksi secara soxhletasi Ekstraksi dengan cara ini pada dasarnya ekstraksi secara berkesinambungan. Cairan penyari dipanaskan sampai mendidih. Uap penyari akan naik melalui pipa samping, kemudian diembunkan lagi oleh pendingin tegak. Cairan penyari turun untuk menyari zat aktif dalam simplisia. Selanjutnya bila cairan pen yari mencapai sifon, maka seluruh cairan akan turun ke labu alas bulat dan terjadi proses sirkulasi. Demikian seterusnya 2 sampai zat aktif yang terdapat dalam simplisia tersari seluruhnya yang ditandai jernihnya cairan yang lewat pada tabung sifon. 9
b. Ekstraksi secara perkolasi Perkolasi dilakukan dengan cara dibasahkan 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok, menggunakan 2,5 bagian sampai 5 bagian cairan penyari dimasukkan dalam bejana tertutup sekurang-kurangnya 3 jam. Massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, ditambahkan cairan penyari. Perkolator ditutup dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dengan kecepatan 1 ml permenit, sehingga simplisia tetap terendam. Filtrat dipindahkan ke dalam bejana, ditutup dan dibiarkan selama 2 hari pada tempat terlindung dari cahaya. c. Ekstraksi secara maserasi Maserasi dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia dengan derajat yang cocok ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan penyari 75 bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya sambil diaduk sekali-kali setiap hari lalu diperas dan ampasnya dimaserasi kembali dengan cairan penyari. Penyarian diakhiri setelah pelarut tidak berwarna lagi, lalu dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan pada tempat yang tidak bercahaya, setelah dua hari lalu endapan dipisahkan. d. Ekstraksi secara refluks Ekstraksi dengan cara ini pada dasarnya adalah ekstraksi berkesinambungan. Bahan yang akan diekstraksi direndam dengan cairan penyari dalam labu alas bulat yang dilengkapi dengan alat pendingin tegak, lalu dipanaskan sampai mendidih. Cairan penyari akan menguap, uap tersebut akan diembunkan dengan pendingin tegak dan akan kembali menyari zat aktif dalam simplisia tersebut, demikian seterusnya. Ekstraksi ini biasanya dilakukan 3 kali dan setiap kali diekstraksi selama 4 jam. e. Ekstraksi secara penyulingan Penyulingan dapat dipertimbangkan untuk menyari serbuk simplisia yang mengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih yang tinggi pada tekanan udara normal, yang pada pemanasan biasanya terjadi kerusakan zat aktifnya. Untuk mencegah hal tersebut, maka penyari dilakukan dengan penyulingan. (Harbone, 1987; Dirjen POM, 1986) 2.2.2 Maserasi
Prinsip maserasi adalah ekstraksi zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam pelarut yang sesuai selama beberapa hari pada temperature kamar terlindung dari cahaya, pelaut akan masuk kedalam sel tanaman melewati dididing sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan 10
didala sel dengan diluar sel. Larutan yang konentrasinya tinggi akan terdeak keluar dan diganti oleh pelarut dengan konsentrasi redah (proses difusi). Peristiwa tersebut akan berulang sampai terjadi keseimbangan antara larutan didalam sel dan larutan diluar sel (Ansel, 1989). Maserasi biasanya dilakukan pada temperatur 15o-20 o C dalam waktu selama 3 hari sampai bahan-bahan yang larut , melarut (Ansel, 1989). Pada umumnya maserasi dilakukan dengan cara 10 bagian simplisia dengan derajat kehalusan yang cocok, dimasukan kedalam bejan kemudian dituangi dangan 75 bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya, sambil berulang-ulang diaduk. Setelah 5 hari diserkai, ampas diperas. Pada ampas ditambah cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup dan dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Kelebihan maserasi dapat digunakan untuk jenis senyawa tahan panas ataupun tidak tahan panas. Selain itu tidak diperlukan alat yang spesifik, dapat digunakan apa saja untuk proses perendaman. Kekurangan maserasi adalah membutuhkan waktu yang lama, biasanya paling cepat 3 x 24jam, disamping itu membutuhkan pelarut dalam jumlah yang banyak. 2.3 Partisi
Ekstraksi cair-cair adalah proses pemisahan zat terlarut didalam 2 macam zat pelarut yang tidak saling bercampur atau dengan kata lain perbandingan konsentrasi zat terlarut dalam pelarut organik, dan pelarut air. Hal tersebut memungkinkan karena adanya sifat senyawa yang dapat terlarut dalam air dan adapula senyawa yang dapat larut dalam pelarut organik. Ekstraksi cair - cair adalah suatu metode ekstraksi yang menggunakan corong pisah sehingga biasa juga disebut dengan ekstraksi corong pisah (Anonim, 2012). Alat yang digunakan dalam ekstraksi cair-cair ini adalah corong pisah yang berfungsi untuk memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran antara dua fase pelarut dengan densitas yang berbeda yang tak tercampur. Corong pemisah berbentuk kerucut yang ditutupi setengah bola, mempunyai penyumbat di atasnya dan di bawahnya. Corong pemisah yang digunakan dalam 11
laboratorium terbuat dari kaca borosilikat dan kerannya terbuat dari kaca ataupun teflon. Ukuran corong pemisah bervariasi antara 50 ml sampai 3 L. Dalam skala industri, corong pemisah bisa berukuran sangat besar dan dipasang sentrifuge.
Gambar 2. Corong Pemisah Untuk memakai corong ini, campuran dan dua fase pelarut dimasukkan kedalam corong dari atas dengan corong keran ditutup. Corong ini kemudian ditutup dan digoyang dengan kuat untuk membuat dua fase larutan tercampur. Corong ini kemudian dibalik dan keran dibuka untuk melepaskan tekanan uap yang berlebihan. Corong ini kemudian didiamkan agar pemisahan antara dua fase berlangsung. Penyumbat dan keran corong kemudian dibuka dan dua fase larutan ini dipisahkan dengan mengontrol keran corong. Umumnya salah satu fase berupa larutan air dan yang lainnya berupa organik lipofilik seperti eter, MTBE, diklorometana, kloroforom, ataupun etil asetat. Kebanyakan pelarut organik berada di atas fase air kecuali pelarut yang memiliki atom dari unsur halogen. Pemisahan ini didasarkan pada tiap bobot dari fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada pada bagian dasar sementara fraksi yang lebih ringan akan berada di atas. Tujuannya untuk memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari kandungan yang lain. Senyawa yang bersifat polar akan masuk ke pelarut polar dan senyawa non polar akan masuk ke pelarut non polar. Kata cair-cair berarti bahwa dua cairan yang dicampur di dalam proses ekstraksi. Ini berarti bahwa kedua cairan itu akan membentuk dua lapisan ketika dicampur bersama seperti air dan pelarut organik (dietil eter, diklorometan, n – butanol, dll.). Senyawa-senyawa
12
yang lebih larut dalam lapisan organik akan tertarik ke lapisan organik sedangkan senyawasenyawa yang lebih larut dalam lapisan air akan tertarik ke air. Jadi ekstraksi cair-cair adalah suatu proses pemisahan yang didasarkan pada kelarutan relatif dan zat terlarut di dalam dua pelarut yang tidak bercampur. Dua pelarut yang tidak bercampur dikocok di dalam corong pisah hingga membentuk dua lapisan antarmuka dan pelarut. Tetesan-tetesan kecil dan kedua pelarut akan menjadikan luas permukaan yang lebih besar dan mempercepat terjadinya kesetimbangan zat terlarut antara dua sistem pelarut. Proses ini disebut ekstraksi atau partisi sampel antara dua pelarut. Pengocokan dihentikan dan pelarut yang tidak bercampur akan memisah. Dimana zat terlarut melarut dengan mudah dan menjadi lebih pekat di dalam pelarut dimana kelarutannya lebih besar. Lapisan cairan yang berada di atas dan yang berada di bawah itu bergantung kepada kerapatan relatif dan kedua pelarut. Pelarut yang lebih ringan akan berada di lapisan atas (Misalnya eter) dan pelarut yang lebih berat akan berada di lapisan bawah (Misalnya air). Pemisahan sebagian terjadi ketika sejumlah zat terlarut mempunyai kelarutan relatif yang berbeda di dalam dua pelarut yang digunakan. Koefisien distribusi menentukan perbandingan konsentrasi dan zat terlarut di dalam masing - masing pelarut. Senyawa senyawa yang dipisahkan tetap kontak di dalam kedua pelarut dan terlarut di dalam masing masing pelarut sesuai dengan perbandingan yang ditentukan oleh koefisien distribusi (Sudjadji, 1988). 2.4 Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan, yang pertama kali dipakai untuk memisahkan zat-zat warna tanaman. Hal ini tersimpulkan dari istilah yang dipakai, kroma adalah zat warna. Kromatografi adalah proses pemisahan berdasarkan pada perbedaan distribusi campuran komponen antara fase gerak dan fase diam. Senyawa yang berinteraksi lemah dengan fase diam akan bergerak lebih cepat melalui sistem kromatografi. Senyawa dengan interaksi yang kuat dengan fase diam akan bergerak sangat lambat (Christian, 1994; Skoog, 1993). Pemisahan dengan teknik ini dijalankan dengan mengadakan mannipulasi atas dasar perbedaan sifat-sifat fisik dari zat-zat yang menyusun suatu campuran. Sifat-sifat fisik tersebut khususnya ialah : 13
1. Adanya tendensi molekul dari suatu zat untuk larut dalam suatucairan. 2. Adanya tendensi molekul dari suatu zat untuk dapat teradsorbsi pada butir-butir zat padat yang halus dengan permukaan yang halus. 3. Adanya tendensi molekul dari suatu zat untuk masuk ke fase uap atau menguap. Karena perbedaan satu atau lebih dari sifat-sifat fisik tadi, campuran berbagai zat dapat dipisahkan dalam suatu system yang bergerak secara kontinyu. 2.4.1 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik,
aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran cairan, biasanya pelarut organi dan kadang-kadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan/meratakan fase diam (adsorbent=penjerap=sorbent) diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium. 1. Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya, ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, yaitu ukuran (diameter) dalam mesh dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran :
Silika gel Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40μm. Makin kecil diameter akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 3001000 m2/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran:
Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai 14
pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.
Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timahkadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 , nm).
Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika gel N.
Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi.
Silika gel untuk keperluan pemisahan preparative
Alumina Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk kelompok fase diam yang beraktifitas tinggi. Alumina yang digunakan TLC bersifat sedikit basa (pH 9), ada juga yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang bersifat asam (pH 4). Juga digunakan CaSO4 sebagai pengikat yang dapat menurunkan bebasaan pada tinggkat tertentu. Sepertihalnya Silica gel, alumina dikenal dengan atau tanpapengikat dan bahan indicator. Pemberian namapun identik dengan silika gel dengan code G.H.P.F.
Selulosa Menggunakan selulosa sebagai fase diam maka mekanisme pemisahannya sama seperti mekanisme pemisahan pada kromatografi kertas. Perbedaannya hanya serat selulosenya pada TLC/KLT lebih pendek dari pada serat selulosa kromatografi kertas. Panjang serat bervariasi 2-20 μ. Serat lebih pendek menyebabkan difusi rendah selama elusi dan menghasilkan bercak yang sempit (lebih kecil). Selulosa untuk TLC terdapat dim bentuk selulosa serat asli (contohnya MN 300) dan selulosa mikrokristal (contohnya Avicel). Fase diam selulosa biasanya digunakan senyawa yang bersifat polar.
2. Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organic (tabel). Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah 15
partisi. Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang
bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar. Tabel 1 : Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fase gerak 3. Penyiapan dan penotolan sampel
Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hamper pelarut organik dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada umumnya ditotolkan 1-20 μl larutan yang mengandung 50-100 μg sample tiap bercak untuk kromatografi absorbsi dan 5- 2Qμg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan dapat dilakukan dengan gelas kapiler yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk keperluan kuantitatif digunakan quantitative microsyringe. Kepada plat TLC konvensional (20X20 cm, 5 X 20 cm, tebal 0,2 mm)
sample ditotolkan sebagai bercak bulat atau garis, 1,5-2,0 cm dari tepi bawah. Untuk 16
memudahkan penotolan dibuat garis lemah dengan pensil, disebut garis awal. Pada garis awal ini biasanya ditotolkan bercak-bercak dengan garis tengah 3-6 mm, bercak bercak tadi diusahakan diameternya seragam. Penotolan bercak pada plat TLC dapat dilakukan berulang-ulang dan haras berhati-hati dijaga plat tidak rusak. Penotolan sample yang terlalu banyak (over loaded) menyebabkan bercak hasil pengembangan berbentuk tidak bulat (asimetri) dan perubahan harga Rf. Bila totolan sample sample telah kering maka plat siap untuk dielusi / dikembangkan. 4. Pengembangan (Elusi)
Hampir semua TLC dikembangkan dengan cara menaik dalam bejana (chamber) pengembang dari gelas. Di dalam bejana ini dimasukkan fase gerak hingga kedalaman 0,5 cm, pada dinding sebelah dalam bejana ditempelkan kertas saring setinggi 20 cm yang ujung bawahnya tercelup fase diam. Fase diam akan merambat keatas membasahi kertas saring, dengan demikianruangan dalam bejana tertutup ini akan lebih cepat dijenuhi dengan uap pelarut. Setelah ruangan dalam bejana jenuh dengan uap fase gerak (terjadi kesetimbangan), plat TLC dimasukkan dimulai pengembangan atau elusi. Bercak sample pada garis awal jangan sampai tercelup dalam fase gerak. Fase gerak akan merambat naik membawa komponen sample. Kecepatan merambat tiap-tiap komponen berbeda tergantung kekuatan persaingan ikatan hydrogen yang terjadi antara fase diam-senyawa (komponen)-fase gerak. Komponen yang membentuk ikatan hydrogen lebih kuat dengan fase gerak akan terelusi lebih cepat atau merambat lebih cepat. Sebaliknya kalau ikatan hidrogennya lebih kuat dengan fase diam, komponen akan lebih lama tertahan fase diam atau merambat lambat. Pengembangan dihentikan pada saat fase gerak mencapai jarak tertentu, biasanya 1 cm sebelum ujung akhir plat. Batas dicapainya fase gerak segera ditandai dengan pensil sebagai garis akhir. Lebih baik batas akhir ini dibuat dahulu sebelum pengembangan, bila pelarut mencapai garis akhir, plat segera diangkat dan dikeluarkan dari bejana. Cara-cara pengembangan yang lain adalah :
Pengembangan berulang, yaitu plat yang baru saja dielusi dikeringkan kemudian dielusi kembali dengan fase gerak yang sama.
17
Pengembangan dua dimensi, yaitu plat dikembangkan seperti biasa, setelah itu dikeringkan dan pelat diputar 90° kemudian dikembangkan dengan fase gerak berbeda (pemisahan flavone "Harbone")
Pengembangan sirkular. Contoh cara pengembangan ini adalah pada kromatotorn, sebenarnya termasuk kromatografi planar juga. Perbedaan dengan KLT adalah cara pengembangannya yaitu kromatotorn dikembangkan dengan cara dipusingkan pada kecepatan tertentu. Sampel ditotolkan pada daerah dekat sumbu putar, kemudian sambil dipusingkan fase gerak diteteskan dan diatur kecepatannya, fase gerak ini akan keluar menetes dibagian tepi pelat yang dipusing tersebut.
5. Pengamatan (mendeteksi) bercak / visualisasi
Cara mengamati bercak pada TLC dapat digolongkan menjadi dua : Pertama dengan cara merusakkan / mereaksikan komponen/senyawa yang ada bercak itu dan Kedua tanpa merusakkan komponen / senyawa. Cara pertama dengan menyemprotkan pereaksi penanda. Banyak pereaksi-pereaksi yang digunakan dapat dilihat dalam literature dan dijual dipasaran (niaga). Contoh pereaksi semprot yang umum untuk senyawa organik adalah asam sulfat dalam metanol, selanjutnya bercak dipanaskan di dalam oven, sebaiknya digunakan oven yang ada jendela kacanya sehingga dapat diikuti perubahan bercak selama pemanasan menjadi bercak warna hitam. Pada dasarnya adalah reaksi oksidasi pada senyawa organic oleh asam sulfat. Pereaksi lain adalah dengan disemprot dengan larutan lodium dan paling mudah adalah dengan memasukkan plat kedalam bejana yang berisi uap lodium (Kristal lodium diletakkan dalam bejana, tidak merusak 75% senyawa). Contoh pereaksi semprot dan penggunaannya dapat dilihat pada tabel. Cara ke dua, yang tidak merusak komponen/ senyawa di bercak. Untuk senyawa berwarna atau berpendar dibawah lampu UV (berfluoresensi) tidak ada masalah menggunakan silika tanpa tambahan zat berpendar. Sedang untuk senyawa yang tidak berpendar dibawah lampu UV digunakan fase diam dengan tambahan zat berpendar.
18
Tabel 2: Macam pereaksi warna / penanda dan penggunaannya 6. Analisis Kualitatif
KLT mempunyai kontribusi yang signifikan pada analisis kualitatif, walaupun masih perlu data pendukung lainnya. Untuk analisis kualitatif diperlukan senyawa murni pembanding. Sampel dan senyawa pembanding dilarutkan pada pelarut yang sama, Kemudian laratan sampel ditotolkan pada ujung pelat KLT, 2 cm sejajar dengannya ditotokan larutan senyawa murni dan disebelahnya lagi ditotolkan campuran sampel dan senyawa pembanding. Kromatogram diangkat diberi tanda batas akhir yang ditempuh fase gerak. Diinventarisasi nilai Rf dan Rr. Senyawa yang mempunyai nilai Rf yang sama dengan nilai Rf senyawa pembanding dan pada pengulangan elusi dengan sistim berbeda tetap memberikan nilai Rf yang sama, maka dapat disimpulkan sementara senyawa tersebut identik dengan senyawa pembanding. Rf adalah jarak yang ditempuh senyawa (bercak) dibagi dengan jarak yang ditempuh fase gerak. hRf adalah Rfx 100. Rr adalah jarak yang ditempuh senyawa sample dibagi dengan jarak yang ditempuh senyawa pembanding menggunakan sistim yang sama.
19
7. Analisis Kuantitatif
Ketepatan dan ketelitian KLT untuk analisis kuantitatif lebih rendah bila dibandingkan dengan kromatografi gas dan kromatografi kinerja tinggi. Namun untuk keperluan tertentu sudah memadahi. Dibedakan dua cara:
Bercak langsung diukur Dengan dasar adanya hubungan antara luas bercak dengan banyaknya senyawa terlarut maka senyawa dapat diukur kadarnya dengan mengukur luas bercak. Cara dibedakan lagi: a. Tanpa menggunakan kurva baku
Menurut Purdy & Truter: akar luas bercak berbanding lurus dengan logaritma(lO) berat senyawa yang ada. Untuk menghitung dengan cara ini maka perlu dibuat tetapan untuk senyawa pada sistem yang tertentu. b. Menggunakan kurva baku
Dibuat kurva hubungan kadar dan luas bercak dari senyawa murni pembanding. Akan diperoleh persamaan garis lurus Y = bX + a. Selanjutnya luas bercak sampel dapat dihitung. Adapun urutan kerja dapat disusun sbb : 1* Dibuat larutan mengandung senyawa murni yang akan dianalisis dengan 3 macam konsentrasi yang diketahui. 2* Dibuat larutan sample pada kadar tertentu sehingga setelah dielusi memberikan bercak yang bulat (ideal). 3* Ke 4 larutan ( 1 sampel, 3 lart baku) ditotolkan secara duplo pada lempeng yang sama (20X20 cm). Perlu diperhatikan: - penotolan tegak lurus dengan alat suntik mikro, gelas kapiler. - banyak larutan 5-10 pi. - sekali penotolan saja dengan volume yang sama. 4* Lempeng dielusi / dikembangkan sampai jarak yang telah ditentukan (1020cm) didalam bejana yang dijenuhi fase gerak. Kemudian ditampakkan/ divisualisasikan degan cara yang sesuai.
20
5* Luas bercak diukur pada alat densitometer. Dibuat kurva hubungan kadar dann luas kemudian dibuat persamaan garis lurus. Kadar senyawa dalam dapat ditetapkan.
Bercak diambil (dikerok) Cara ini akan memberikan ralat yang timbul karena memindahkan / mengerok dan elusi. Ditentukan letak bercak dengan cara yang tidak merusak, mengerok bercak beserta fase diam, kemudian diekstraksi dengan alat yang diperoleh diukur kadarnya dengan spektrometri atau cara lain yang sesuai. Urutan kerja dapat disusun sebagai berikut: 1*Sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, demikian juga senyawa murni (pembanding) dilarutkan dalam pelarut yang sama dengan pelarut untuk sample. 2*Banyak sample yang ditotolkan harus diketahui dengan tepat. 3*Dikembangkan secara biasa dan divisualisasikan dengan cara yang tidak merusak. 4*Bercak yang dikehendaki diberi tanda dengan alat tajam, dibandingkan dengan bercak baku. 5*Bercak beserta fase diam dikerok kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai secara kuantitatif. 6*Larutan yang diperoleh bila perlu diuapkan dibawah rotary evaporator dimasukkan ke dalam labutakar, ditetapkan kadarnya dengan cara yang sesuai.
2.4.2 Kromatografi Preparatif
Kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif merupakan salah satu metode pemisahan dengan menggunakan peralatan sederhana. Ketebalan penjerap yang sering dipakai adalah 0,5 - 2 mm. ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran plat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel. Gambar di samping menunjukkan bahwa silika gel (SiO2) merupakan rantai -O-Si-Odimana pada bagian permukaan silika berupa gugus-gugus hidroksil -OH, oleh karena itu silika 21
gel relatif bersifat polar. Oleh karena itu, KLT preparatif umumnya menggunakan sistem fase normal. Namun tidak menutup kemungkinan bahwa dalam KLT preoaratif digunakan sistem fase terbalik. Dalam hal ini permukaan silika gel terlebih dahulu dimodifikasi agar tidak lagi mengandung gugus hidroksil, melalui reaksi silanisasi menggunakan dichlorodimethyl silane seperti terlihat pada gambar berikut:
Semakin panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika, maka akan semakin hidrofobik. Silika gel yang digunakan umumnya ditambah dengan binding agent / binder / perekat untuk memberikan kekuatan pada lapisan, menambah adhesi terhadap penyangga, dan membuat lapisan menjadi lebih kohesi. Binding agent yang banyak digunakan yaitu kalsium sulfat, CaSO4.½ H2O 10 – 15 %, yang lebih dikenal sebagai gipsum sehingga silika gel ini diberi kode G. Pengikat lain yang dapat dipakai yaitu pati 3% dan polimer organik, seperti polivinil alkohol. Lapisan yang tidak mengandung pengikat dapat melekat dengan dukungan keseragaman ukuran partikel. Selain itu silika gel juga sering ditambah dengan indikator luminescence (fosforescence pada λ 254 nm ; fluorescence pada λ 366 nm) untuk membantu
penampakan bercak tak berwarna. Silika gel yang telah ditambah indikator luminescence kemudian diberi kode F atau UV. Indikator luminescence merupakan senyawa yang apabila dikenai radiasi elektromagnetik ultraviolet (UV) pada λ 254 nm atau λ 366 nm,
maka akan menyerap energi radiasi tersebut untuk mengeksitasikan elektron-elektronnya ke tingkat energi yang lebih tinggi (exited state). Saat elektron-elektron yang tereksitasi tersebut kembali ke tingkat energi dasar ( ground state), maka akan mengemisikan cahaya. Emisi cahaya dari senyawa yang menyerap energi radiasi dengan λ 254 nm berupa peristiwa fosforescence, sedangkan emisi cahaya dari senyawa yang menyerap energi dengan λ 366 nm berupa peristiwa fluorescence. Oleh karena itu silika gel yang 22
telah ditambah indikator luminescence akan berpendar dengan penampakan warna tertentu. Jika di atas lempeng tersebut terdapat suatu noda / bercak senyawa yang terlelusi, maka sinar UV tidak dapat mencapai indikator luminescence, sehingga indikator luminescence yang berada di bawah noda tersebut tidak dapat menyerap energi radiasi elektromagnetik yang mengenainya. Hal tersebut terjadi karena silika gel yang telah mengandung indikator luminescence tertutup oleh noda. Akibatnya tidak terjadi eksitasi elektron, yang secara otomatis tidak terjadi emisi cahaya. Dengan demikian pada bagian tersebut akan tampak peredaman bercak, yaitu pada bagian bercak tampak gelap dengan latar belakang yang berpendar. Hal inilah yang menjadi dasar deteksi bercak dengan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Sebelum digunakan untuk membuat lapisan pada penyangga, khususnya lempeng KLT preparatif, adsorben harus terbebas dari cemaran / pengotor. Pengotor dapat dihilangkan dengan mencuci adsorben dengan metanol. Pemurnian dapat dilakukan dengan mendidihkan bubur adsorben dalam metanol beberapa menit, kemudian dibiarkan beberapa jam pada suhu kamar. Setelah itu adsorben disaring, dikeringkan pada suhu kamar, kemudian pada suhu 110°C selama 1 jam. Selain itu penghilangan cemaran dapat pula dilakukan dengan pra-elusi menggunakan eluen yang lebih polar daripada eluen yang akan digunakan pada pemisahan, contoh : sebelum digunakan untuk pemisahan senyawa, lempeng adsorben yang telah aktif dielusi dengan metanol untuk membawa cemaran ke salah satu ujung, setelah itu diaktifkan kembali. Penyangga yang digunakan dapat berupa kaca / gelas, logam, ataupun plastik. Ukuran penyangga disesuaikan dengan jenis pemisahan yang hendak dilakukan dan ukuran bejana yang digunakan. Bahkan untuk analisis kualitatif yang sederhana dapat digunakan obyek glas. Kebanyakan penyangga yang dijual berupa lempeng kaca dengan ukuran 20 x 20 cm, 20 x 10 cm atau 20 x 5 cm. Sebelum digunakan, penyangga dicuci dengan detergen, dibilas dengan air, kemudian dengan akuades dan keringkan. Bila perlu bilas pula dengan aseton atau dibersihkan dengan tissue yang dibasahi aseton ataupun heksana untuk menghilangkan lemak atau pengotor yang mungkin masih tertinggal. Selain itu, dengan aseton permukaan penyangga akan semakin cepat kering. Suatu hal yang perlu diperhatikan adalah jangan menyentuh permukaan penyangga yang telah bersih dengan jari-jari. 23
Ada 4 cara yang dapat digunakan untuk pembuatan lapisan tipis, yaitu penuangan, penyemprotan, pencelupan, dan pembentangan, yang dapat dilakukan secara manual ataupun machinal. Sebelum digunakan untuk membuat lapisan pada suatu penyangga, adsorben harus dibuat bubur / slurry terlebih dulu. Kekentalan optimum bubur untuk membuat lapisan adsorben tergantung pada metode yang digunakan untuk membuat lapisan. Jika adsorben sangat halus dan partikel-partikelnya homogen, dan jika tidak menggunakan pengikat, maka bubur dapat dituang di atas lempeng hingga melapisinya. Adsorben yang umum digunakan pada metode penuangan tersebut adalah alumina yang dalam pembuatan bubur tidak menggunakan air, melainkan cairan volatil seperti etanol, etil asetat. Metode pembentangan umumnya digunakan untuk lempeng yang berukuran sedang ataupun besar. Pembuatan bubur adsorben pada metode pembentangan umumnya dilakukan dengan perbandingan x gram adsorben dan 2x ml air atau pelarut organik, kemudian diaduk dan dilumatkan dalam mortir atau digojog perlahan hingga homogen (hindari terbentuknya buih) dalam gelas piala bertutup. Jika mengandung gips, maka makin lama makin kental. Oleh karena itu waktu pengocokan sebaiknya seragam ± 45 detik. Contoh : untuk membuat lapisan tipis pada 6 lempeng kaca berukuran 20 x 10 cm dan 2 lempeng 20 x 5 cm dengan tebal lapisan 0,25 mm, dapat digunakan 30 g adsorben yang dibuat bubur dengan 60 ml air. Perbandingan adsorben dan air untuk membuat bubur adsorben pada metode pembentangan dapat dilihat pada tabel berikut: Tabel 3. Perbandingan adsorben dan air.
Jika diperlukan, perbandingan dapat diubah karena jumlah air yang tepat tergantung pula pada jenis dan pra perlakuan pada adsorben. Karena lapisan dibuat dari 24
bubur adsorben dalam air, maka apabila mekanisme pemisahan yang diharapkan adalah adsorpsi, lempeng KLT harus diaktifkan dahulu yaitu dengan pemanasan di dalam oven pada suhu ±100 – 110°C selama 1 – 3 jam. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan pada adsorben, yang selanjutnya akan membuka pori-pori adsorben sehingga luas permukaan spesifiknya meningkat. Luas permukaan spesifik adalah luas permukaan yang diukur dalam meter persegi tiap gram. Adsorben yang aktif dapat memiliki permukaan spesifik ratusan meter persegi. Aktivitas tersebut berkaitan dengan kekuatan menyerap dari adsorben, yaitu adsorben dengan luas permukaan yang besar akan menyerap dengan kuat. Adanya air pada pusat-pusat serapan akan mengurangi kemampuan adsorpsi sehingga menghambat tertambatnya komponen sampel ke dalam adsorben. Dengan demikian lamanya pemanasan dan suhu yang digunakan akan menentukan mekanisme pemisahan, yaitu adsorpsi atau partisi. Jika suhu pengaktifan jauh di atas 110°C dapat menyebabkan terjadinya dehidrasi yang ireversibel sehingga pemisahan justru menjadi tidak efektif. Lempeng yang telah diaktifkan harus disimpan dalam lingkungan kering, yaitu desikator. Lempeng komersial siap pakai, memiliki keaktifan yang beragam. Namun umumnya dapat digunakan langsung atau dapat diaktifkan kembali dengan pemanasan. Pada sistem partisi, lapisan diaktifkan pada suhu ±100 – 110°C selama 10 menit sehingga memungkinkan masih tertinggalnya air di dalam lapisan. Selain itu, adanya air di dalam lapisan tipis dapat diperoleh melalui proses dihidrasi. Dalam hal ini yang berperan sebagai fase diam adalah air, sedangkan butir-butir lapisan tipis berperan sebagai penyangga. Selain air, zat cair lain juga dapat digunakan sebagai fase diam, baik zat cair polar, seperti formamida, etilen glikol; maupun zat cair nonpolar, seperti minyak silikon, minyak parafin. Pada umumnya lapisan diaktifkan terlebih dahulu untuk menghilangkan air dari lapisan, kemudian dicelupkan secara perlahan ke dalam larutan zat cair 20% di dalam formamida atau etilen glikol di dalam aseton, minyak silikon 5% dalam eter. Setelah itu lapisan dibiarkan mengering tanpa pemanasan. Tebal lapisan merupakan faktor penting dalam KLT. Tebal standar adalah 250 mikron atau 0,25 mm, sedangkan lapisan yang lebih tebal (0,5 – 2,0 mm) digunakan untuk pemisahan yang bersifat besar dengan jumlah adsorben hingga 250 mg untuk 25
lempeng berukuran 20 x 20 cm. Tebal optimum untuk lapisan KLT preparatif ± 1 – 1,5 mm. Lapisan tebal sulit untuk dibuat dan menghasilkan pemisahan yang relatif buruk. Pada umumnya bubur adsorben yang digunakan untuk mencetak lapisan KLT preparatif agak lebih kental daripada untuk KLT biasa. Pada lapisan yang mengandung perekat kalsium sulfat, pengentalan dapat terjadi dengan membiarkan bubur lebih lama sebelum lapisan dicetak. Cara lain harus digunakan adsorben lebih banyak dalam pembuatan bubur. Salah satu kesulitan dalam penggunaan lapisan yang tebal yaitu tendensi mengelupas bila telah kering. Oleh karena itu lapisan harus dibiarkan mengering selama beberapa jam sebelum diaktifkan, sehingga dapat mencegah peretakan dan pengerasan bagian luar. Dalam hal ini dianjurkan untuk menyimpan lapisan tanpa diaktifkan terlebih dahulu, dan diaktifkan menjelang digunakan. Pada KLT preparatif, cuplikan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi lempeng besar, kemudian dielusi secara tegak lurus terhadap garis cuplikan sehingga campuran memisah menjadi beberapa pita. Volume penotolan dapat mencapai 2 ml dengan lebar 1 – 5 mm. Pita yang seragam dapat diperoleh dengan bantuan mikropipet atau alat penotol berikut:
Jumlah cuplikan yang ditotolkan pada KLT preparatif dapat mencapai 50 mg pada lapisan 20 x 20 cm tebal 1 mm untuk mekanisme adsorpsi, sedangkan untuk partisi 5 mg. Lapisan dengan tebal 1cm panjang 1 m dapat digunakan untuk memisahkan cuplikan hingga 100 g.
26
Cara ini digunakan untuk memisahkan campuran sehingga diperoleh senyawa murni untuk analisis lebih lanjut, untuk meneliti bahan alam yang umumnya berjumlah kecil dan campurannya kompleks, untuk memperoleh cuplikan murni guna mengkalibrasi KLT uantitatif. Penotolan cuplikan dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit pelarut. Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan jarak sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Pelarut yang baik untuk melarutkan cuplikan adalah pelarut yang atsiri. Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan kertas saring yang diletakkan berdiri disekeliling permukaan bagian dalam bejana (Hostettmann, et al, 1995). Deteksi bercak pada KLT preparatif tidak boleh merusak senyawa yang dipisahkan, sehingga cara yang paling sesuai dalam hal ini adalah deteksi di bawah sinar UV. Metode alternatif yaitu dengan menempelkan selotif pada lapisan sedemikian hingga tegak lurus bercak pita. Saat diangkat, selotif akan membawa sedikit adsorben yang mengandung pita senyawa yang selanjutnya dapat dideteksi dengan reagen warna. Alternatif lain yaitu dengan menyemprot lapisan silika gel dengan air sehingga menjadi tembus cahaya (bening) dan bercak pita terlihat sebagai daerah buram pada latar belakang tembus cahaya. Setelah pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak maka senyawa yang tidak berwarna dengan penjerap dikerok dari plat kaca. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran beberapa senyawa sehingga diperoleh senyawa murni (Gritter, et al, 1991). Pada KLT preparatif, adsorben yang mengandung pita senyawa yang dianaslis dikerok dengan spatula, silet, atau pengaduk karet pipih. Pengerokan yang lebih sempurna dapat dihasilkan dengan bantuan alat sebagai berikut:
27
Hal ini diutamakan pada pekerjaan kuantitatif. Kemudian senyawa disari dari adsorben dengan pelarut yang sesuai. Pada pekerjaan preparatif, setelah disari maka pelarut diuapkan dan senyawa diisolasi. Sedangkan pada pekerjaan kuantitatif, pelarut yang telah mengandung senyawa dimasukkan ke dalam labu dan diencerkan hingga tanda, kemudian ditetapkan kadarnya secara spektrofotometri. 2.4.3 Kromatografi Kolom
Pemisahan komponen campuran melalui kromatografi adsorpsi tergantung pada kesetimbangan adsorpsi-desorpsi antara senyawa yang teradsorb pada permukaan dari fase diam padatan dan pelarut dalam fase cair. Tingkat adsorpsi komponen tergantung pada polaritas molekul, aktivitas adsorben, dan polaritas fase gerak cair. Umumnya, senyawa dengan gugus fungsional lebih polar akan teradsorb lebih kuat pada permukaan fase padatan. Aktivitas adsorben tergantung komposisi kimianya, ukuran partikel, dan pori-pori partikel. 1. Fase Gerak
Fase gerak adalah zat yang dapat mengelusi senyawa di dalam kolom.Solven murni atau sistem solven tunggal dapat digunakan untuk mengelusi semua komponen. Selain itu, sistem gradient solven juga digunakan. Pada elusi gradien, polaritas sistem solven ditingkatkan secara perlahan dengan meningkatkan konsentrasi solven ke yang lebih polar. Pemilihan solven eluen tergantung pada jenis adsorben yang digunakan dan kemurnian senyawa yang dipisahkan. Solven harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Keberadaan pengganggu seperti air, alkohol, atau asam pada solven yang kurang polar akan mengganggu aktivitas adsorben (Braithwaite and Smith, 1995). 28
Beberapa kombinasi heksana atau petroleum eter (40 – 60 oC, bp) dan dietil eter, biasanya dengan asam asetat (90:10:1) atau diisopropil eter dan asam asetat (98,5:1,5) umumnya digunakan untuk pemisahan lipida non polar. Mobilitas terbesar ditunjukkan oleh ester kolesterol diikuti oleh triasilgliserol, asam lemak bebas, kolesterol, diasilgliserol, monoasilgliserol (Holme, 1993) Tabel 4. Urutan Kepolaran Eluen, Elusi Senyawa dan Adsorben
2. Fase Diam
Silika gel adalah fasa diam yang paling sering digunakan untuk pemisahan produk alam. Silika gel memberikan area permukaan yang sangat luas. Rata-rata ukuran partikel silika gel yang digunakan dalam kolom kromatografi adalah 40 – 200 μm dengan ukuran pori sebesar 40 hingga 300 Å (Cannel, 1998).
Gambar 3. Struktur Silika Gel Permukaan silika gel mengandung gugus silanol. Gugus hidroksil ini adalah pusat aktif dan berpotensi dapat membentuk ikatan hirogen yang kuat dengan senyawa yang dipisahkan. Silika gel membentuk ikatan hidrogen terutama dengan donor H 29
seperti alkohol, fenol, amina, amida, dan asam karboksilat (Palleros, 2000). Pada umumnya, semakin kuat kemampuan ikatan hidrogen suatu senyawa, semakin kuat akan tertahan oleh silika gel. Seberapa kuat senyawa tertahan dalam silika gel tergantung pada polaritas fase gerak. Semakin kuat kemampuan ikatan hidrogen suatu solven, semakin baik eluen untuk mengelusi senyawa polar yang teradsorb pada kolom silika gel. Pengembangan kolom biasanya meliputi peningkatan prosentase polar solven selama kromatografi berlangsung (Cannel, 1998). Silika gel dapat digunakan untuk identifikasi kelas-kelas lipida. Pemisahan didasarkan pada interaksi (ikatan hidrogen, gaya van der waal, dan ikatan ionik) antara molekul lipida dan silika gel. Fase gerak heksana atau petroleum eter sebagai komponen utama dan aseton atau dietil eter sebagai modifikasi digunakan untuk pemisahan lipida sederhana. Retensi lipida sederhana meningkat dengan dimulai dari sterol ester, metil ester, triasilgliserol, asam lemak bebas, sterol, diasilgliserol dan monoasilgliserol (Nikolova, 2002).
30
BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1. Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilakukan dimulai pada tanggal 15 September sampai 24 November 2015 pukul 11.00 WIB di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, Lantai 3, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Jakarta. 3.1. Alat dan Bahan 3.1.1.Alat
Pisau
KLT Silika gel 60 F254 (5x3cm
Papan Potong
Pipa kapiler
Blender
Pensil
Timbangan
Sumber sinar UV
Kertas HVS
Hot Plate
Wadah kayu
Oven
Sikat halus
Plat kaca
Botol gelap sebagai wadah maserasi
Batang pengaduk
Seperangkat alat Rotary evaporator
Vial
Kertas saring
Alat-alat gelas
Chamber
Kertas saring
Pinset
Kaca penutup Chamber
Botol sirup bekas
Corong Pisah
Corong
Kapas
3.1.2.Bahan
Rimpang Zingiber purpureum Roxb
Aquadest
Pelarut metanol
H₂SO₄
Sampel uji : hasil fraksi kolom kromatografi
Ekstrak Bangle fraksi N-heksan
Ekstrak tanaman Bangle
Ekstrak Bangle fraksi Metanol
Godin
Ekstrak Bangle fraksi Etil Asetat 31
KLT yang sudah ditotolkan ekstrak
Pelarut n-heksana
Pelarut etil asetat
KLT yang sudah di elusi
Fraksi Ekstrak Bangle hasil kromatografi kolom dengan nomor vial ganjil
Isolat dari hasil kromatografi kolom preparative
3.2. Metode Praktikum 3.2.1.Preparasi Sampel Proses Pembersihan
1. Rimpang Zingiber purpureum Roxb ditimbang sebanyak 2Kg 2. Sampel kemudian dicuci bersih menggunakan air mengalir dan sikat halus 3. Setelah dicuci, sampel ditiriskan hingga kering 4. Setelah kering, sampel dipotong menggunakan pisau 5. Sampel yang sudah dipotong kemudian diletakkan pada wadah kayu yang telah dilapisi kertas HVS 6. Sampel dikeringanginkan pada suhu ruang hingga kering sempurna. Proses Pengecilan Ukuran Simplisia
1. Sampel yang telah kering sempurna kemudian ditimbang kembali. 2. Sampel yang telah ditimbang kemudian dihaluskan menggunakan blender hingga didapatkan bentuk serbuk simplisia. 3. Setelah semuanya dihaluskan, serbuk yang didapatkan kemudian ditimbang kembali 3.2.2.Ekstraksi
1. Serbuk simplisia yang telah dihaluskan dengan cara diblender sampai didapatkan bentuk serbuk selanjutnya ditimbang yaitu didapatkan berat sampel sebesar 300 mg. 2. Selanjutnya serbuk simplisia bangle dimasukkan ke botol gelap dan diberi pelarut metanol. 3. Metanol sebagai pelarut diberikan sampai serbuk simplisia terendam hingga lapisan pelarut berada 2 jari di atas serbuk simplisia di dalam wadah botol gelap. 4. Tutup botol tersebut. 5. Lakukan maserasi simplisia selama 3 hari sambil sesekali di aduk ,ulangi maserasi sebanyak 2 kali. 32
6. Setelah proses maserasi telah selesai,selanjutnya saring hasil maserasi menggunakan kertas saring dan corong lalu masukkan hasil penyaringan ke wadah penyimpanan sementara hasil saringan(filtrat) . 7. Filtrat yang didapat selanjutnya diuapkan pelarutnya dengan menggunakan Vacuum Rotary Evaporator sampai didapatkan ekstrak yang kental. 8. Ekstrak kental yang didapatkan selanjutnya ditimbang dan ditentukan rendemennya. 3.2.3.Partisi I. Partisi dengan n-heksana
1. Ekstrak metanol Rimpang Bangle diencerkan dengan 20 ml metanol sehingga dapat dituang kedalam corong pisah. 2. Masukkan n-heksana sebanyak 20 ml ke dalam corong pisah yang telah berisi ekstrak Rimpang Bangle, goncang selama beberapa menit dengan sesekali membuka katup corong pisah untuk mengeluarkan gas yang terkumpul didalamnya. Biarkan beberapa lama sampai terlihat bidang batas antara pelarut nheksana dan metanol. 3. Pisahkan dua pelarut terpisah tersebut dengan mengambil terlebih dahulu lapisan bawah dengan membuka kran corong pisah. 4. Lapisan atas yaitu n-heksana dan lapisan bawah ekstrak metanol Rimpang Bangle. 5. Tampung n-heksana dengan beaker glass, pekatkan dengan Rotatory Evaporator hingga diperoleh ekstrak kental fraksi n-heksana. 6. Lakukan partisi n-heksana sebanyak 5 kali, sampai pelarut n-heksana yang dihasilkan bening dimana mengindikasikan bahwa tidak ada lagi senyawa non polar yang bisa larut kedalam pelarut tersebut. II. Partisi dengan Etil Asetat
1. Lapisan metanol yang tersisa tambahkan dengan pelarut etil asetat. 2. Lakukan pemisahan komponen dalam ekstrak dengan cara yang sama dengan cara pemisahan dengan n-hekasana. Sehingga didapatkan ekstrak senyawa semipolar yang terdapat dalam pelarut etil asetat. 3. Sisa dari partisi merupakan senyawa yang larut dalam pelarut polar.
33
4. Setiap ekstrak hasil partisi n-heksana, etil asetat dan sisa partisi kemudian diuapkan dengan menggunakan Rotatory Evaporator sehingga mendapatkan 3 ekstrak kental yaitu ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol. 3.2.4.Kromatografi Lapis Tipis (Bagian 1) 1. Preparasi Fase Gerak & Chamber
Persiapan chamber diawali dengan mencuci bersih chamber dan dikeringkan sehingga chamber tidak lagi mengandung air. Kemudian dilakukan penjenuhan chamber dengan memasukkan fase gerak berupa campuran N-Heksan 8 mL dan Etil Asetat 2 mL (4:1) ke dalam chamber. Celupkan ujung kertas saring ke dalam chamber dan tutup chamber. Chamber dinyatakn telah jenuh ketika kertas saring sudah terbasahi oleh fase gerak yang merambat ke atas kertas saring. 2. Preparasi Fase Diam & Sampel
Persiapan fase diam dilakukan dengan memberi garis batas bawah dan garis batas atas pada KLT sebesar 1 cm menggunakan pensil dan diberi tanda penotolan farksi metanol, etil asetat dan n-heksan. Encerkan ekstrak Bangle dari fraksi metanol dengan menggunakan pelarut metanol, ekstrak Bangle dari fraksi etil asetat dengan menggunakan pelarut etil asetat, ekstrak Bangle dari fraksi n-heksan dengan menggunakan pelarut n-heksan. Kemudian dilakukan penotolan masing-masing fraksi yang sudah diencerkan pada KLT yang sudah diberi tanda. 3. Proses Elusi
Proses elusi dilakukan dengan memasukkan plat KLT yang sudah ditotolkan ekstrak ke dalam chamber yang sudah jenuh dengan fase gerak. Posisikan plat secara tegak dengan letak totolan diatas permukaan fase gerak. Tutup chamber dan tunggu hingga fase gerak merambat naik melewati KLT dan mencapai batas atas KLT. 4. Proses Penampakan Bercak
Proses penampakan bercak diawali dengan melihat bercak KLT secara fisika yaitu dengan menggunakan sinar UV. Tandai bercak yang muncul dengan menggunakan pensil ketika diamati melalui sinar UV. Kemudian dilakukan penampakan bercak secara kimia dengan meneteskan H₂SO₄ secara merata pada permukaan KLT. Keringanginkan KLT dan teteskan pereaksi Godin secara merata pada plat KLT dan kemudian panaskan KLT menggunakan hot plate hingga warna bercak muncul. 34
3.2.5.Kromatografi Kolom 1. Preparasi Kolom Kromatorgrafi
Preparasi kolom diawali dengan membersihkan kolom dengan menggunakan pelarut n-heksan. Kemudian Kolom disumbat ujungnya dengan menggunakan kapas. Fase diam dibuat dengan mencampurkan 25g serbuk silika dengan n-heksan hingga serbuk silika terendam, kemudian diaduk hingga konsistensi menjdai bubur. Bubur silika kemudian dimasukan ke dalam kolom dan ditambahkan pelarut n-heksan. Kolom diketuk-ketuk hingga
silika gel menjadi padat dan mampat. Pelarut n-heksan
ditampung dan dimasukan kembali kedalam kolom hingga konsistensi silika gel padat. 2. Pembuatan Sistem Pelarut
Sistem pelarut sebagai fase gerak dibuat dengan mencampurkan pelarut dengan tingkat kepolaran tertentu. Pelarut dimulai dari pelarut n-heksan 100%, kemudian dibuat campuran pelarut n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan 9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5 dan 4:6.Pelarut dibuat sebanyak 100ml. 3. Proses Isolasi Senyawa
Fraksi n-heksan Ekstrak Metanol Rimpang Bangle dimasukan kedalam kolom dengan menggunakan pipet sedikit demi sedikit. 100ml Pelarut/Fase gerak dimasukan kedalam kolom dimulai dari n-heksan 100% kemudian kepolaran fase gerak ditingkatkan dengan perbandingan tertentu. Pelarut yang keluar dari kolom ditampung dengan vial yang telah diberi nomor tertentu. Eluat kemudian dilakukan Kromatografi Lapis Tipis(KLT) 3.2.6.Kromatografi Lapis Tipis (Bagian 2) 1. Persiapan Chamber
Chamber dicuci bersih dan dikeringkan sehingga tidak ada air di dalamnya. 2. Penyiapan Eluen (Fase Gerak)
Mencampurkan N-Heksan 9 mL dan Etil Asetat 1 mL (9:1) ke dalam chamber. 3. Penjenuhan Eluen
Mencelupkan ujung kertas saring ke dalam chamber dan tunggu hingga eluen menjadi jenuh yang ditandai dengan terbasahinya kertas saring.
35
4. Penyiapan KLT
Menyiapkan 5 lembar KLT ukuran 5x4 kemudian memberi batas bawah sebesar 0,5 cm dan batas atas sebesar 0,3 cm. 5. Penyiapan Fraksi Ekstrak
Dari 36 vial fraksi yang didapatkan hasil kromatografi kolom, diambil vial dengan nomor ganjil saja, sehingga terdapat 18 fraksi yang di klt. Masing-masing vial fraksi dilarutkan dengan 2 tetes n-heksan 6. Penotolan Fraksi Ekstrak
Menotolkan masing-masing fraksi pada plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler. Masing-masing plat terdapat 3-4 fraksi yang ditotolkan 7. Pemisahan
Memasukkan plat KLT yang sudah diberi totolan ekstrak dalam keadaan tegak ke dalam chamber yang sudah jenuh dengan menggunakan pinset. Tunggu hingga fase gerak naik melewati KLT hingga mencapai batas atas KLT. Setelah KLT sudah terlewati fase gerak, keluarkan KLT dari chamber dan kering anginkan. 8. Deteksi Bercak KLT secara Fisika
Hasil KLT diamati dan ditandai dengan sinar UV pada panjang gelombang 365 nm. 3.2.7.Kromatografi lapis Tipis Preparatif
1. Timbang silica gel sebanyak 30 gram,masukkan ke dalam gelas beaker 250 ml 2. Masukkan aquadest dua kali bobot silica(60 ml) 3. Campurkan silica dalam aquadest ,aduk rata,kemudian kocok kuat hingga membentuk suspense 4. Tuangkan suspensi silica di atas kaca Diratakan dengan batang pengaduk.Bagian yang belum rata ,diratakan lagi dengan tangan sambil ditepuk-tepuk. 5. Keringkan pada suhu ruang 6. Masukkan dalam oven selama 30 menit pada suhu 110⁰C. 3.2.8.Kromatografi Lapis Tipis (Bagian 3) 1. Persiapan Chamber
Chamber dicuci bersih dan dikeringkan sehingga tidak ada air di dalamnya. 2. Penyiapan Eluen (Fase Gerak)
Mencampurkan N-Heksan 9 mL dan Etil Asetat 1 mL (9:1) ke dalam chamber. 36
3. Penjenuhan Eluen
Mencelupkan ujung kertas saring ke dalam chamber dan tunggu hingga eluen menjadi jenuh yang ditandai dengan terbasahinya kertas saring. 4. Penyiapan KLT
Menyiapkan KLT ukuran 5x5 kemudian memberi batas bawah sebesar 0,5 cm dan batas atas sebesar 0,2 cm. 5. Penyiapan Isolat Ekstrak
Masing-masing vial isolat yang telah mengering dilarutkan dengan 2 tetes n-heksan 6. Penotolan Fraksi Ekstrak
Menotolkan masing-masing isolat pada plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler. 7. Pemisahan
Masukkan plat KLT yang sudah diberi totolan ekstrak dalam keadaan tegak ke dalam chamber yang sudah jenuh dengan menggunakan pinset. Tunggu hingga fase gerak naik melewati KLT hingga mencapai batas atas KLT. Setelah KLT sudah terlewati fase gerak, keluarkan KLT dari chamber dan kering anginkan. 8. Deteksi Bercak KLT secara Fisika
Hasil KLT diamati dan ditandai dengan sinar UV pada panjang gelombang 365 nm dan 254 nm
37
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil 4.1.1 Ekstraksi Rimpang Bangle ( Zi ngeber purpur eum Roxb.) Pengamatan
Jumlah sampel awal (sebelum diekstraksi) Serbuk simplisia bangle yang didapatkan setelah melalui proses penghalusan Jumlah cairan penyari /jumlah metanol (pelarut) yang digunakan untuk proses maserasi
Jumlah
1 kg 300 mg 2100 ml
Berat ekstrak kental yang didapat
4,481 g
Rendemen ekstrak
1,493 %
4.1.2 Partisi
Partisi dengan pelarut Non Polar N-heksana 20 ml
Fraksi n-heksan dan etil asetat rimpang Bangle
38
4.1.3 Kromatografi Lapis Tipis (Bagian 1)
Penampak Bercak Fisika
Penampak Bercak Kimia
Keterangan
Jumlah bercak yang teramati: Metanol : 9 bercak Etil asetat : 8 bercak N-heksan : 3 bercak
Fraksi
Nilai Rf
Metanol
Bercak 1 2,7/3,5 = 0,77 Bercak 2 2,5/3,5 = 0,71 Bercak 3 2,1/3,5 = 0,60 Bercak 4 1,7/3,5 = 0,48 Bercak 5 1,5/3,5 = 0,42 Bercak 6 1,1/3,5 = 0,31 Bercak 7 1,0/3,5 = 0,28 Bercak 8 0,6/3,5 = 0,17 Bercak 9 0,3/3,5 = 0,08
Etil Asetat
Bercak 1 2,4/3,5 = 0,68 Bercak 2 2,0/3,5 = 0,57 Bercak 3 1,6/3,5 = 0,45 Bercak 4 1,3/3,5 = 0,37 Bercak 5 1,0/3,5 = 0,28 Bercak 6 0,7/3,5 = 0,20 Bercak 7 0,5/3,5 = 0,14 Bercak 8 0,3/3,5 = 0,08
N-Heksan
Bercak 1 3,3/3,5 = 0,94 Bercak 2 2,3/3,5 = 0,65 Bercak 3 0,9/3,5 = 0,25
39
4.1.4 Kromatografi Kolom
Persiapan Kolom Kromatografi
Fraksi n-heksan Ekstrak Metanol Rimpang Bange di dalam Kromatografi Kolom
Proses Pemisahan Dengan
Tahap Akhir Pemisahan
Kromatografi Kolom
dengan Kromatografi Kolom
40
Hasil Kromatografi Kolom, 36 Vial terbagi kedalam 7 Fraksi Tabel 2. Tabel Hasil Pemisahan Senyawa Fraksi n-heksan Ekstrak Metanol Rimpang Bangle dengan Kromatografi Kolom
Pelarut/Eluen
Perbandingan
Volume
Vial Ke
N-heksan
100%
100ml
1-5
N-heksan : Etil asetat
9:1
100ml
6-11
N-heksan : Etil asetat
8:2
100ml
12-18
N-heksan : Etil asetat
7:3
100ml
19-26
N-heksan : Etil asetat
6:4
50ml
27-29
N-heksan : Etil asetat
5:5
50ml
30-32
N-heksan : Etil asetat
4:6
50ml
33-36
Kromatografi Kolom fraksi n-heksan ekstrak metanol rimpang bangle menghasilkan 36 vial yang terbagi menjadi 7 fraksi dengan warna cairan bening seluruhnya.
41
4.1.5 Kromatografi Lapis Tipis (Bagian 2)
1-3-5-7
17-19-21-23
9-11-13-15
25-27-29
31-33-35
42
4.1.6 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Terbentuk 3 pita. Pita 1 terlihat pada panjang gelombang 365 nm berwarna biru. Pita 2 & 3 terlihat pada panjang gelombang 254 nm berwarna keabu-abuan
4.1.7 Kromatografi Lapis Tipis (Bagian 3)
365 nm
254 nm
43
4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini sampel yang digunakan adalah rimpang Zingiber purpureum Roxb atau yang lebih dikenal dengan bangle. Bangle dipilih karena secara empiris memiliki khasiat sebagai obat penurun panas, sakit kepala, masuk angin, batuk berdahak, konstipasi, dan perut nyeri. 4.2.1 Preparasi Sampel
Pada persiapan sampel, langkah pertama yang dilakukan adalah penimbangan sampel. Sampel bangle ditimbang sebanyak 2Kg, hal ini diharapkan dapat memperoleh ekstrak kental yang banyak. Kemudian setelah penimbangan, rimpang kemudian dicuci bersih dan ditiriskan. Proses ini dilakukan untuk menghilangkan kotoran atau bekas tanah yang ada dari sampel. Kemudian setelah ditiriskan, sampel kemudian dipotong tipis-tipis dan diletakkan di wadah kayu yang telah dilapisi kertas HVS. Setelah itu, dikeringanginkan pada suhu ruang hingga kering sempurna. Pada penempatan sampel, sampel harus diberi jarak agar sampel dapat kering sempurna. Selama proses pengeringan, kertas yang digunakan berfungsi sebagai penyerap air. Sampel yang masih memiliki kadar air yang cukup banyak dapat menimbulkan jamur yang dapat menyebabkan senyawa yang akan diisolasi didenaturasi oleh enzim yang dihasilkan oleh jamur tersebut. Pengeringan cukup dilakukan pada suhu ruang karena bila dikeringkan dibawah sinar matahari, senyawa yang akan diisolasi dapat rusak oleh sinar UV yang terpancar bersama sinar matahari. Kerusakan senyawa dapat disebabkan oleh pemanasan pada suhu tinggi, terpapar sinar UV, dan infeksi dari jamur atau mikroorganisme lain. Proses selanjutnya sampel yang telah kering kemudian dikumpulkan. Untuk kering sempurna, sampel memerlukan waktu kurang lebih 5 hari pengeringan dalam suhu ruang. Dan sampel yang telah kering kemudian ditimbang dan didapatkan total 300gram dari 2Kg bangle utuh. Setelah penimbangan, sampel dihaluskan dengan menggunakan blender. Penghalusan sampel dilakukan secara sedikit demi sedikit dengan kecepatan rendah. Pada penghalusan, digunakan kecepatan rendah pada kecepatan ini, sampel dapat halus secara merata dan meminimalisir rusaknya senyawa yang akan diisolasi terhadap panas yang dihasilkan dari blender. Pada blender, dinamo dari mesin akan berputar yang menimbulkan gesekan antara dinamo dengan magnet penghantar listrik. Gaya gesek yang terjadi dapat menimbulkan panas tinggi. Panas pada mesin blender dapat mengalir kepada 44
pisau blencer yang terbuat dari stainless Steel yang bersifat konduktor panas. Semakin tinggi kecepatan yang digunakan, gaya gesek yang dihasilkan akan lebih besar, dan panas yang dihasilkan akan semakin besar. Setelah semua sampel kering dihaluskan, kemudian serbuk kering dipindahkan ke wadah kedap udara dan kemudian ditimbang. Dan serbuk bangle yang didapatkan sebanyak 300gram. Proses penghaluskan sampel bertujuan yntuk mengecilkan ukuran partikel. Bila ukuran partikel kecil, partikel tersebut memiliki luas permukaan kontak yang besar. Sehingga pelarut yang digunakan dapat menarik semua senyawa yang terkandung dalam bangle secara sempurna. 4.2.2 Ekstraksi
Pada praktikum farmakognosi fitokimia 3 ini salah satu proses yang dilakukan adalah proses ekstraksi. Ekstraksi adalah tahap awal yang penting dalam proses isolasi senyawa dari tumbuhan. Ekstraksi adalah suatu proses penyarian atau penarikan senyawa kimia yang terdapat didalam bahan alam atau berasal dari dalam sel dengan menggunakan pelarut dan metode yang tepat. Ekstrak adalah hasil dari proses ekstraksi, bahan yang diekstraksi merupakan bahan alam, dimana ektraksi memiliki prinsip umum yaitu difusi dan osmosis. Tujuan Ekstraksi yaitu penyarian komponen kimia atau zat-zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis hewan termasuk biota laut. Komponen kimia yang terdapat pada tanaman, hewan dan beberapa jenis ikan pada umumnya mengandung senyawa-senyawa yang mudah larut dalam pelarut organik (Adrian, 2000).. Ekstraksi didasarkan pada perpindahan massa komponen zat padat ke dalam pelarut dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka, kemudian berdifusi ke dalam pelarut dan setelah pelarut diuapkan maka zat aktifnya akan diperoleh (Adrian, 2000).Proses pengekstraksian komponen kimia dalam sel tanaman adalah pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini akan berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam dan di luar sel (Adrian, 2000).
45
Tujuan dilakukan percobaan ekstraksi ini adalah untuk memperoleh ekstrak kental metanol senyawa yang terkandung pada sampel percobaan kali ini yaitu rimpang bangle yang selanjutnya akan digunakan dalam praktikum berikutnya. Cara ekstraksi kandungan kimia dari tumbuhan dapat dibedakan atas cara ekstraksi tradisional dan cara ekstraksi modern. Dalam metode ekstraksi cairan tradisional dapat dibedakan lagi menjadi cara dingin dan cara panas. Metode dengan cara dingin, diantaranya maserasi dan perkolasi. Sedangkan dengan cara panas diantaranya yaitu soxhletasi,refluks,serta destilasi uap air. Dan untuk percobaan kali ini digunakan cara tradisional dengan metode ekstraksi dingin yaitu maserasi. Alasan memilih metode maserasi dikarenakan metode ini digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung komponen kimia yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah mengembang seperti benzoin, stiraks dan lilin. Alasan lain mengapa memilih
metode maserasi
adalah karena
pengerjaan yang dilakukan sederhana begitu juga alat alat yang digunakan. Metode maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur kamar dan terlindung dari cahaya (Ditjen POM : 1986). Prinsip maserasi adalah penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari yang sesuai selama tiga hari pada temperatur kamar terlindung dari cahaya, cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi rendah ( proses difusi ). Peristiwa tersebut berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selama proses maserasi dilakukan pengadukan dan penggantian cairan penyari setiap hari. Endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan. Maserasi dilakukan dengan cara memasukkan simplisia yang sudah diserbukkan dengan derajat halus tertentu sebanyak 10 bagian ke dalam bejana maserasi yang dilengkapi pengaduk mekanik, kemudian ditambahkan 75 bagian cairan penyari ditutup dan dibiarkan selama 3 hari pada temperatur kamar terlindung dari cahaya sambil berulang-ulang diaduk. Setelah 3 hari, disaring kedalam dalam bejana penampung, 46
kemudian ampasnya diperas dan ditambah cairan penyari lagi secukupnya dan diaduk kemudian disaring lagi hingga diperoleh sari 100 bagian. Sari yang diperoleh ditutup dan disimpan pada tempat yang terlindung dari cahaya selama 2 hari, endapan yang terbentuk dipisahkan dan filtratnya dipekatkan (Adrian, 2000). Pada proses ekstraksi menggunakan suatu pelarut/cairan penyari , pertimbangan dalam memilih cairan penyari yaitu tingkat kepolaran dari jenis senyawa yang akan ditarik atau kandungan kimia pada zat aktif dan cairan penyari yang digunakan (pelarut yang digunakan), murah dan mudah diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, bereaksi netral, tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar, selektif yakni hanya menarik zat berkhasiat yang dikehendaki, tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan diperbolehkan oleh peraturan. Jenis pelarut berkaitan dengan polaritas dari pelarut tersebut. Hal yang perlu diperhatikan dalam proses ekstraksi adalah senyawa yang memiliki kepolaran yang sama akan lebih mudah tertarik/ terlarut dengan pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang sama. Pelarut yang digunakan adalah pelarut yang dapat menyari sebagian besar metabolit sekunder yang diinginkan dalam simplisia (Depkes RI, 2008). 2008 ). Pada percobaan ini menggunakan cairan penyari yaitu metanol. Metanol merupakan pelarut yang bersifat universal sehingga dapat melarutkan analit yang bersifat polar dan nonpolar. Metanol dapat menarik alkaloid, steroid, ste roid, saponin, dan flavonoid dari tanaman (Thompson, 1985). Digunakan metanol karena efektif dalam proses ekstraksi dibandingkan dengan yang lain. Sebenarnya metanol ini bersifat toksik tapi karena tanaman tersebut dalam hal ini rimpang bangle tidak diketahui kandungan senyawanya maka digunakan metanol karena metanol bersifat semi polar karena zat aktif yang akan diambil komponen kimianya belum diketahui sifat kepolarannya apakah polar ataukah non polar maka dengan itu digunakan metanol. Efektif dalam hal ini bahwa ekstrak metanol mampu menarik komponen kimia pada zat aktif melalui prinsip ekstraksi yaitu difusi-osmosis atau osmosis-difusi. Dimana cairan penyari masuk ke dalam zat aktif pada suatu wadah yang diberikan tekanan dalam hal ini pengadukan maka cairan penyari berosmosis masuk ke dalam sel pada zat aktif sehingga terjadi perbedaan konsentrasi didalam sel dan diluar sel, sehingga konsentrasi didalam sel lebih tinggi sehingga komponen kimianya 47
terdesak keluar maka cairan penyari yang bersatu dengan zat aktif akan keluar sehingga disini terjadi proses difusi. Pada percobaan ini menggunakan simplisia rimpang bangle yang diperoleh dari pasar parung seberat 1 kg,namun ketika dihaluskan berat nya berkurang yaitu menjadi 300 mg.Pengurangan bobot kemungkinan dikarenakan banyak serbuk yang menempel pada alat pengalus (blender) ketika proses penghalusan ,sehingga bobot nya berkurang. Makin halus serbuk simplisia, proses ekstraksi makin efektif dan efisien namun makin halus serbuk, maka makin rumit secara teknologi peralatan untuk tahapan filtrasi. Selanjutnya pada proses ekstraksi serbuk simplisia bangle dimasukkan ke wadah gelap,tujuan dimasukkan ke dalam wadah gelap karena agar terlindung dari cahaya karena dikhawatirkan jika terkena cahaya,cahaya tersebut
dapat merusak senyawasenyawa-
senyawa kimia pada ekstrak. Selanjutnya memasukkan pelarut metanol kurang lebih sampai 2 jari diatas serbuk simplisia yang dimasukkan ke wadah gelap,tujuan dimasukkan pelarut melebihi serbuk simplisia adalah agar serbuk simplisia dapat terendam sempurna sehingga dapat menarik senyawa kimia dari serbuk simplisia rimbang bangle dan ekstraksi dapat berjalan dengan baik. Setelah itu tutup botol tersebut dan lakukan maserasi selama 3 hari dan sesekali sambil di aduk/dikocok ,tujuan pengadukan yaitu untuk mempercepat proses pelarutan komponen kimia yang terdapat dalam sampel. Setelah proses maserasi telah selesai,selanjutnya saring hasil maserasi menggunakan kertas saring dan corong lalu masukkan hasil penyaringan penyaringan ke wadah/botol bening penyimpanan sementara hasil saringan(filtrat).Tujuan disaring adalah untuk mendapatkan maseratnya,lalu ampas nya dimasukkan kembali ke wadah maserasi(wadah gelap) lalu ekstraksi ulang dengan memberikan pelarut metanol lagi.Tujuan dilakukan ekstraksi pengulangan adalah agar sampel terekstraksi secara sempurna yang ditandai sampai pelarut pada sampel berwarna bening. Filtrat yang didapat selanjutnya diuapkan pelarutnya dengan menggunakan Vacuum Rotary Evaporator sampai didapatkan ekstrak yang kental.Tujuan diuapkan adalah untuk membebaskan maserat dari pelarut.Prinsip alat Vacuun Rotary Evaporator adalah Proses pemisahan ekstrak dari cairan penyarinya dengan pemanasan yang 48
dipercepat oleh putaran dari labu alas bulat, cairan penyari dapat menguap 5-10º C di bawah titik didih pelarutnya disebabkan oleh karena adanya penurunan tekanan. Dengan bantuan pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap naik ke kondensor dan mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut murni yang ditampung dalam labu alas bulat penampung. Setelah didapatkan ekstrak kental maka timbang ekstrak kental yang didapat dan hitung rendemen yang diperoleh.Rendemen adalah perbandingan antara ekstrak yang diperoleh dengan simplisia awal (Depkes RI,2000).Rendemen ekstrak dapat digunakan sebagai parameter standar mutu ekstrak pada tiap bets produksi maupun paremeter efiesiensi ekstraksi. Rendemen yang diberikan dari ekstrak metanol rimpang bangle adalah 0,941 %. Besar rendemen ini menunjukkan metabolit sekunder dalam rimpang bangle ini cukup kecil. 4.2.3 Ekstraksi Cair-Cair
Pada praktikum kali ini dilakukan ekstraksi cair-cair (partisi) dengan sampel yang berasal dari hasil ekstraksi maserasi terhadap rimpang dari tumbuhan Bangle ( Zingiber Zingiber purpureum). Hal pertama yang dilakukan adalah disiapkan alat dan bahan yang akan
digunakan. Kemudian alat tersebut dibersihkan dengan air kran dan dibilas dengan alkohol. Tujuannya yaitu untuk menghilangkan kotoran, lemak dan mikroba yang menempel pada alat tersebut. Ekstraksi cair-cair merupakan cara pemisahan satu atau lebih senyawa dengan menggunakan dua pelarut yang tidak bercampur dimana senyawa tersebut akan terdispersi di antara dua fase sesuai dengan derajat kelarutannya sehingga masing-masing jenuh dengan perbandingan konsentrasi tertentu menyebabkan terjadinya pemisahan. Selanjutnya masuk pada proses partisi dari hasil h asil ekstraksi maserasi terhadap rimpang dari tumbuhan Bangle ( Zingiber Zingiber purpureum) dengan menggunakan pelarut yang bersifat polar yaitu metanol dan yang bersifat nonpolar yaitu n-heksana. Langkah pertama yang dilakukan yaitu dimasukkan ekstrak ke dalam gelas kimia, kemudian diencerkan dengan metanol sebanyak 20 ml. Tujuan dilarutkannya ekstrak rimpang Bangle kedalam metanol sebagai pelarut pertama adalah sebagaipembawasenyawa-senyawa yang terdapatpadaekstraktersebut.
Olehkarenaitu,
metanolselainpelarut
polar,
jugatermasukpelarut semi polar yang dapat membawa semua senyawa tersebut. 49
Selanjutnya diaduk hingga larut dan homogen. Setelah itu, disaring menggunakan corong pisah dan ditambahkan 20 ml n-heksana kemudian dikocok dan didiamkan selama beberapa menit sampai terjadi pemisahan.
Dalam proses pemisahan ini, senyawa yang bersifat nonpolar akan berada dalam fase atas sedangkansenyawa yang bersifat polar berada dalam fase bawah. Hasil menunjukkan bahwa lapisan atas adalah n-heksana dan lapisan bawah adalah ekstrak metanol rimpang Bangle. Hal ini terjadi karena adanya perbedaan berat jenis antara methanol
dan
n-heksana.
Berat jenis n-heksana yaitu 0,654
g/ml
lebih
kecil
dibandingkan dengan metanol 0,79 g/ml. Setelah terjadi pemisahan, pelarut tersebut dikeluarkan dari corong pisah dengan mendahulukan pelarut yang berada dibagian bawah dan dimasukkan kedalam gelas kimia yang berbeda. Ditampung n-heksana dengan beaker glass, kemudian dipekatkan dengan Rotatory Evaporator hingga diperoleh ekstrak kental fraksi n-heksana.
Partisi dengan n-heksana dilakukan sebanyak 5 kali, bertujuan untuk mendapatkan semua komponen dalam ekstrak dengan hasil yang optimal. Apabila pelarut n-heksana yang dihasilkan sudah bening, ini mengindikasikan bahwa tidak ada lagi senyawa non polar yang bisa larut kedalam pelarut tersebut. Selanjutnya, dilakukan pemisahan komponen senyawa dalam ekstrak rimpang Bangle dengan cara yang sama 50
seperti pada pemisahan dengan n-hekasana. Sisa metanol yang melarutkan ekstrak ditambahkan dengan pelarut semi polar etil asetat, sehingga didapatkan ekstrak senyawa semipolar yang terdapat dalam pelarut etil asetat. Pada saat melakukan partisi ekstrak metanol rimpang Bangle dengan pelarut etil asetat, proses pemisahan sangat lama terjadi. Sehingga ditambahkan dengan 20 ml aquadest. Setelah penambahan aquadest, terjadi pemisahan secara perlahan-lahan. Pada partisi metanol dan etil asetat, pelarut etil asetat berada dibawah karena memiliki berat jenis yang lebih besar dibanding metanol yaitu 0,898 g/ml. Selanjutnya, ditampung etil asetat dalam beaker glass dan diuapkan dengan Rotatory Evaporator dan diperoleh ekstrak kental fraksi etil asetat. Partisi dengan etil asetat hanya dilakukan sekali.Setiap ekstrak hasil partisi n-heksana, etil asetat dan sisa partisi kemudian diuapkan dengan menggunakan Rotatory Evaporator sehingga didapatkan 3 ekstrak kental yaitu ekstrak nheksana, etil asetat dan metanol.Setelah semua fraksi diperoleh, ekstrak kental yang bersifat polar, semi polar dan nonpolar kemudian diuji denganmetode kromatografi lapis tipid (KLT) untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa yang terdapat dalam fase polar dan dalam fase nonpolar (Watson, 2005). Untuk persentase hasil rendemen (% b/v) dari rimpang Bangle tidak dapat diketahui karena saat sebelum melakukan partisi kami tidak melakukan penimbangan ekstrak metanol rimpang Bangle. Jumlah simplisia kering yang kami peroleh hanya sebesar 300 gram. 4.2.4 Kromatografi Lapis Tipis (Bagian I)
Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponenkomponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut. Cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada kelarutan senyawa dalam pelarut, hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut. Serta bagaimana senyawa melekat pada fase diam, dalam hal ini gel silika, tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel silika. 51
Secara kasat mata, umunya hasil KLT tidaklah nampak, makadari itu perlu dilakukan proses penampakan bercak. Adapun untuk menampakkan bercak KLT, dapat dilakukan dua cara yaitu: a. Deteksi bercak cara fisika (Sinar UV) Sejumlah senyawa alam akan berflouresensi yaitu memancarkan cahaya tampak saat dikenai sinar UV atau mengabsorpsi sinar UV. Senyawa yang mengabsorpsi sinar UV akan tampak sebagai daerah gelap di bawah UV. Oleh kerana itu digunakan sinar UV dengan tujuannya untuk mendeteksi senyawa yang dapat berfluoresensi, dimana senyawa tersebut memiliki gugus khromofor. Gugus khromofor merupakan gugus yang dapat memberi atau menghasilkan warna. UV digunakan dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. Panjang gelombang 254 nm tujuannya untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap. Sedangkan jika dibawah panjang gelombang 365 nm untuk menampakkan bercak yang berfluoresensi sehingga pada pengamatan terlihat bercak berpendar (memancarkan cahaya). Keuntungan menggunakan UV ialah karena sinar UV tidak merusak senyawa yang dideteksi, sehingga hasil kromatografi dapat kembali digunakan. b. Deteksi bercak cara kimia (H₂SO₄& Godin) Untuk memperjelas bercak yang tidak tampak pada komatogram. Pada pendeteksin secara kimia digunakan Godin sebagai penampak bercak dan dilakukan pemanasan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang tampak sebagai bercak hitam kecoklatan. Adanya warna hitam kecoklatan menunjukkan adanya senyawa organik pada sampel. Hal ini dimaksudkan untuk mendeteksi senyawa karbon. Hal ini dibuktikan dengan munculnya warna coklat kehitaman. H₂SO₄ memutuskan ikatan rangkap reduktor, sehingga yang terlihat adalah karbonnya, merusak gugus kromofor sehingga panjang gelombang akan bergerak dari UV ke Vis. Berdasarkan hasil, diperoleh jumlah bercak pada fraksi metanol 9 bercak, fraksi etil asetat 8 bercak dan fraksi N-Heksan 3 bercak. Setelah noda dikembangkan dan divisualisasikan, identitas noda dinyatakan dengan harga Rf ( Retordation Factor ) yang didefinisikan sebagai rasio jarak noda terhadap titik awal dibagi jarak eluen terhadap titik awal. Secara matematis dapat ditulis:
52
=
ℎ
Keterangan l = jarak noda dari titik awal ke titik akhir setelah proses pengembangan h = jarak eluen dari titik awal ke batas akhir eluen.
Harga Rf berkisar antara 0-0,999 dan harga Rf yang baik berkisar antara 0,2-0,8. Berdasarkan hasil yang diperoleh, didapatkan nilai Rf yang kurang dari 0,2 dan lebih dari 0,8 hal ini dapat dikarenakan pemilihan fase gerak yang kurang optimal, namun dalam pemisahan senyawa, bercak yang timbul dapat dikatakan baik karena dapat terpisah dengan jelas. Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam KLT yang juga mempengaruhi harga Rf menurut Hardjono Sastromidjoyo (1991) adalah :
Struktur senyawa yang sedang dipisahkan.
Sifat adsorben dan derajat aktivitasnya. Perbedaan adsorben memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf.
Tebal dan kerataan lapisan adsorben.
Pelarut fasa gerak (dan tingkat kemurnianya).
Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
Teknik percobaan.
Jumlah cuplikan yang digunakan. Penetesan jumlah cuplikan yang berlebihan memberikan tendensi penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor.
Suhu, untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan-penguapan atau perubahan-perubahan fasa. Sehingga berdasarkan hasil KLT, dipilih fraksi N-Heksan untuk dilanjutkan
pemisahan dengan kromatografi kolom. Hal dikarenakan pemisahan pada farksi Nheksan, terbentuk pola bercak besar dan pemisahan 3 bercak yang dimana hal ini dianggap bahwa pada fraksi N-Heksan merupakan komponen major dari ekstrak Bangle. Sedangkan pada metanol dan etil asetat mengalami pemisahan yang terlihat jelas tetapi bercak yang timbul sangat lah banyak yaitu 9 bercak dan 8 bercak pada penampakan KLT sehingga dianggap bahwa di dalam fraksi tersebut bukanlah
53
komponen major dari ekstrak bangle yang dimana dapat terdiri dari lebih banyak senyawa. 4.2.5 Kromatografi Kolom
Pada teknik kromatografi kolom ini, pembuatan silika dilakukan dengan menggunakan tehnik basah, yaitu dengan mencampurkan serbuk silika dengan n-heksan hingga menjadi bubur. Bubur silika dimasukan secara hati-hati ke dalam kolom agar tidak terbentuk gelembung udara karena gelembung udara dapat merusak fase diam sehingga dapat memutus penyerap dalam kolom. Kolom kemudian diketuk-ketuk dengan selang untuk membantu memampatkan silika dan menghindari terbentuknya gelembung. Pada penelitian ini, silika gel yang dibuat mengalami cracking saat dimampatkan. Untuk mencegah cracking yang semakin memburuk dan untuk memulihkan keadaan silika gel maka kolom dibalut dengan kapas yang telah dibasahi aseton. Kolom yang rusak dapat memberikan hasil pemisahan yang kurang baik. Pelarut yang digunakan sebagai fase gerak dibuat dengan tingkat kepolaran yang berbeda-beda. Pada penelitian ini digunakan pelarut dari yang tingkat kepolarannya lebih rendah terlebih dahulu yaitu n-heksan, tujuannya yaitu agar seluruh senyawa yang bersifat kurang polar akan keluar dari kolom terlebih dahulu, kemudian senyawa yang bersifat lebih polar akan tertahan di fase diam dan akan keluar secara perlahan. Sehingga pemisahan yang dihasilkan akan efektif. Pelarut atau eluen yang digunakan dimulai dengan menggunakan n-heksan 100%, kemudian kepolaran ditingkatkan dengan mencampurkan pelarut n-heksan dan etil asetat mulai dari perbandingan 9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6 sebanyak kurang lebih 100ml. Alasan digunakan pelarut yang bersifat kurang polar terlebih dahulu yaitu untuk menghindari tertariknya senyawa non polar pada ekstrak oleh pelarut polar sehingga menyebabkan senyawa non polar dapat tidak ada yang tertarik lagi pada akhir penarikan apabila menggunakan senyawa non polar diakhir. Proses isolasi
dimulai dengan memasukan fraksi n-heksan Ekstrak Metanol
Rimpang Bangle kedalam kolom yang telah disiapkan secara perlahan-lahan dengan menggunakan pipet. Metode basah digunakan dalam perlakuan sampel kedalam kolom kromatografi. Metode basah dipilih karena ekstrak Metanol Rimpang Bangle fraksi nheksan ini memiliki konsistensi yang cair sehingga mudah untuk dituang ke dalam kolom 54
hanya dengan menggunakan pipet. Kemudian pelarut/eluen dimasukan kedalam kolom dimulai dari tingkat kepolaran yang rendah hingga ke tingkat kepolaran yang tinggi (nheksan 100%, n-heksan: etil asetat (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6)). Fase gerak dikeluarkan perlahan-lahan dan kolom dipertahankan agar tetap terendam pelarut tujuannya yaitu untuk mencegah kolom menjadi kering dan pecah. Kemudian hasil eluat ditampung kedalam vial. Proses kromatografi kolom dihentikan saat silika gel/kolom sudah kembali berwarna putih, hal ini menunjukan bahwa seluruh senyawa telah tertarik dan dipisahkan. Hasil akhir dari kromatografi kolom ini yaitu diperoleh 36 vial terbagi kedalam 7 fraksi bereda dari hasil pemisahan dengan kromatografi kolom (n-heksan 100%, nheksan: etil asetat (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6)). Fraksi-fraksi tersebut kemudian digunakan untuk proses KLT. KLT dilakukan terhadap vial dengan nomor ganjil, untuk dilihat pola KLT dari setiap fraksi. 4.2.6 Kromatografi Lapis Tipis (Bagian II)
Proses kromatografi lapis tipis pada tahapan ini dilakukan untuk melihat pola pemisahan dari senyawa-senyawa yang terdapat pada fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom. Selain itu dapat menunjukkan fraksi mana yang memilikisenyawa dalam jumlah yang paling banyak diantara fraksi-fraksi lainnya. Informasi ini yang dijadikan sebagai bahan pertimbangan dalam proses isolasi selanjutnya yaitu kromatografi lapis tipis preparatif sehingga dapat mengilsolasi senyawa murni dari fraksi yang digunakan pada kromatografi lapis tipis preparative Prinsip pengerjaannya sama dengan proses kromatografi lapis tipis sebelumnya. Hanya terdapat beberapa perbedaan kondisi diantaranya :
Objek(sumber senyawa yang akan dipisahkan). Pada tahapan ini objek yang digunakan adalah fraksi ekstrak bangle hasil kromatografi kolom dengan nomor vial ganjil
Eluen (pelarut / campuran pelarut fase gerak). Eluen yang digunakan adalah campuran n-heksan dan etil asetat 9 : 1
Jumlah dan ukuran plat yang digunakan lebih banyak dan sedikit lebih besar dari KLT yang pertama dilakukan
55
1. Pemilihan Eluen Pada proses kolom kromatografi sebelumnya, senyawa cenderung terpisahkan dengan perbandingan pelarut n-heksan yang lebih banyak dibandingkan etilasetat, sehingga senyawa akan dipisahkan telah terlewati seluruhnya sebelum digunakan perbandingan pelarut dengan jumlah etil asetat yang lebih tinggi. Dengan demikian dipilih perbandingan pelerut n-heksan yang lebih besar karena dianggap pemisahannya yang paling baik pada fraksi hasil kolom kromatografi tersebut. 2. Penjenuhan Penjenuhan dilakukan untuk menyamakan kondisi keseluruhan bagian chamber. 3. Pemilihan Fraksi Ekstrak Karena dari proses KLT ini hanya diharapkan gambaran secara umum pemisahan pada fraksi-fraksi yang telah didapatkan, maka hanya dipilih vial fraksi bernomor ganjil dengan asumsi bahwa pola pemisahan pada vial fraksi bernomor genap tidak akan berbeda jauh dengan vial fraksi ganjil disekitarnya. 4. Penyiapan Fraksi Ekstrak Sebelum ditotolkan pada plat KLT, senyawa dari masing-masing vial yang akan diuji di larutkan terlebih dahulu. Hal ini dilakukan kerena senyawa dalam keadaan kering setelah diuapkan selama seminggu. Sehingga untuk mempermudah penotolan diperlukan pelarutan kembali senyawa. 5. Pemilihan Pelarut Hal yang mendasari pertimbangan dalam pemilihan pelarut untuk melarutkan senyawa dalam vial sebelum ditotolkan tidak berbeda jauh dengan pertimbangan pemilihan eluen. Selain itu, alasan lainnya adalah karena ekstrak awal yang di kolom adalah ekstrak yang berasal dari fraksi n-heksan, sehingga dianggap paling cocok melarutkan senyawa hasil kolom tersebut. Dari pola kromatografi yang terbentuk, beberapa fraksi menunjukkan terjadinya tailing, namun beberapa menunjukkan pemisahan yang baik dimana terbentuk spot-spot yang jelas antar senyawa yang terpisah. Pola kromatografi juga menunjukkan beberapa fraksi dengan kandungan senyawa yang sedikit bahkan tidak terdapat senyawa dan beberapa fraksi dengan kandungan senyawa yang besar/mayor. 56
Pola pemisahan yang ditunjukkan berdasarkan dengan tingkat kelarutan masingmasing senyawa dengan perbedaan komposisi eluen yang digunakan pada proses kromatografi kolom. Fraksi-fraksi dengan komposisieluen yang sama cenderung memiliki pola kromatogram yang mirip karena senyawa yang tertarik oleh eluennya umumnya merupakan senyawa yang sama. Perbedaan komposisi eluen pada proses kolom sebelumnya menunjukkan keberagaman pola kromatogram pada proses KLT nya. Pola kromatogram yang muncul dalam bentuk tailing biasanya disebabkan karena senyawa yang terdapat pada fraksi tersebut beragam namun memiliki sifat kepolaran yang hampir mirip sehingga terlihat saling bersambung. Selain itu bisa disebabkan karena kurang selektifnya proses pemisahan yang terjadi yang diakibatkan oleh jumlah senyawa yang terdapat pada fraksi tersebut cukup besar. Senyawa yang terdapat dalam jumlah besar ditunjukkan dengan pola kromatogramnya yang memiliki daerah yang cukup luas. Pola kromatogram yang muncul dalam bentuk spot-spot terpisah memiliki pemisahan yang baik dengan eluen pembawanya. Fraksi dengan pemisahansenyawa seperti ini cenderung digunakan untuk proses isolasi lanjutan karena antar senyawanya akan lebih mudah terpisah. 4.2.7 Kromatografi Preparatif
Pada Praktikum ini dilakukan identifikasi sampel ektrak bangle menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif. KLT preparatif pada dasarnya sama dengan kromatografi lapis tipis biasa, namun perbedaan yang nyata ialah pada KLT preparatif menggunakan lempeng kaca dengan ketebalan 0,5 dan sampel ditotolkan berupa garis lurus pada salah satu sisi lempeng. Dan pada bagian langkah akhir silica akan dikeruk yang mana disebut sebagai isolate. Penjerab (adsorben) yang digunakan, yaitu silika gel. Silika gel umumnya mengandung zat tambahan kalsium sulfat yang lebih dikenal sebagai gipsum sehingga silika gel ini diberi kode G. Binding agent / binder / perekat dapat memberikan kekuatan pada lapisan, menambah adhesi terhadap penyangga, dan membuat lapisan menjadi lebih kohesi. Silika gel juga mengandung indikator luminescence ( fosforesence pada λ 254 nm ; fluorescence pada λ 366 nm) untuk membantu penam pakan bercak tak berwarna, 57
mendeteksi letak pita yang terpisah pada senyawa yang menyerap sinar ultraviolet. Silika gel yang telah ditambah indikator luminescence kemudian diberi kode F atau UV. N-hexan : etil asetat (9: 1) sebanyak 20 ml dipilih sebagai eluen. Eluen yang digunakan merupakan campuran non polar dan semi polar. Alasannya, jika digunakan nheksan saja (eluen tunggal) kemungkinan akan menggerakkan bercak terlalu jauh atau bahkan tidak dapat menggerakkan. Oleh karena itu seringkali harus mencampur eluen untuk memperoleh kepolaran yang diinginkan. Campuran yang baik akan menghasilkan eluen yang memiliki kekuatan bergerak sedang.Eluen harus murni dan sangat mudah menguap tanpa meninggalkan residu / sisa / noda sehingga tidak mengganggu dalam pendeteksian bercak. Karena mudah menguap, maka komponen sampel akan cepat mencapai kesetimbangan distribusi di dalam fase gqerak dan fase diam. Metode Pembuatan Plat KLTP menggunakan ‘Metode Pembentangan Manual’.
Metode pembentangan umumnya digunakan untuk lempeng yang berukuran sedang ataupun besar. Pembuatan bubur adsorben pada metode pembentangan umumnya dilakukan dengan perbandingan x gram adsorben dan 2x ml air atau pelarut organik, kemudian diaduk dan digojog perlahan hingga homogen (hindari terbentuknya buih) dalam gelas piala bertutup. Dimana pada praktikum, ditimbang 30 gram silika halus dan sejumlah aquadest yang digunakan adalah dua kali bobot silika (60 mL). Campurkan silika dalam aquadest di erlenmeyer 250 mL, aduk rata, kemudian kocok kuat hingga membentuk suspensi dan jangan sampai terbentuk gumpalan. Ditaburkan silika tadi di atas kaca. Cuplikan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi lempeng besar menggunakan pipa kapiler kemudian dielusi secara tegak lurus terhadap garis cuplikan sehingga campuran memisah menjadi beberapa pita. Cuplikan yang ditotolkan berasal dari vial (fraksi) 13 & 14. Berdasarkan penampakan noda pada percobaan fraksinasi yang telah dilakukan sebelumnya, pemisahan pada fraksi 13 dengan KLT terlihat cukup baik dan 13 menunjukkan pola dengan daerah yang paling luas, yang mengindikasikan jumlah senyawa yang besar. Jumlah senyawa yang besar ini dapat mempermudah isolasi senyawa dari fraksi tersebut. Fraksi tersebut sebelum ditotolkan dilarutkan1 mL n-dan sedikit etil asetat. Pada awalnya kami hanya melarutkan dengan menggunakan n-heksan tetapi, setelah dilihan di 58
bawah UV tidak terlihat pita yang terbentuk. Maka kami tambahkan sedikit etil asetat karena kemungkinan senyawa yang terkandung merupakan senyawa yang tidak terlalu non polar. Penjenuhan bejana menggunakan kertas saring yang berfungsi sebagai Parameter tingkat kejenuhan bejana terhadap uap eluen. Kejenuhan atmosfer dalam bejana oleh uap eluen harus senantiasa dipertahankan selama elusi karena akan mempengaruhi kesetimbangan distribusi. Suatu gejala apabila atmosfer dalam bejana tidak dengan uap eluen yaitu terjadinya pengembangan dengan permukaan eluen yang berbentuk cekung dimana eluen bagian tepi lebih cepat bergerak daripada bagian tengah. Pada KLT preparatif pendeteksian bercak tidak boleh merusak senyawa yang dipisahkan, sehingga cara yang paling sesuai dalam hal ini adalah deteksi di bawah sinar UV. Sinar UV yang digunakan yaitu, UV 254 dan UV 365. Hasil yang diperoleh dari proses isolasi dengan KLT Preparatif terbentuk 3 pita. Pita 1 berflouresensi berwarna biru pada panjang gelombang 365 nm sedangkan pita 2 dan 3 berwarna abu-abu pada panjang gelombang 254 nm. Pita yang dihasilkan ini kemudian dikeruk dan dapat diekstraksi untuk proses analisis lebih lanjut, untuk meneliti bahan alam yang umumnya berjumlah kecil dan campurannya kompleks, untuk memperoleh cuplikan murni guna mengkalibrasi KLT kuantitatif. 4.2.8 Kromatografi Lapis Tipis III
Proses kromatografi lapis tipis pada tahapan ini dilakukan untuk melihat kemurnian senyawa dari hasil isolasi melalui kromatografi kolom lapis tipis preparatif. Eluen yang digunakan disesuaikan dengan eluen yang digunakan pada kromatografi lapis tipis preparatif sebelumnya yaitu campuran n-heksan : etilasetat 9:1. Hal yang mendasari pertimbangan dalam pemilihan pelarut untuk melarutkan senyawa dalam vial sebelum ditotolkan tidak berbeda jauh dengan pertimbangan pemilihan eluen. Selain itu, alasan lainnya adalah karena ekstrak awal yang di kolom adalah ekstrak yang berasal dari fraksi n-heksan, sehingga dianggap paling cocok melarutkan senyawa hasil kolom tersebut. Dari pola kromatografi yang terbentuk, menunjukkan bahwa dari tiga isolat yang telah diisolasi, hanya isolat nomor 1 yang menunjukkan satu spot. Isolat nomor 2 membentuk spot yang agak menumpuk, sedangkan isolat nomor 3 menunjukkan 59
beberapa spot yang saling terpisah cukup jauh. Hal menujukkan bahwa isolat nomor 1 lebih murni dibandingkan isolat nomor 2 dan 3. Spot yang terbentuk pada isolat nomor 2 cukup besar menunjukkan bahwa isolat tersebut memiliki senyawa yang cukup mayor. Isolat nomor 3 berpotensi untuk di isolasi lebih lanjut karena pola pemisahan senyawanya yang cukup baik pada uji klt analitis. Ketika dilihat pada panjang gelombang 365 nm, terlihat pendar pada isolat 1 dan 3. Pendar yang sangat intens terlihat pada isolat 1 menandakan bahwa senyawa isolat nomor 1 merupakan senyawa yang dapat berfluoresensi.
60
BAB V PENUTUP
5.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dalam praktikum farmakognosi dan fitokimia III ini dihasilkan kesimpulan bahwa Isolasi senyawa dari Ekstrak Metanol Rimpang Bangle ( Zingiber purpureum) pada fraksi n-heksan yang dilakukan dengan cara ekstraksi, fraksinasi dan kromatografi, dihasilkan isolat yang diduga terdapat senyawa berwujud minyak. Penelitian ini perlu dilanjutkan untuk memperoleh senyawa murni berwujud minyak di dalam ekstrak Metanol Rimpang Bangle ( Zingiber purpureum) 5.2. Saran
1. Dapat dilakukan isolasi lebih lanjut terhadapa hasil fraksi yang belum murni. 2. Senyawa murni yang telah didapat dapat dilanjutkan untuk proses identifikasi senyawa menggunakan instrument-instrumen yang mendukung analisa senyawa.
61
