Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret Kadar Protein dengan Metode : Penentuan Kadar Biuret II. TANGGAL NGGAL PERCOB PERCOBAAN AAN : Selasa, 25 Oktober 2016 III. TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode biuret IV. DAAR TEORI I. JUDUL
Pengertian Protein
Prot Protei ein n yang yang nama namany nyaa berar berarti ti pert pertam ama! a! atau atau umu umum! m! meru merupa paka kan n makrom makromole olekul kul yang yang paling paling berlim berlimpa" pa" didalam didalam sel dan menyusu menyusun n lebi" lebi" dari setenga setenga" " berat berat kering kering pada pada "ampir "ampir semua semua organi organisme# sme# Semua Semua protei protein n didalam didalam semua mak"luk "idup dibangun ole" susunan dasar yang sama, yaitu 20 asam amino amino baku# baku# $Le"ni $Le"ninge nger, r,1%& 1%&2'# 2'# Strukt Struktur ur asam amino amino digamb digambark arkan an sebaga sebagaii berikut(
Protein adala" molekul yang sangat )ital untuk organisme dan terdapat di semua semua sel yang merupaka merupakan n polimer dari dari monomer *monomer asam amino amino yang di"ubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida# peptida# Protein merupakan suatu +at makanan yang sangat penting bagi tubu" karena +at ini berungsi sebagai sumber energi dalam tubu" serta sebagai +at pembangun dn pengatur# Protein adlaa" polimer dari asam amino yang di"ubungkan dengan ikatan peptida# Molekul protein mengandung unsur*umsur -, ., O, /, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga $inarno, 1%%2'# Protein merupakan suatu polipeptida dengan berat molekul yang sangat ber)ariasi dari 5000 samapi lebi" dari satu uta karena molekul protein yang besar, besar, protein sangat muda" mengalami peruba"an isis dan akti)itas biologisnya# Banyak agensia yang menyebabkan peruba"an siat alamia" dari protein seperti panas, asam, basa, sol)en organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioakti $Sudarmadi, 1%%6'# Struktur ungsi ditentukan ole" kombinasi, umla" dan urutan asam amin amino o seda sedang ngka kan n sia siatt isi isik k dan dan kimi kimia3 a3ii dipe dipeng ngar aru" u"ii ole" ole" asam asam amin amino o
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret penyusunnya# Penentuan kadar protein dapat dilakukan menggunakan beberapa metode, yaitu metode se4ara kuantitati, metode se4ara kualitati, dan metode spektrootometri *is# ntuk metode Biuret sendiri termasuk kedalam metode kuan kuantit titati ati# # Meto Metode de biur biuret et meru merupa paka kan n sala" sala" satu satu 4ara 4ara yang yang terba terbaik ik untu untuk k menentukan kadar protein dalam suatu larutan# Struktur protein ada 7 tingkatan yaitu ( a# Struktur Struktur primer menunuk menunukkan kan umla", umla", enis dan urutan asam amino amino dalam molekul protein $rentetan asam amino dalam suatu molekul protein'# b# Struktur sekunder menunukkan banyak siat suatu protein, ditentukan ole" orientasi molekul sebagai suatu keseluru"an, bentuk suatu molekul protein $misalnya spiral' dan penataan ruang kerangkanya $ikatan "idrogen antara gugus /*., sala" satu residu asam amino dengan gugus karbonil -8O residu asam yang lain'# 4# Strukt Struktur ur tersier tersier menun menunukk ukkan an keadaa keadaan n ke4end ke4enderu erunga ngan n polipe polipepti ptida da memben membentuk tuk lipatan lipatan tali tali gabung gabungan an $intera $interaksi ksi lebi" lebi" lanut lanut seperti seperti terlipat terlipatny nyaa kerangka untuk membentuk suatu bulatan'# d# Struktur kuartener menunukkan menunukkan deraat persekutuan unit*unit protein# 9itinau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam 2 golongan yaitu( a# Protein Protein seder" seder"ana ana yang yang merupa merupakan kan protein protein yang yang "anya "anya terdiri terdiri atas atas molekul*molekul asam amino b# Protein gabungan yang merupakan protein yang terdiri atas protein dan gugu guguss buka bukan n prot protein ein## :ugu :uguss ini ini diseb disebut ut gugu guguss pros proste tetik tik dan dan terd terdir irii atas atas karbo"idrat, lipid atau asam nukleat# Pada Pada dasarn dasarnya ya suatu suatu peptid peptidaa adala" adala" asil*asa asil*asam m amino, amino, karena karena gugus gugus ; -OO. dan ;/. 2 membentuk ikatan peptida# Peptida didapatkan dari "idrolisis protein yang tidak sempurna#
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret penyusunnya# Penentuan kadar protein dapat dilakukan menggunakan beberapa metode, yaitu metode se4ara kuantitati, metode se4ara kualitati, dan metode spektrootometri *is# ntuk metode Biuret sendiri termasuk kedalam metode kuan kuantit titati ati# # Meto Metode de biur biuret et meru merupa paka kan n sala" sala" satu satu 4ara 4ara yang yang terba terbaik ik untu untuk k menentukan kadar protein dalam suatu larutan# Struktur protein ada 7 tingkatan yaitu ( a# Struktur Struktur primer menunuk menunukkan kan umla", umla", enis dan urutan asam amino amino dalam molekul protein $rentetan asam amino dalam suatu molekul protein'# b# Struktur sekunder menunukkan banyak siat suatu protein, ditentukan ole" orientasi molekul sebagai suatu keseluru"an, bentuk suatu molekul protein $misalnya spiral' dan penataan ruang kerangkanya $ikatan "idrogen antara gugus /*., sala" satu residu asam amino dengan gugus karbonil -8O residu asam yang lain'# 4# Strukt Struktur ur tersier tersier menun menunukk ukkan an keadaa keadaan n ke4end ke4enderu erunga ngan n polipe polipepti ptida da memben membentuk tuk lipatan lipatan tali tali gabung gabungan an $intera $interaksi ksi lebi" lebi" lanut lanut seperti seperti terlipat terlipatny nyaa kerangka untuk membentuk suatu bulatan'# d# Struktur kuartener menunukkan menunukkan deraat persekutuan unit*unit protein# 9itinau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam 2 golongan yaitu( a# Protein Protein seder" seder"ana ana yang yang merupa merupakan kan protein protein yang yang "anya "anya terdiri terdiri atas atas molekul*molekul asam amino b# Protein gabungan yang merupakan protein yang terdiri atas protein dan gugu guguss buka bukan n prot protein ein## :ugu :uguss ini ini diseb disebut ut gugu guguss pros proste tetik tik dan dan terd terdir irii atas atas karbo"idrat, lipid atau asam nukleat# Pada Pada dasarn dasarnya ya suatu suatu peptid peptidaa adala" adala" asil*asa asil*asam m amino, amino, karena karena gugus gugus ; -OO. dan ;/. 2 membentuk ikatan peptida# Peptida didapatkan dari "idrolisis protein yang tidak sempurna#
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret 9alam larutan basa, -u2> membentuk membentuk kompleks kompleks dengan dengan ikatan peptide suatu protein, se"ingga meng"asilkan 3ara ungu dengan absorbansi maksimal pada rentang panang gelombang 570 570 nm# =eaksinya adala" sebagai berikut (
OH
/aO. > -uSO7 > /aO.
/a 2SO7 > . 2O
OH
> H 2C
H2C
H2C
?ung ?ungsi si pena penamb mba" a"an an /aO. /aO. yait yaitu u agar agar susp suspen ensi si larut larutan an pada pada sampe sampell HC
HC
NH 2
HC
NH 2
NH 2
bersuasana alkalis# alkalis # Sedangkan penamba"an -uSO7 bertuuan untuk meng"asilkan C
C
COOH
O
O
O
biuret ber3arna ungu#
O
Cu
dan dan tida tidak k terga tergant ntun ung g enis enis prot protein ein,, karen karenaa selur seluru" u" prot protei ein n pada pada dasar dasarny nyaa mempunyai umla" ikatan peptide yang sama per satuan berat# Berikut adala" kur)a standart antara absorbansi s konsentrasi (
=eaksi =eaksi biuret biuret merupa merupakan kan reaksi reaksi yang yang umum umum diguna digunakan kan untuk untuk gugus gugus peptide dan protein# =eaksi positi ditandai dengan terbentuknya 3arna ungu, karena terbentuknya senya3a kompleks antara -u 2> dan / dari molekul ikatan peptida# Banyaknya asam as am amino yang terikat pada ikatan peptida mempengaru"i 3arna reaksi# ntuk itu digunakan metode biuret, metode biuret sendiri digunakan untuk mengeta"ui ada atau tidaknya ikatan peptida dalam suatu senya3a protein# @nten @ntensit sitas as 3arn 3arnaa terg tergant antun ung g pada pada kons konsent entra rasi si prot protein ein yang yang diter ditera# a# Penentuan protein 4ara biuret adala" dengan mengukur opti4al density $O9' pada panang gelombang 560 ; 5&0 nm#
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret .al ; "al yang dapat mengganggu reaksi ini adala" adanya urea $ mengandung gugus ;-O,
*/. ' dan gula pereduksi yang bereaksi dengan
-u2># Berikut reaksi biuret dengan protein (
Spektrootometer
*is
merupakan
instrument
gabungan
antara
spektrootometer ultra)iolet dan spektrootometer sinar tampak yang dapat mengukur serapanA aborbansi radiasi pada panang gelombang 1&0*50 nm $Suyatno, 2011'# Selain itu penentuan kadar protein dengan protein dengan metode biuret, digunakan .ukum Lambert Beer, yaitu ( Keterangan( C (
# $ a% & '
.ukum Lambert Beer tersebut dapat berlaku bila larutan en4er, dan analit tidak terdisosiasi# Berasosiasi, atau bereaksi dengan pelarut dan radiasi 4a"aya nya monokromatis $mempunyai 1 ma4am panang gelombang', dan larutan tidak keru" $bebas partikel koloid' $.endayana, 1%%7 dalam Sudarman, 2012'# Ni!ai Gi"i Protein
Kalau susunan asam amino umla" dan enisnya di dalam protein makanan sama dengan susunan yang diperlukan tubu" untuk sintesa protein tubu", maka semua asam amino protein makanan tersebut akan dipergunakan, se"ingga eisisensi penggunaannya menadi 100 E# Bila ada satu atau lebi" asam amino essensial mempunyai k3antum yang lebi" renda" dari yang diperlukan unutk sintesa protein tubu", maka "anya sebagian saa dari seluru" asam amino essensial makanan tersebut dapat dipergunakan, se"ingga eisiensi penggunaan protein makanan tersebut lebi" renda" dari 100 E#Fadi persentase penggunaan protein
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret makanan $kualitas protein makanan' ditentukan ole" ada atau tidaknya semua enis asam amino essensial di dalam makanan tersebut men4ukupi kebutu"an untuk sintesa protein tubu" $9aeni, 200&'# Pengaru( Pengo!a(an ter(ada) Protein Kadar asam amino dalam suatu protein tidak se4ara kuantitati menunukkan
nilai gi+inya karena pembatas dalam penggunaan protein adala" nilai 4erna protein#Pengola"an
dapat
menaikkan
dan
menurunkan
nilai
4erna
protein#9enaturasi protein ole" pemanasan dapat mempermuda" "idrolisis protein ole" protease dalam usus "alus, namun demikian pemanasan uga dapat menurunkan mutu protein akibat perombakan protein $.arr is, 200%'# Pada ba"an makanan yang diermentasi, teradi peruba"an protein menadi komponen yang lebi" ke4il ole" adanya en+im yang bekera pada ba"an makanan tersebut, baik yang berasal dari mikroba atau dari ba"an makanan itu sendiri#Beberapa aktor yang mempengaru"i "asil peruraian protein seperti siat* siat asal ba"an pangan itu sendiri, enis mikroba yang tumbu" selama ermentasi, kondisi ermentasi dan lamanya 3aktu ermentasi $inarno, 1%&0'#
Protein )ada I*an Mu+air Ni!a
Se4ara umum, sebagai ba"an pangan sumber lauk*pauk, kandungan nutrisi yang terkandung dalam daging ikan sama saa dengan yang ada dalam daging sapi atau daging ayam#
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret gangguan emosi, meningkatkan daya ta"an dan imunitas tubu"# ariasi makanan uga diperlukan untuk orang yang kese"atannya kurang normal#ikan muair nila merupakan sala" satu solusi untuk memenu"i kebutu"an asupan nutrisi yang di butu"kan tubu" kita# @kan muair nila uga merupakan sala" satu enis ikan yang amilyer muda" di dapat dan di ola" dalam berbagai )arian rasa# @kan muair nila memiliki daging yang guri" dan nikmat, "al itu yang membuat ikan muair nila muda" diola" menadi berbagai makanan le+at#Selain itu, ikan muair nila mempunyai kandungan gi+i yang bermanaat bagi kese"atan tubu"# 9i dalam ikan muair nila terdapat kandungan protein, )itamin <, )itamin G, dan kandungan mineral yang terdiri dari kalsium, osor serta magnesium# @kan muair nila uga memiliki kandungan omega*H yang bermanaat untuk proses pen4ernaan dan perkembangan sel*sel di dalam otak# Menurut Leksono dan Sy"rul ikan nila memiliki kandungan gi+i yang lebi" baik ika dibandingkan dengan ikan air ta3ar lainnya seperti ikan lele# Kandungan protein ikan nila mera" sebesar 7H,6EI lemak ,01 EI kadar abu ,01E per 100 gram berat ikan nila# 9ibandingkan dengan ka4ang*ka4angan, telur, dan daging, protein ikan lebi" tinggi#Protein sangat bermanaat untuk merangsang sel pertumbu"an pada balita#Selain itu protein ikan uga sangat muda" di4erna, se"ingga baik untuk dikonsumsi ole" bal ita# <# Metode Biuret Suatu peptida yang mempunyai dua ikatan peptida ata lebi" dapat bereaksi dengan ion -u>> dalam suasana basa dan membentuk suatu senya3a kompleks yang ber3arna biru ungu# =eaksi ini dikenal dengan nama reaksi biuret $Poediadi dan Supriyanti, 2006'# Larutan protein dibuat alkalis dengan /aO. kemudian ditamba"kan larutan -upri Sulat $-uSO 7' en4er# i ini untuk menunukkan adanya senya3a* senya3a yang mengandung gugus amida asam $*-O/. 2' yang berada bersama gugus amida asam yang lain atau gugus yang lain seperti ( *-S/. 2, *-$/.'/.2, *-.2 /.2,
*-=./.2,
*-.O.-.2 /.2,
*-.O.-.2 /.2,
*-./.2-.2O.,
*-./.2-.O.#9engan demikian ui Biuret tidak "anya untuk protein tetapi +at lain seperti Biuretatau malonamida uga memberikan reaksi positi yaitu ditandai dengan timbulnya 3arnamera"*)iolet atau biru*)iolet#
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret @ntensitas 3arna tergantung pada konsentrasi protein yang ditera# Penentuan protein 4ara biuret adala" dengan mengukur opti4al density $O9' pada panang gelombang 520 ; 570 nm# Penentuan protein berdasarkan absorbansi sinar adala" 4epat, muda", dan tidak merusak ba"an#ntuk keperluan per"itungan uga diperlukan kur)a standar yang melukiskan "ubungan antara konsentrasi protein dengan opti4al density# Keuntungan dari spekrootometer * tampak ini adala" dilengkapi dengan alat perekam yang menyediakan plot absorban )s panang gelombang#
Selain metode biuret, terdapat beberapa metode analisis protein yang lain#
Lo3ry,
metode
spektrootometri
)isible
$Biuret',
dan
metode
spektrootometri # Ana!i,a Kua!itati- . =eaksi Jantoprotein Larutan asam nitrat pekat ditamba"kan dengan "ati*"ati ke dalam larutan protein# Setela" di4ampur teradi endapan puti" yang dapat beruba" menadi
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret kuning apabila dipanaskan# =eaksi yang teradi iala" nitrasi pada inti ben+ena yang terdapat pada molekul protein# =eaksi ini positi untuk protein yang mengandung tirosin, enilalanin dan triptoan# /. =eaksi .opkins*-ole Larutan protein yang mengandung triptoan dapat direaksikan dengan pereaksi .opkins*-ole yang mengandung asam glioksilat# Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air# Setela" di4ampur dengan pereaksi
.opkins*-ole,
asam
sulat
dituangkan
perla"an*la"an
se"ingga
membentuk lapisan di ba3a" larutan protein# Beberapa s aat kemudian akan teradi 4in4in ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut# 0. =eaksi Millon Pereaksi Millon adala" larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat#
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret Metode ini merupakan metode yang seder"ana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senya3a yang mengandung nitrogen# Sampel didestruksi dengan asam sulat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai se"ingga akan meng"asilkan amonium sulat# Setela" pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap se4ara kuantitati ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan se4ara titrasi# /. Metode itrasi ?ormol Larutan protein dinetralkan dengan basa $/aO.' lalu ditamba"kan ormalin akan membentuk dimet"ilol# 9engan terbentuknya dimet"ilol ini berarti gugus aminonya suda" terikat dan tida akan mempengaru"i reaksi antara asam dengan basa /aO. se"ingga ak"ir titrasi dapat diak"iri dengan tepat# @ndikator yang digunakan adala" pp, akgir titrasi bila tepat teradi peruba"an 3arna menadi mera" muda yang tidak "ilang dalam H0 detik# 0. Metode Spektootometri
lebi teliti perlu
dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan pengukuran absorbsi pada 260 nm# Pengukuran pada 260 nm untuk meli"at kemungkinan kontaminasi ole" asam nukleat# =asio absorbsi 2&0A260 menentukan aktor koreksi yang ada dalam suatu tabel#
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret V. ALAT dan BA4AN
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret
VI.
ALUR KERJA 1# Persiapan sampel
1 gram sampel Dihancurkan menggunakan mortar dan alu Ditambahkan air 10 mL Disentrifuge 3500 rpm 10 menit
Residu
Filtrat
2# Pembuatan standar
1 mL larutan standar protein
kadar 1 mg)ml kadar ( mg)ml kadar 3 mg)ml kadar * mg)ml kadar 5 mg)ml
!" 3 mL reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 3#$% selama 10 menit
Warna ungu yang stabil Diukur absorbansi masing&masing pada pan'ang gelombang 5(0 nm
Absorbansi
H# Penentapan absorbansi larutan blanko
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret
1 mL a+uades Dimasukkan kedalam tabung reaksi !" 3 mL reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 3#$% selama 10 menit Diukur absorbansinya pada pan'ang gelombang 5(0 nm
absorbansi
7# Penetapan absorbansi larutan sampel
1 mL larutan sampel Dimasukkan kedalam tabung reaksi !" 3 mL reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 3#$% selama 10 menit Diukur absorbansinya pada pan'ang gelombang 5(0 nm
absorbansi
Laporan Praktikum Biokimia 1 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret
VII.
4AIL PENGAMATAN
/o# Per4#
1#
Prosedur Per4obaan
Persiapan sampel
.asil Pengamatan
Sebelum (
1 gram sampel
− Sampel daging
ikan muair nila( ber3arna puti" − auades( larutan Dihancurkan menggunakan mortar dan alu tidak ber3arna Ditambahkan air 10 mL
Disentrifuge 3500 rpm 10 menit
9ugaanA=eaksi
Kesimpulan
− -uSO7#5.2O >
9ari per4obaan yang dilakukan dapat disimpulkan ba"3a rata*rata konsentrasi sampel alam 10 mL 8 7,1%56 mgAmL
2/aO. -u$O.'2 > /a2SO7 > 5.2O − -u$O.'2 , -u> >
2O.*
Sesuda" − Sampel > 10 mL
9ari "asil per4obaan isimulkan ba"3a "asil yang diperole" yaitu sebesar kadar protein pada ikan muair nila sebesar 7,1E dan tidak sesuai dengan teoritis#
.2O ( larutan puti" keru" − 9isentriuge (
Residu
endapan ber3arna puti", ?iltrat dan residu terpisa"
Filtrat
−
Kadar Protein ikan muair nila( 7H,6E
1#
Persiapan sampel
Sebelum (
1 gram sampel
− Sampel daging
ikan muair nila( ber3arna puti" − auades( larutan Dihancurkan menggunakan mortar dan alu tidak ber3arna Ditambahkan air 10 mL
Disentrifuge 3500 rpm 10 menit
− -uSO7#5.2O > 2/aO. -u$O.'2 > /a2SO7 > 5.2O − -u$O.'2 , -u> >
2O.*
Sesuda"
− Sampel > 10 mL
9ari "asil per4obaan isimulkan ba"3a "asil yang diperole" yaitu sebesar kadar protein pada ikan muair nila sebesar 7,1E dan tidak sesuai dengan teoritis#
.2O ( larutan puti" keru" − 9isentriuge (
Residu
9ari per4obaan yang dilakukan dapat disimpulkan ba"3a rata*rata konsentrasi sampel alam 10 mL 8 7,1%56 mgAmL
endapan ber3arna puti", ?iltrat dan residu terpisa"
Filtrat
−
Kadar Protein ikan muair nila( 7H,6E
2#
Pembuatan standar
Sebelum ( * Larutan standar 1 mL larutan standar protein protein ( Larutan tak ber3arna * <uades ( 4airan tak 1 mg)ml ( mg)ml 3 mg)ml * mg)ml 5 mg)ml ber3arna * =eagen biuret ( larutan ber3arna biru Sesuda" ( !" 3 mL reagen biuret * 5 mL lar#sampel Dikocok protein dengan Diinkubasi pada suhu 3#$% selama 10 menit kadar 10 mgAml dien4erkan dengan 10 mL auades ( Warna ungu yang stabil larutan tidak ber3arna $kadar Diukur absorbansi masing&masing pada pan'ang gelombang 5(0 nm 5 mgAml' * Larutan protein dengan kadar 7 mgAml ( larutan Absorbansi tidak ber3arna * Larutan protein
erbentuknya 3arna ungu menandakan adanya kandungan protein pada larutan standar
9isimpulkan ba"3a semakin tinggi kadar larutan standar maka 3arnanya akan semakin pekat ketika bereaksi dengan reagen biuret# 9an ketika 3arna larutan semakin pekat, maka nilai absorbansinya uga semakin tinggi
2#
Pembuatan standar
Sebelum ( * Larutan standar 1 mL larutan standar protein protein ( Larutan tak ber3arna * <uades ( 4airan tak 1 mg)ml ( mg)ml 3 mg)ml * mg)ml 5 mg)ml ber3arna * =eagen biuret ( larutan ber3arna biru Sesuda" ( !" 3 mL reagen biuret * 5 mL lar#sampel Dikocok protein dengan Diinkubasi pada suhu 3#$% selama 10 menit kadar 10 mgAml dien4erkan dengan 10 mL auades ( Warna ungu yang stabil larutan tidak ber3arna $kadar Diukur absorbansi masing&masing pada pan'ang gelombang 5(0 nm 5 mgAml' * Larutan protein dengan kadar 7 mgAml ( larutan Absorbansi tidak ber3arna * Larutan protein
*
*
dengan kadar H mgAml ( larutan tidak ber3arna# Larutan protein dengan kadar 2 mgAml ( larutan tidak ber3arna Larutan protein dengan kadar 1 mgAml ( larutan tidak ber3arna
9itamba" HmL reagen biuret( * k adar 5 mgAml 8 ungu $*' * k adar 7 mgAml 8 ungu $*' * k adar H mgAml 8 biru keunguan * k adar 2 mgAml 8 ungu $* * ' * k adar 1 mgAml 8 biru keunguan $*' 9iinkubasii (
erbentuknya 3arna ungu menandakan adanya kandungan protein pada larutan standar
9isimpulkan ba"3a semakin tinggi kadar larutan standar maka 3arnanya akan semakin pekat ketika bereaksi dengan reagen biuret# 9an ketika 3arna larutan semakin pekat, maka nilai absorbansinya uga semakin tinggi
*
*
dengan kadar H mgAml ( larutan tidak ber3arna# Larutan protein dengan kadar 2 mgAml ( larutan tidak ber3arna Larutan protein dengan kadar 1 mgAml ( larutan tidak ber3arna
9itamba" HmL reagen biuret( * k adar 5 mgAml 8 ungu $*' * k adar 7 mgAml 8 ungu $*' * k adar H mgAml 8 biru keunguan * k adar 2 mgAml 8 ungu $* * ' * k adar 1 mgAml 8 biru keunguan $*' 9iinkubasii (
3arna larutan tetap * abung 1 ( 0,026 * abung 2 ( 0,0%6 * abung H ( 0,1&2 * abung 7 ( 0,216 * abung 5 ( 0,H1
3arna larutan tetap * abung 1 ( 0,026 * abung 2 ( 0,0%6 * abung H ( 0,1&2 * abung 7 ( 0,216 * abung 5 ( 0,H1
H#
Penetapan absorbansi larutan blanko
1 mL a+uades
Sebelum ( * <uades ( larutan tidak ber3arna * =eagen biuret ( larutan ber3arn biru
Dimasukkan kedalam tabung reaksi !" 3 mL reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 3#$% selama 10 menit Diukur absorbansinya pada pan'ang gelombang 5(0 nm( Sesuda" *
absorbansi
<uades > biuret ( larutan ber3arna biru $*' * 9iinkubasi ( larutan biru $>'
Sesuai dengan teori "asil per4obaan dari auades dengan reagen biuret meng"asilkan larutan biru erni" yang digunakan sebagai pembanding
H#
Penetapan absorbansi larutan blanko
1 mL a+uades
Sebelum ( * <uades ( larutan tidak ber3arna * =eagen biuret ( larutan ber3arn biru
Dimasukkan kedalam tabung reaksi !" 3 mL reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 3#$% selama 10 menit Diukur absorbansinya pada pan'ang gelombang 5(0 nm( Sesuda"
Sesuai dengan teori "asil per4obaan dari auades dengan reagen biuret meng"asilkan larutan biru erni" yang digunakan sebagai pembanding
*
absorbansi
7#
Penentapan absorbansi larutan sampel
1 mL larutan sampel
<uades > biuret ( larutan ber3arna biru $*' * 9iinkubasi ( larutan biru $>'
Sebelum ( * Smpel protein ( larutan tak ber3arna * =egen biuret ( larutan ber3arna biru
Dimasukkan kedalam tabung reaksi !" 3 mL reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 3#$% selama 10 menit Diukur absorbansinya pada pan'ang gelombang 5(0 nm
absorbansi
Sesuda" ( * Sampel protein > biuret ( larutan ber3arna biru $*' * 9iink ubasi ( larutan biru $>', diperole" absorbansi ( abung 1( 0#2H abung 2 ( 0,2H5 abung H ( 0,276
9ari "asil kur)a standar diperole" ( y =0.0702 x −0.0432
dengan nilai regresi linear = 8 0,%&7# Sedangkan pada sampel diperole" nilai absorbansi sebesar 0,2H, 0,2H5, 0,276 Se"ingga diperole" konsentrasi rata*rata sampel ikan muair nila sebesar 7,1%56 mgAmL, dan kadar protein pada ikan muair nila sebesar 7,1E
7#
Penentapan absorbansi larutan sampel
1 mL larutan sampel
Sebelum ( * Smpel protein ( larutan tak ber3arna * =egen biuret ( larutan ber3arna biru
9ari "asil kur)a standar diperole" ( y =0.0702 x −0.0432
dengan nilai regresi linear = 8 0,%&7# Sedangkan pada sampel diperole" nilai absorbansi sebesar 0,2H, 0,2H5, 0,276 Se"ingga diperole" konsentrasi rata*rata sampel ikan muair nila sebesar 7,1%56 mgAmL, dan kadar protein pada ikan muair nila sebesar 7,1E
Dimasukkan kedalam tabung reaksi !" 3 mL reagen biuret Dikocok Diinkubasi pada suhu 3#$% selama 10 menit Diukur absorbansinya pada pan'ang gelombang 5(0 nm
Sesuda" ( * Sampel protein > biuret ( larutan ber3arna biru $*' * 9iink ubasi ( larutan biru $>', diperole" absorbansi (
absorbansi
abung 1( 0#2H abung 2 ( 0,2H5 abung H ( 0,276
VIII. ANALII DATA dan PEMBA4AAN
Prinsip kera penentuan kadar protein dengan metode biuret adala" menganalisis adanya ikatan peptida dengan 4ara menamba"kan reagen biuret kedalam
sample
yang
kemudian
di
ukur
absorbansinya
menggunakan
spektrootometer# Pada dasarnya suatu peptida adala" asil*asam amino, karena gugus ;-OO. dan ;/.2 membentuk ikatan peptida#Peptida didapatkan dari "idrolisis protein yang tidak sempurna#
VIII. ANALII DATA dan PEMBA4AAN
Prinsip kera penentuan kadar protein dengan metode biuret adala" menganalisis adanya ikatan peptida dengan 4ara menamba"kan reagen biuret kedalam
sample
yang
kemudian
di
ukur
absorbansinya
menggunakan
spektrootometer# Pada dasarnya suatu peptida adala" asil*asam amino, karena gugus ;-OO. dan ;/.2 membentuk ikatan peptida#Peptida didapatkan dari "idrolisis protein yang tidak sempurna#
' se"ingga perlu dien4erkan "ingga 20D dan larutan menadi 3arna larutan keru" $* *'# Pada per4obaan kedua, yaitu pembuatan larutan standar, terlebi" da"ulu membuat larutan standar dari larutan induk protein dengan kadar 10 mgAmL# Larutan standar protein tersebut terlebi" da"ulu dilakukan pengen4eran# Kadar pengen4eran yang diinginkan adala" 1 mg, 2 mg, H mg, 7 mg, dan 5 mg# Se"ingga
dilakukan pengen4eran ter"adap 1 mL larutan standar protein dengan kadar 10 mgAmL menggunakan labu ukur 10 mL# Berikut per"itungan yang diperole" untuk proses pengen4eran ( 1# 1M1 10 mgAmL # 1 1 2# 1M1 7 mgAmL # 1 1
8 2M2 8 5 mgAmL # 10 mL 8 5 mL 8 2M2 8 5 mgAmL # 10 mL 8 & mL
H# 1M1 8 2M2 7 mgAmL # 1 8 H mgAmL # 10 mL 1 8 ,5 mL 7# 1M1 8 2M2 H mgAmL # 1 8 2 mgAmL # 10 mL 1 8 6,6 mL 5# 1M1 8 2M2 2 mgAmL # 1 8 1 mgAmL # 10 mL 1 8 5 mL Setela" dien4erkan, larutan standar dimasukkan kedalam tabung reaksi# Selanutnya ditamba"kan dengan H ml reagen Biuret# Setala" kelima tabung terisi, diambil 5 mL reagen biuret larutan ber3arna biru $*' dan di4ampurkan pada kelima tabung# Se"ingga diperole" data ( * abung kadar 5 mgAml 8 larutan ber3arna ungu $*' * abung kadar 7 mgAml 8 larutan ber3arna ungu $*' * abung kadar H mgAml 8 larutan ber3arna biru keunguan * abung kadar 2 mgAml 8 larutan ber3arna ungu $* *' * abung kadar 1 mgAml 8 larutan ber3arna biru keunguan $*' =eaksi biuret merupakan reaksi 3arna yang umum untuk gugus peptida $* -O*/.*' dan protein# =eaksi positi ditandai dengan terbentuknya 3arna ungu karena terbentuk senya3a kompleks antara -u2> dan / dari molekul ikatan peptida# Banyaknya asam amino yang terikat pada ikatan peptida mempengaru"i 3arna reaksi ini# eradinya peruba"an 3arna larutan menadi 3arna ungu teradi karena -u2> membentuk kompleks dengan ikatan peptida pada suatu protein# Larutan standar tersebut kemudian dimasukkan pada 3aterbat" bersu"u Hselama 10 menit teradi peruba"an# Setela" 10 menit, larutan standar diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrootometer pada panang gelombang 570 nm# Berikut kur)a standar yang di"asilkan dari pengukuran absorbansi larutan standar (
4rak absorbansi 67 8onsentrasi 0.35 0.3
f/" 0.0#/ & 0.0* R 0.2
0.(5 0.(
absorbansi
Absorbansi 0.15
Linear absorbansi"
0.1 0.05 0 0
(
*
-
konsentrasi
Pada per4obaan ketiga yaitu penetapan absorbansi larutan blanko# Larutan ini digunakan sebagai pembanding yaitu langka" pertama diambil 1 mL auades larutan tak ber3arna dimasukkan ke dalam tabung reaksikemudian ditamba"kan dengan eagen biuret larutan ber3arna biru dan larutan tersebut diko4ok se"ingga diperole" larutan ber3arna biru $ * '# Langka" selanutnya yaitu larutan blanko ini di inkubasi pada su"u H - ditunggu sekitar 10 menit dan peruba"an 3arnanya tetap# Lalu diabsorbansi larutan standart pada panang gelombang 570 nm menggunakan alat spektrootometer *is# Pada per4obaan keempat adala" penetapan absorbansi pada larutan sampel, sampel yang digunakan adala" sampel ikan muair nila# Langka" yang "arus dilakukan adala" menimbang 1 gram sampel, yang kemudian di"aluskan menggunakan mortar dan alu# Selanutnya memasukkan sampel kedalam labu ukur 10 ml untuk dilakukan pengen4eran dengan 4ara menamba"kan auades "ingga batas miniskus# Selanutnya larutan disaring untuk mendapatkan iltrate berupa soluble protein yang akan digunakan untuk ui biuret# Kemudian diambil 1 ml sampel sebanyak H kali dan didistribusikan ke dalam tiga tabung reaksi#.al tersebut dilakukan untuk H kali replikasi sampel#Selanutnya sampel ditamba"kan dengan 7 ml reagen biuret# Penamba"an reagen biuret berungsi agar dapat teradi peruba"an 3arna pada sampel protein, yakni beruba" 3arna menadi ungu# Setela" larutan biuret ditamba"kan kedalam tabung, sampel dimasukkan kedalam
3aterbat" bersu"u H- selama 10 menit, se"ingga 3arnanya beruba" dari biru menadi ungu# Peruba"an ungu yang teradi pada masing*masing tabung disebabkan karena reagen biuret bereaksi dngan ikatan peptide yang ada pada protein yaitu berikatan dengan gugus ;-8O dan /., se"ingga terbentuk kompleks koordinasi antara -u dengan ala amino, dimana ala amino menggantikan posisi air, se"ingga reagen biuret dapat digunakan sebagai indi4ator adanya ikatan peptide, dan akan memberkan "asil positi)e dengan menunukkan 3arna ungu pada masing*masing tabung# Peruba"an 3arna larutan yang teradi menandakan reaksi tela" benar*benar sempurna teradi, karena seperti yang kita ta"u inkubasi selama 10 menit tersebut ungsinya adala" untuk memper4epat teradinya reaksi reagen biuret dengan larutan standart maupun dengan larutan sampel# Selanutnya sampel diukur absorbansinya menggunakan spektrootometer * )isible pada panang gelombang 570 nm# 9an didapatkan "asil absorbansi dan konsentrasi sebagai berikut (
Sampel 1 2 H
S
9ari data*data yang didapatkan di atas, dapat di"itung konsentrasi protein yang terkandung dalam ikan muair nila melalui persamaan y 8 aD > b yang diperole" dari kur)a standar dan data absorbansi sampel ikan muair nila# Se"ingga didapatkan kadar protein dalam sampel ikan muair nila sebagai berikut ( 1# Sampel 1 ikan muair nila ( y =0.0702 x −0.0432 0.273= 0.0702 x −0.0432
x = 4,5042
2# Sampel 2 ikan muair nila ( y =0.0702 x −0.0432
0.235 = 0.0702 x −0.0432
x =¿ H,%62% H# Sampel H ikan muair nila ( y =0.0702 x −0.0432 0.246 =0.0702 x + 0.0432
x =4,1197
Massa sampel telur ayam kampung ( 10,06& gram 8 1000,6& mg, maka ( mg 1000,68 mg =100,68 10 ml ml
=ata*rata konsentrasi sampel sampel ikan muair nila dalam 4uplikan 10 mL8 4,5042 + 3,9629 + 4,1197 3
=4,1956 mg / mL
Kadar protein dalam sampel ikan muair nila 8
4,1956 mg / mL
mg 100,68 ml
× 100 =4,71
Prinsip kera penentuan kadar protein dengan biuret ini adala" reaksi 3arna yang di"asilkan dari pembentukan senya3a kompleks antara ion -u 2> dan ikatan peptida pada protein ikan muair nila# =eaksi biuret bergantung pada pembentukan suatu kompleks antara ion -u 2> dan 7 atom /*peptida pada protein dalam suasana basa#arna yang di"asilkan pada sampel itula" yang akan diserap ole" sinar pada panang gelombang maksimum 570 nm, se"ingga meng"asilkan data absorbansi dan konsentrasi# Semakin pekat 3arna sampel yang artinya semakin tinggi kandungan protein pada sampel, maka data absorbansi yang di"asilkan uga akan semakin tinggi# Karena kepekatan 3arna pada sampel akan berpengaru" ter"adap penyerapan yang dilakukan ole" sinar # Melalui data tersebut, maka akan dapat diketa"ui berapa kadar protein yang terkandung dalam sampel ikan muair nila# Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan
metode yang lain# /amun metode ini menitik beratkan pada reaksi pembentukan kompleks antara reagen dan sampel# Sedangkan pada metode yang lain, mungkin saa protein pada sampel tak bereaksi sempurna dengan reagen yang lain# Se"ingga metode ini dipili" atau dianggap sebagai metode yang lebi" muda" dan eisien#
I5.
DIKUI Pada per4obaan yang tela" dilakukan diperole" nilai persentase dari ikan
muair nila sebesar 7,1E "al ini tidak sesuai dengan teoritis yang ada yaitu sebesar 7H,6E# .al yang menyebabkan ketidaksesuaian dengan teoritis antara lain pada saat pengambilan sampel, sampel yang digunakan terlalu sedikit se"ingga mempengaru"i pada larutan sampel yang akan diui# Kemudian dapat uga dikarenan ole" aktor pengen4eran# Pengen4eran pada sampel protein keu ini yaitu berungsi agar larutan sampel yang digunakan tidak terlalu pekat s"ingga dilakukan pengen4eran 20D dan larutan menadi tidak ber3arna# ?ungsi dari pengen4eran ini yaitu untuk menanba"akan konsentrasi pada sampe yang digunakan# Kemudian dapat uga dikarenakan su"unya yang terlalu ekstrem pada 3aktu penyimpanan, karena penyimpanan dilakukan di dalam lemari pendingin, dan ikan muair tidak terlalu segar, karena 3aktu pembelian ikan .*2 sebelum diui# Kemudian praktikan melakukan kurang telitinya dalam )olume sampel se"ingga ini semua dapat mempengaru"i "asil kadar protein ikan muair nila tidak sesuai dengan teoritis# 5. KEIMPULAN Berdasarkan per4obaan yang tela" dilakukan, tentang penentuan kadar
protein dengan metode biuret diketa"ui nilai absorbansi pada larutan standar protein dengan berbagaikonsentrasi maka akan diperole" persamaan kur)a standar
y =0.0702 x −0.0432
dengan nilai regresi linear = 8 0,%&7#
Sedangkan pada sampel diperole" nilai absorbansi sebesar 0,2H, 0,2H5, 0,276 Se"ingga diperole" konsentrasi rata*rata sampel ikan muair nila sebesar 7,1%56 mgAmL, dan kadar protein pada ikan muair nila sebesar
7,1E
5I.
JA6ABAN PERTAN#AAN 1# Buatla" kur)a standar konsentrasi )s absorbansi# 9engan bantuan kur)a
standar tersebut tentukan kadar protein sampelQ S
Sampel 1 2 H
WL 5*090 0.35 0.3
f/" 0.0#/ & 0.0* R 0.2
0.(5 0.(
WL 5*090
A/is :itle 0.15
Linea r WL 5*090"
0.1 0.05 0 0
1
(
3
A/is :itle
Sampel 1 ikan muair nila (
*
5
-
y =0.0702 x −0.0432 0.273= 0.0702 x −0.0432
x = 4,5042
Sampel 2 ikan muair nila ( y =0.0702 x −0.0432 0.235 = 0.0702 x −0.0432
x =¿ H,%62% Sampel H ikan muair nila ( y =0.0702 x −0.0432 0.246 =0.0702 x + 0.0432
x =4,1197
Massa sampel telur ayam kampung ( 10,06& gram 8 1000,6& mg, maka ( mg 1000,68 mg =100,68 ml 10 ml
=ata*rata konsentrasi sampel sampel ikan muair nila dalam 4uplikan 10 mL8 4,5042 + 3,9629 + 4,1197 3
=4,1956 mg / mL
Kadar protein dalam sampel ikan muair nila 8
4,1956 mg / mL
mg 100,68 ml
× 100 =4,71
2# akan membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein, se"ingga
meng"asilkan
3arna
ungu
yang
dapat
diidentiikasi
dengan
spektrootometer pada panang gelombang 520 nm#
DA7TAR PUTAKA
Le"ninger#<#L, 1%%5# Dasar-Dasar Biokimia# Grlangga, Fakarta
Cogyakarta#
inarno, ?#:# 1%%1# Kimia Pangan dan Gizi# Fakarta( Penerbit :ramedia# .al 61* 62
LAMPIRAN PER4ITUNGAN
Pengen4eran larutan standar dengan labu ukur 10 mL 1# 1M1 10 mgAmL # 1 1 2# 1M1 7 mgAmL # 1 1
8 2M2 8 5 mgAmL # 10 mL 8 5 mL 8 2M2 8 5 mgAmL # 10 mL 8 & mL
H# 1M1 7 mgAmL # 1 1 7# 1M1 H mgAmL # 1 1 5# 1M1 2 mgAmL # 1 1
8 2M2 8 H mgAmL # 10 mL 8 ,5 mL 8 2M2 8 2 mgAmL # 10 mL 8 6,6 mL 8 2M2 8 1 mgAmL # 10 mL 8 5 mL
Per"itungan konsentrasi sampel dari kur)a standar absorbansi )s konsentrasi S
Sampel 1 2 H
S
WL 5*090 0.35 0.3
f/" 0.0#/ & 0.0* R 0.2
0.(5 0.(
WL 5*090
A/is :itle 0.15
Linea r WL 5*090"
0.1 0.05 0 0
1
(
3
*
5
-
A/is :itle
Sampel 1 ikan muair nila ( y =0.0702 x −0.0432 0.273= 0.0702 x −0.0432
x = 4,5042
Sampel 2 ikan muair nila ( y =0.0702 x −0.0432 0.235 = 0.0702 x −0.0432
x =¿ H,%62% Sampel H ikan muair nila ( y =0.0702 x −0.0432 0.246 =0.0702 x + 0.0432
x =4,1197
Massa sampel telur ayam kampung ( 10,06& gram 8 1000,6& mg, maka ( 1000,68 mg mg =100,68 ml 10 ml =ata*rata konsentrasi sampel sampel ikan muair nila dalam 4uplikan 10 mL8
4,5042 + 3,9629 + 4,1197 3
=4,1956 mg / mL
4,1956 mg / mL
Kadar protein dalam sampel ikan muair nila 8
mg 100,68 ml
× 100 =4,71
