1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang begitu abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering terpikirkan sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat canggih.Padahal tidak selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi DNA sederhana terbukti efektif untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya yang sederhana, bahan-bahan yang dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan sekitar. Sangat cocok untuk praktikum pengenalan DNA pada siswa MTs/SMP juga MA/SMA. Berikut ini pembahasan tentang isolasi DNA secara sedasar teori. DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999). DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastid dan sentriol. Molekul DNA pada nukleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastid berbentuk lingkaran. DNA ditemukan pada semua makhluk hidup dari mikroorganisme sampai organisme tingkat tinggi misalnya manusia, hewan dan tanaman. DNA terdapat dalam sel dan inti sel. DNA dapat diekstrak dari segala macam organ yang terdapat pada bagian tubuh mahluk hidup bersel, misalnya pada tumbuhan dapat diekstrak dari daun, buah maupun dari batangnya (Muladno, 2002). Isolasi DNA ini dimaksudkan untuk mendapatkan DNA murni. Selain itu Muladno (2002) menjelaskan bahwa cara ekstraksi DNA dari berbagai sumber pada
1
prinsipnya adalah sama, akan tetapi ada beberapa modifikasi tertentu yang biasanya dilakukan agar dapat menghancurkan inhibitor pada masing-masing sumber tersebut. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: 1. Isolasi jaringan 2. Dinding dan membran sel dilisiskan 3. Diekstraksi dalam larutan 4. Dipurifikasi 5. Dipresipitasi Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.
1.2 Tujuan
Tujuan yang ingin di capai dalam praktikum ini adalah mahasiswa mampu mempraktikkan cara mengisolasi DNA sederhana.
2
II. TINJAUAN PUSTAKA
DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molekul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava dkk.2004:219). DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings, 1994). DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan
sifat
berbentuk
sirkular,
terdiri
dari
untai
ganda,
replikasi
semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis (Raven & Johnson 2002: 94).
3
Fungsi DNA adalah sebagai berikut : 1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup (Sadava dkk.2004:220). 2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59). Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk hidup dapat dilakukan suatu teknik isolasi DNA. Zubaidah (2004: 38) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994:254). Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan
4
buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Prinsip isolasi DNA mencakup berbagai tahap reaksi dengan tujuan yang berbeda-beda untuk setiap tahapnya. Menurut Clark (1963) tahap-tahap isolasi DNA tersebut adalah : -
Pelepasan DNA yang terlarut dengan cara merusak membran sel dan membran partikel subseluler misalnya asam nukleat.
-
Penguraian DNA protein kompleks dari denaturasi
-
Pemisahan DNA molekul yang lain Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA, dengan tujuan
untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik atau kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian perlakuan yang dapat merusak membran sel dan membran inti, misalnya menggunakan deterjen. Dengan adanya detergen ini dapat membantu mempercepat lisis sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks.
5
III. METODOLOGI 3.1 Waktu dan tempat
Praktikum dilaksanakan pada hari Kamis, 10 April 2014 pada pukul 10.0011.00 WIB di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sultan Ageng Tirtayasa. 3.2 Alat dan bahan
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah botol selai 20 buah, beker glass 250 ml 5 buah, pipet tetes 10 buah, saringan biasa 5 buah, kain penyaring 5 buah, kertas saring 75 lembar, blender 1 buah, corong glass 5 buah, tabung reaksi 15 buah, rak tabung reaksi 5 buah, spatula 5 buah, gelas ukur 250 ml 5 uah, timbangan 1 buah, stopwatch 5 buah, pisau skaple 5 buah, mortal dan pestle 5 buah, nanodrop, tube 1,5 ml, sudip, pipettor 100 mikroliter, vortex. Bahan yang digunakan yaitu buah-buahan ( melon, semangka, tomat, nanas, jeruk) bahan untuk 3 kelas @750 g, detergen bubuk, akuades, NaCl, etanol absolut (didinginkan dalam freezer kulkas). 3.3 Cara kerja
a. Buah dibersihkan dari kulitnya dan di timbang sebanyak 250 gram, ditambah 250 ml aquades, diblender selama 1 menit atau dihancurkan menggunakan mortal dan pestle. b. Disaring dengan penyaring biasa, kain saring dan kertas saring sebanyak 5 kali saring. c. Hasil saringan (alikot) diletakkan dalam beker glass. d. Larutan NaCl dan detergen dibuat dengan mencampurkan 1 sendok detergen ditambah 2 spatula NaCl lalu ditambah dengan 56 ml akuades, diaduk selama 15 menit hingga larut. Pengadukkan dilakukan secara perlahan agar tidak ada buih yang dihasilkan dari pengadukan.
6
e. Alikot yang sudah siap dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml, kemudian ditambah dengan larutan detergen-garam. Lalu diaduk secara perlahan agar tidak menghasilkan buih selama sekitar 3 menit. f.
Setelah 3 menit, alikot yang telah tercampur dengan larutan detergen-garam ditambahkan dengan etanol absolut dingin tetes demi tetes sebanyak 6 ml melalui dinding tabung reaksi.
g. Waktu pembentukkan dan ketebalan benang-benang DNA dicatat pada masing-masing jus buah. h. Benang-benang yang terbentuk diambul dengan menggunakan sudip, kemudian dimasukkan dalam tube 1,5 ml serta ditambahkkan aquades steril 100 mikroliter dan selanjutnya di vortex dan DNA disimpan dalam freezer bila tidak digunakan. i.
Ukurlah konsentrasi DNA dengan menggunakan alat nanodrop.
7
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil
Table 1. hasil penghitungan waktu dan pengukuran ketebalan benang-benang DNApada beberapajenis buah yang terbentuk. No
Nama Buah
Waktu (detik)
1
Jeruk
15,66
34,58
Keterangan Ada gumpalan mengambang dan terbentuk cincin
2
Semangka
29
29
DNA tidak terlihat/sedikit
3
Pepaya
7,01
5,42
Ada gumpalan sedikit dan tidak mengambang
4
Tomat
24
15
Nampak seperti cincin dan gumpalan yang sedikit mengambang
5
Melon
15
9
DNA tidak terlihat/sedikit
4.2 Pembahasan
Isolasi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari sel untuk mendapatkan DNA murni. Hasil akhir dari proses ini adalah strand-strand DNA dapat terpisah dari dalam sel dalam bentuk cincin seperti kabut putih yang terbentuk antara campuran ekstrak buah, detergen dan garam dengan alkohol. Sumber DNA yang digunakan pada praktikum kali ini adalah buah-buahan (jeruk, semangka, pepaya, tomat, melon). Proses memblender buah yang di gunakan sebagai sumber DNA bertujuan untuk merusak dinding sel, membran sel, dan membran inti secara mekanik. Dicampurkan dengan garam memiliki fungsi yang sama dengan SDS pada isolasi DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil (Harley 2005: 410). Selain itu, garam berfungsi untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lysing buffer . Garam juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang 8
dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994 dalam Jamilah, 2005:21). Dari pernyataan tersebut, dapat disimpulkan bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA. Sedangkan detergent berfungsi untuk melisiskan barrier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi 2+
untuk menghilangkan ion Mg yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler ynag dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang bisa “memakan” DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang sama dengan dodesil sulfat (Jamilah, 2005:11). Sedangkan menurut Machmud (2006), penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Pengadukan larutan bertujuan untuk untuk memperbesar pergerakan partikel sel dan detergen agar reaksi berlangsung cepat, karena detergent merupakan bahan yang dapat merusak membran sel. Tetapi jika pengadukannya terlalu cepat akan menimbulkan buih yang dapat menyebabkan terganggunya proses isolasi DNA. DNA akan sulit diamati karena terhalangnya penyatuan DNA di daerah atas antara etanol
9
absolut dengan campuran ekstrak buah, detergent dan garam akibat adanya rongga udara yang ditimbulkan oleh adanya buih. Setelah itu, campuran dari ekstrak buah, detergent dan garam tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi, ditetesi dengan etanol absolut dingin hingga terlihat adanya cincin seperti kabut putih yang terbentuk di antara campuran dengan etanol absolut. Berdasarkan analisis data yang diperoleh terdapat tiga lapisan yaitu lapisan terbawah adalah filtrat, lapisan tengah berupa benang-benang yang merupakan DNA, sedangkan lapisan teratas adalah etanol yang berwarna bening, karena etanol memiliki densitas (kerapatan) yang lebih kecil dibandingkan air. Strand-strand (suatu bahan yang kental dengan gelembung udara yang terperangkap di dalamnya) DNA yang terikat oleh etanol akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung di atas filtrat. Penambahan etanol dingin juga bertujuan untuk mempermudah proses presipitasi DNA. Sehingga DNA yang telah terkumpul akan mampu terpisah dari larutan dan membentuk lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya. Etanol bersifat polar sehingga dapat melarutkan DNA yang juga bersifat polar. Dari hasil isolasi DNA yang dilakukan, diketahui bahwa jenis detergen berpengaruh terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen tertentu memberikan pengaruh paling baik terhadap jenis buah tertentu pula dengan kadar air berbeda. Dari hasil yang di dapatkan bahwa buah pepaya memiliki waktu tercepat dalam pembentukkan DNA murni yaitu 7,01 detik dan 5,42 detik. Dikarenakan semakin sedikit kandungan air maka DNA murni yang di uji akan semakin terlihat. Tingkat kekentalan air pada buah pepaya lebih kental dibanding buah yang lain. Meskipun air yang terkandung di dalam buah pepaya lebih kental namun DNAnya tidak tampak mengambang. Mungkin ada kesalah dalam proses isolasinya atau harus menunggu lebih lama untuk dapat DNAnya mengambang ke atas. Tomat memiliki kandungan air yang cukup banyak, jadi DNAnya tidak Perbedaan kandungan air pada buah-buahan yang diuji kali ini sangat menentukan hasil dari isolasi DNA dalam pembentukkan DNA murni pada buah. 10
Buah-buah yang memiliki kandungan air yang tinggi sehingga membuat ekstrak uji menjadi encer, seperti semangka yang memiliki DNA murni hanya serabut-serabut tipis saja dengan waktu yang cukup lama dibandingkan buah-buah lainnya. Secara keseluruhan serabut putih yang tampak tidak terlihat terlalu jelas bila dibandingkan dengan buah lain. Anonim dalam Setiadi (2012), menyatakan bahwa dengan encernya larutan uji, maka kemungkinan terjadi lisis sel yang lebih besar daripada larutan uji yang kental. Mungkin pada uji yang dilakukan ini telah terjadi lisis pada ekstrak uji. Atau terjadi kerusakan saat pembuatan ekstrak karena pemblenderan yang terlalu lama. Hal ini juga ditunjukkan dengan lamanya serabut putih atauDNA yang telah terkumpul terangkat ke permukaan. Pada buah jeruk meskipun DNA terangkat ke permukaan cukup lama tapi DNA yang terlihat sangat jelas. Hal ini dikarenakan buah jeruk memiliki kadar air tinggi namun ada seratnya. Sedangkan pada buah melon meskipun kadar airnya lebih tinggi dibanding jeruk namun DNA yang terlihat tidak terlalu jelas meskipun waktu DNA terangkatnya pun lebih cepat dibanding buah jeruk. Dikarenakan pada buah melon kandungan airnya lebih encer dibanding jeruk. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
11
V.
PENUTUP
5.1 Simpulan
Tahap-tahap dalam isolasi DNA pada praktikum ini ada tiga. Tahap pertama dari isolasi DNA adalah penghancuran dinding sel dengan cara memblender bahan, Tahap kedua isolasi DNA adalah melisiskan sel dengan menambahkan detergent dan garam ke dalam campuran. Pemberian detergent berfungsi untuk membuka atau memecah membran sel (baik membran sitoplasma maupun membran nukleus. Tahap ketiga adalah pemurnian DNA. Cara ini dilakukan dengan manambahkan ethanol absolut dingin, berfungsi untuk memisahkan DNA dengna molekul-molekul lain. Buah pepaya memiliki waktu tercepat dalam pembentukkan DNA sedangkan yang paling lama dan paling tipis serabut-serabutnya adalah pada buah semangka. Dari lima buah yang di uji memang pepaya lah yang memiliki kandungan air yang cukup kental namun DNA yang dihasilkan tidak sebanyak pada buah jeruk. Buah jeruk memiliki kandungan air yang lumayan banyak tapi tidak berlebihan namnun buah jeruk memiliki serat pada buahnya. Buah jeruk waktunya paling cepat ke tiga setelah buah melon namun DNA yang terlihat pada buah jeruk sangat jelas dan mengambang ke atas. Sedangkan pada buah melon meskipun waktunya cepat tapi DNA yang terlihat sangat tipis hampir tidak terlihat. Pada buah tomat terlihat DNA tipis namun DNAnya sampai mengambang. 5.2 Saran
Praktikan lebih teliti lagi dalam melalukan praktikum. Karena satu kesalahan kecil maka hasilnya akan berbeda pula dengan dasar teorinya. Bertanya jika tidak tahu itu sangat penting dalam praktikum maka praktikan harus lebih aktif lagi.
12
DAFTAR PUSTAKA
Clark, M. John. 1963. Experimental Biochemistry. San Fransisco: WH Freeman and Company. Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel . Malang: Jurusan Biologi FMIPA UM. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Program Sarjana Biologi. Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of Genetics. Englewood : PrenticeHall Inc. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda Sadava. 2004. Basa Nitrogen DNA,(Online), (http://basa-nitrogen-dalam-dna-dan peranannya). Diakses tanggal 29 April 2014.
13
LAMPIRAN
Gambar 1. Alat dan bahan Gambar 2. Buah di timbang dan di hancurkan
Gambar 3. Ekstrak di saring 5 kali saringan
Gambar 4. Menambahkan larutan dan
dan dimasukan tabung reaksi
diaduk
Gambar 5. Mengambil dan menambahkan ethanol absolut dan di hitung waktu pembentukkan DNAnya 14
Gambar 6. Hasil
