LAPORAN LENGKAP PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI II ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI “PADA SPUTUM”
NAMA
:LUSIANA LAKUSA
NIM
: 16-3145-353-021
KELOMPOK
: I (SATU)
STIKes MEGA REZKY MAKASSAR PROGRAM STUDI DIV ANALIS KESEHATAN TAHUN AJARAN 2016/2017
BAB I PENDAHULUAN A. LATAR BELAKANG
Populasi mikroba di alam tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Populasi bakteri ini di dalam laboratorium dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologinya, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Pengamatan sifat-sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, pengkilatan dan sebagainya dapat dilakukan dengan pandangan biasa tanpa menggunakkan mikroskop, pengamatan ini disebut pengamatan makroskopi. Supaya sifat-sifat tersebut tampak jelas, bakteri perlu dibiakkan pada medium padat yaitu dengan cara isolasi bakteri. Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Cara isolasi bakteri dilakukan dengan metode tuang (pour plate), metode goresan (streak plate), metode miring (slant culture), dan metode tegak (stab culture). Praktikum kali ini kami menggunakan medium BHIB (Brain Hart Broth) NA (Nutrien Agar) sebagai media umum, medium BA (Blood Agar), medium KIA (Klinglen Iron Agar), dan Medium IMVIC (MIO, MR, VP, SCA, UREA, LIA). Dimana medium ini berfungsi sebagai tempat mikroba itu tumbuh. Mikroorganisme yang dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti sep erti apa jenis mikroorganisme mikroorgan isme yang akan ak an ditumbuhkan. Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik. Isolasi bakteri yang dilakukan pun bertahap dari Hari pertama hingga hari ke enam dengan medium yang berbeda-beda, dan memiliki tujuan yang berbeda pada masing-masing isolate media.
B. TUJUAN PRAKTIKUM
Mempelajari dan mempraktekkan beberapa tahapan dalam isolasi bakteri serta mahasaiswa
dapat
diinokulasikan.
mengidentifikasi
jenis
bakteri
yang
diisolasi
dan
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Serratia adalah bakteri gram negatif famili Enterobateriaceae yang memiliki flagella peritrik, sehingga bersifat motil. Habitat Serratia terutama di air dan tanah, pada permukaan daun, serta di dalam tubuh serangga, hewan, dan manusia (Khanafari et al ., 2006). Pemanfaatan bakteri merah sebagai agensia pengendali hayati belum banyak dilakukan, karena selain dianggap sebagai patogen lemah, masalah keamanan penggunannya juga masih dipertanyakan, sebab S .marcescens juga dikenal sebagai patogen oportunistik ada manusia. Serratia adalah genus bakteri Gram-negatif, fakultatif anaerobik dari bakteri Enterobacteriaceae. Spesies yang paling umum dalam genus, S. marcescens, biasanya satu-satunya patogen dan biasanya menyebabkan infeksi nosokomial. Namun, strain langka dari S. plymuthica, S. liquefaciens, S. rubidaea, dan S. odoriferae telah menyebabkan penyakit melalui infeksi. Anggota genus ini menghasilkan pigmen merah karakteristik, prodigiosin, dan dapat dibedakan dari anggota keluarga Enterobacteriaceae lainnya dengan keunikannya. produksi tiga enzim: DNase, lipase, dan gelatinase. Serratia dapat diucapkan dengan benar Serra-shia (common) atau Ser-hibah-a-a “. Serratia liquefaciens adalah bakteri berbentuk batang lurus dengan diameter 0,5-0,8 μm, panjang 0,9-2,0 μm, dan Gram negatif. Spesies Serratia biasanya bermotif dan mengandung flagella peritrichous. Serrati liquefaciens adalah anaerob fakultatif yang membuat oksigen menjadi tidak penting untuk bertahan hidup. Mereka dapat menghuni lingkungan aerobik dan anaerobik. Jadi, S. liquefaciens adalah bakteri luas yang ditemukan di lingkungan dan mampu menjajah di tanah, air, tanaman, dan saluran pencernaan hewan pengerat, serangga, ikan, dan manusia. Namun, perlu dicatat bahwa S. liquefaciens bukanlah komponen normal flora kotoran manusia. Tidak banyak yang sebenarnya diketahui tentang Serratia liquefaciens. Bahkan, sampai 1971, itu
sebenarnya dicirikan sebagai Enterobacter liquefaciens. Setelah perbandingan ekstensif dengan S. marcescens, E. liquefaciens bertekad untuk lebih dekat hubungannya dengan S. marcescens dan genusnya diubah menjadi Serratia. Setelah genus berubah, sedikit yang bisa ditemukan mengenai S. liquefaciens. Namun, penelitian saat ini sedang berlangsung pada mekanisme dan pengaruhnya terhadap patogen. Sejauh ini, telah terbukti memiliki khasiat antijamur tertentu di rhizosfer tumbuhan. Ini juga merupakan bakteri patogen yang telah dikaitkan dengan infeksi nosokomial parah. Informasi terbatas dapat ditemukan pada genom Serratia liquefaciens. Seluruh genom belum diurutkan sehingga ukuran dan isi genom lengkap tidak diketahui bersamaan dengan jumlah kromosom. Beberapa urutan parsial RNA ribosom 16S telah dianalisis dan ditunjukkan sebagai untai linier. Namun, kerabat dekat S. marcescens memiliki satu kromosom melingkar yang merupakan tanda tangan pada banyak spesies bakteri. Hal ini juga telah terbukti bahwa beberapa bakteri mungkin memiliki beberapa kromosom melingkar atau kromosom linier dan plasmid linier. Serratia liquefaciens memiliki struktur batang lurus yaitu Gram negatif. Organisme Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tipis yang dikelilingi oleh membran dalam dan luar. Spesies Serratia biasanya bermotif dan memiliki flagella peritrichous.
Klasifikasi dari bakteri Serratia liquefaciens: 1. Tatanan pesanan yang lebih tinggi Spesies 2. Deskripsi dan signifikansi 3. Struktur genom
4. Struktur sel dan metabolisme 5. Ekologi 6. Patologi 7. Penelitian dan Aplikasi saat ini untuk Bioteknologi 8. Referensi Klasifikasi
Domain: Bakteri
Filum: Proteobakteri
Kelas: Gammaproteobacteria
Pesanan: Enterobacteriales
Keluarga: Enterbacteriaceae
Genus: Serratia
Jenis
NCBI: taksonomi Serratia liquefaciens
Media adalah wadah atau tempat untuk pembiakan mikroorganisme dalam laboratorium memerlukan media berisi zat haara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroorganisme. Zat hara digunakan untuk pertumbuhan sintetis sel, keperluan energy dalam metabolism dan pergerakan. Lazimnya media biakan mengandung air, sumber energy, zat hara sebagai sumber carbon, nitrogen, sulfur, phospat, oksigen, hydrogen, serta unsur skelumit. Ada juga factor pertumbuhan pendukung lainya yaitu berupa asam amino, vitamin, atau nukleosida. Jenis – jenis media dibedakan menjadi 4 kategori secara umum : 1. Media Umum Secara rutin media selalu dissediakan di dalam lab misalnya nutrient agar, agar nutrient dan infusion broth dan lain-lain.
2. Media Enriched Organisme tertentu tidak dapat tumbuh dalam media nutrient media umum. Dikarenakan membutuhkan penambahan darah, serum, glukosa, telur dan lain-lain. Mendia yang meggunakan bahan penambah pertumbuhan guna meningkatkan kualitas media disebut Enriched,. Misalnya agar darah, agar cokelat dan lofer medium, Lowenstein Jensen. 3. Media Enrichment Adalah media cair yang berisi bahan kimia yang dapat menghambat pertumbuhan beberapa bakteri normal dan menumbuhkan bakteri pathogen. Yang mungkin terdapat dalam jumlah kecil pada specimen sehingga bakteri dapat tumbuh dengan baik dan daapat diperbanyak. 4. Diferentian media dan selective Media Merupakan media yang memiliki beberapa kandungan kimia yang memberikan ciri khusus pada bakteri yang berbeda melalui penampilan/ gambabaran koloni yang special dalam kultur, misalnya Mac Concay yang mengandung laktosa sebagai subtract dan merah netral sebaga indicator. Bakteri yang memfermentasikan laktosa, meproduksi asam dan akan merubah warna indicator dan koloni akan berubah menjadi warna merah. Sedangkan bakteri non laktosa (tidak memfermentasikan lactose) akan terlihat pucat. 5. Transport Media Transport media adlah media yang digunakan untuk mengirim specimen dari suatu tempat ke laboratorium pemeriksa, missalnya carry and blair, amies transport medium. Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi
terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar air flow Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton dan Sainsbury, 2006). Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu species dapat dipisahkan (plezar, 2006) Ada empat cara isolasi bakteri yaitu : 1. Pour plate Beberapa ml suspensi bakteri dicampur dengan mediaum yang masih cair (belum membeku) dengan demikian akan diperoleh piaraan adukan. Digunakan untuk mengencerkan atau mengisolasi yang terdapat pada contoh. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, koloni akan tumbuh pada permukaan dan bagian bawah agar. 2. Streak Plate Ujung kawat imokulasi yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-zag pada permukaan agar-agar dalam cawan Petri sampai meliputi seluruh permukaan. Untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan, yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme
menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel - sel yang digores. 3. Slant culture Ujung kawat yang membawakan bakteri digesekkan pada permukaan agar-agar miring dalam tabung reaksi. Dapat dilakukan dengan cara menggoreskan secaa zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarum ose yang bagian atasnya dilengkungkan. Cara ini juga dilakukan pada agar tegak untuk meminimalisir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen. 4. Stab culture Ujung kawat yang membawakan bakteri ditusukkan pada media padat (agar-agar) dalam tabung reaksi, berbeda dengan slant culture permukaan agar-agar ini tidak miring. Media agar setengah padat dalam tabung reaksi, digunakan untuk menguji gerak bakteri secara makroskopis. Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik (Buckle, 2007) Selain untuk tujuan diatas medium juga memiliki fungsi lain, seperti tempat untuk mengisolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang didapatkan. Agar tiap-tiap medium memilki karakteristik yang sesuai dengan tujuan sehingga seringkali digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba (Suriawiria, 2005). Beberapa indikasi pembiakan pada laboratorium mikrobiologi meliputi: 1. Pengasingan (isolasi) mikroba pada biakan bakteri 2. Menunjukan sifat khas mikroba.
3. Untuk menentukan jenis mikroba yang diisolasi dengan cara-cara tertentu. 4. Untuk mendapatkan bahan biakan yang cukup untuk membuat antigen dan percobaan serologi lainnya. 5. Menentukan kepekaan kuman terhadap antibiotik. 6. Menghitung jumlah kuman 7. Mempertahankan biakan mikroba. Mikroorganisme
tidak
memerlukan
banyak
ruangan
untuk
perkembangannya, sebab itu media buatan (agar) dapat dimasukkan ke dalam sebuah tabung percobaan labu atau cawan Petri. Pada permulaannya tabung atau cawan Petri harus dalam keadaan steril (bebas dari setiap mikroorganisme hidup) lalu setelah itu dimasukkan mikrobia yang diinginkan, tabung atau cawan harus dilindungi terhadap kontaminasi dari luar. Sumber utama pencemaran dari luar adalah udara, yang banyak mengandung mikroorganisme yang berterbangan. Bentuk cawan petri, dengan tutup yang saling menyelubungi, dirancang untuk mencegah pencemaran udara. Pencemaran tabung atau labu dihindari dengan cara menyumbat mulutnya dengan penutup yang cocok, biasanya dengan kapas. Permukaan luar cawan biakan yang menjadi sasaran pencemaran, dan bagian dalam labu atau tabung akan tercemar bila dibuka untuk memasukkan atau mengeluarkan bahan. Bahaya ini dapat dihindari dengan cara membakar bibir atau pinggiran cawan, tabung atau labu dalam api, segera setelah penutup dibuka dan dibakar sekali lagi pada waktu akan ditutup. Karakteristik koloni bakteri hasil inokulasi merupakan salah satu bagian dalam identifikasi bakteri. Beberapa bentuk koloni spesifik koloni bakteri pada media agar datar yaitu (Sutedjo dalam Sari, 2009) : 1. Ukuran Titik Kecil Sedang Besar
2. Warna koloni Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti 3. Bentuk koloni Bundar Tidak beraturan Rhizoid (tersebar seperti akar)
4. Bentuk bagian tepi koloni (margin ) Rata (entire) Tidak rata, bergelombang secara beraturan (lobate ) Bergelombang (undulate ) Bergerigi (serrate ) Seperti filamen (filamentous)
Untuk identifikasi bakteri pada makanan dan minum pada umumnya digunakan media seperti NA, BA, MC, TS IA, MIO, MR-VP, SCA, dan LIA. NA (Nutrient Agar) adalah media agar plate, yang menggunakan bahan dasar agar yang di tambahkan unsur-unsur hara atau nutrisi yang di butuhkan bakteri secara umum, tujuan digunakan agar dikarenakan agar tidak dapat diuraikan oleh bakteri sehingga pertumbuhan koloni dpat diamati. MC (Mac Conkay) dan BA (Blood Agar) adalah media selektif agar plate. Mac Conkay Agar memiliki persenyawaan dalam media yaitu laktosa, garam empedu, dan merah netral. Media ini menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif yang disedabkan oleh garam empedu dan kristal violet. Bakteri gram negatif yang tumbuh dibedakan dalam kemampuanya memfermentasikan laktosa.
Koloni dari bakteri yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan dapat dikelilingi oleh garam emmpedu. Endapan ini disebabkan oleh penguraian laktosa menjadi asam yang akan bereaksi dengan garam empedu. Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen. Golongan ini tidak memperlihatkan perubahan pada media, ini berarti bahwa warna koloninya sama dengan warna media, warna koloni dapat dilihat pada bagian koloni yang terpisah. Beberapa contoh pertumbuhan koloni pada media MC: Koloni
Mikroorganisme
Serupa media
Salmonella, Shigella
Merah dikelilingi oleh zone keruh
Escherichia Coli
Merah muda dan mukoid
Enterobackter Klebsiela
Kecil dan tidak terang tembus
Enterococcus Staphylococcus
Agar Darah (Blood Agar) media ini digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme yang sulit untuk dibiakan dan juga untuk membedakan kelompok mikroorganisme yang miliskan atau tidak melisis del darah merah. Agar darah terdiri dari bahan dasar yang mengandung 5% darah domba. Lisisnya sel darah merah dpat dilihat pada wilayah jernih disekitar koloni. Bilah proses lisis sempurna dapat dilihat dari wilayah yang benar-benar jernih dan jenis hemolisisnya disebut beta-hemolisis. Bila proses lisis tidak sempurna dan warna koloni kehijauan, maka jenis hemolisisnya disebut alpha-hemolisis. Bakteri yang tidak mampu melisiskan sel darah merah dan tidak menimbulkan perubahan nyata pada media disebut gamma-hemolisis. Kelompok mikroorganisme yang sering dibedakan
berdasarkan
kemampuan
melisiskan
sel
darah
merah
adalaj
streptococcus dan Staphylococcus. Proses hemolisis ini disebabkan oleh enzim yang dilepaskan oleh mikroorganisme. Uji Hidrogen Sulfida dengan menggunakan media yang mengandung polipetida dan kaya akan asam amino yang mengandung sulfur dan ion Fe++ salah
satu media tersebut yang digunakan adalah TSIA (Triple Sugar Iron Agar). Pada media ini H2S akan bereaksi dengan Fe++ membentuk FeS yang berwarna hitam. Jika lead acetat yang digunakan maka H2S akan bereaksi dengan Pb membentuk PbS yang berwarna Hitam. TSIA digunakan terutama untuk mengidentifikasi bakteri Gram-negatif. Media ini mengandung tiga macam gula yaitu glucose, laktose, sukrose, indikator merah fenol dan FeSO4 untuk memperlihatkan pembentukan H2S yang di tunjukan dengan adanya warna hitam. Reaksi yang dapat terlihat pada TSIA Butt bersifat Asam (Kuning)
Glukosa difermentasikan
Slant bersifat Basah (Merah) Pada
seluruh
media
terlihat
pembentukan asam. Seluruh media
Laktosa
atau
sukrosa
atau
keduanya difermentasikan.
berwarna kuning. Pembentukan gas di bagian butt
Pembentukan gas misalnya H2 dan
media kadangkala terpecah.
CO2
Endapan hitam di bagian butt
Pembentukan H2S
Seluruh media berwarna merah,
Ketiga
bagian butt dan slant berarna
difermentasikan.
macam
gula
tidak
merah (basah). Pada hari ke-5 dilakukan uji IMVIC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrat) Uji Indol atau penggunaan asam amino triptofan pada media MIO merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dapat dengan mudah digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Bakteri tertentu misalnya E.coli mampu menggunakan Triptofan sebagai sumber karbon.
E.coli
menghasilkan
enzim
triptofanase,
yang
mengkatalisasikan
penguraian indol dari triptofan. Dalam media biakan indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan molekul lainya Triptofan(asam piruvat dan NH4+) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme. Pembentukan indol dari triptofan oleh mikroorganisme dapat diketahui dengan menumbuhkanya dalam media biakan yang kaya dengan triptofan. Triptofan biasanya diberikan dalam bentuk tripton, suatu polipeptida yang kaya dengan residu triptofan. Penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan penambahan berbagai reagens. Reagens bereaksi dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan medium. Untuk uji ini diguanakan media semi padat yang kaya akan triptofan. Untuk melihat adanya indol dapat digunakan beberapa reagens yaitu Kovacs, Gore, Ehrlich, dan Ehrlich-Bohme. Semua reagen tersebut mengandung
para-
dimetil-aminobenzalde-hida. Dalam praktikum digunakan reagens Ehrlich Uji Methyl Red yang menggunakan media MR-VP untuk mengetahui fermentasi asam campuran dan fermentasi butanidol. Methyl Red digunakan untuk menentuakan
adanya
fermentasi
asam
campuran.
Beberapa
bakteri
memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhanya sehingga menjadi 5.0 atau lebih rendah. Penambahan indicator pH methyl red dapat menunjukan adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl red menjadi merah dalam lingkungan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam lingkungan pH 6.2. Fermentasi
asam
capuran
ditentukan
dengan
cara
menumbuhkan
mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan setelah masa inkubasi menambahkan reagen methyl red dalam kaldu. Bila terjadi fermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap berwarna merah. Bila tidak terjadi fermentasi asam campuran maka kaldu biakan akan berubah menjadi kuning
setelah penambahan reagens methyl red. Uji ini sangat berguna untuk identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan. Uji
Voges-Proskauer
uji
ini
digunakan
untk
mengidentifikasi
mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-butanidol. Bila bakteri memfermentasikan karbohidat menjadi 2,3-butanidol sebagai produk utama, akan terjadi penumpukan bahan terssebut dalam media pertmbuhan. Penambahan 40% KOH dan 5% larutan alphanapthol nalam ethanol dapat mentukan adanya asetoin (asetilmetilkarbinol), suatu senyawa pemuka dalam sintesis ,23-butanidol. Dalam penambahan KOH adanya asetoin ditubjukan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjalas dengan penambahan larutan alphanaphtol. Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena bagian 2,3-butanidol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi. Berdasarkan hal ini tabung yang berisi kaldu dikocok sehingga berbuih, kemudain dibuka tutup tabungnya dan dimiringkan diatas meja. Uji Voges-Proskauer sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk mengtehaui adanya 2,3-butanidol. Asetoin adalah senyawa pendahulu 2,3 butanidol dan selalu didapatkan secara serentak, sehingga uji VP abash untuk menentukan adanya 2,3-butanidol. Uji
Sitrat
digunakan
untuk
melihat
kemampuan
mikroorganisme
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energy. Unutk uji ini dapat digunakan medium sitrat-Koser berupa medium cair atau medium sitratSimon berupa medium padat. Siminon’s sitrat agar merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber carbon. NH4+ sebagai sumber N dan brom thymol blue sebagai indicator pH, sedangkan medium sitrat koser tidak menggunakan indikato. Bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam dapat dihilangkan dari medium biaka, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru
menunjukan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan
sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Sedangkat pada medium sitrat-Koser kemampuan meggunakan sitat ditunjukan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan.
BAB III METODE PRAKTIKUM A. ALAT DAN BAHAN 1) Alat Beker Glass Erlenmeyer Autoclave Incubator Tabung reaksi Rak tabung Ose bulat dan lurus Neraca Analitik Hot plate Batang Pengaduk Gelas ukur 2) Bahan Media bubuk (, MC, KIA, MIO, MR, VP, SCA, UREA, LIA, AC, BA) Aquadesh Sampel (Sputum) KOH Alfanaftol Reagen erlich B. PROSEDUR KERJA Pembuatan media NA, MC, BA, KIA, MIO, MR, VP, SCA, UREA, LIA I.
1) Disiapkan alat yang akan disterilisassikan diaautoclave selama 15 clave utmenit dengan suhu 1210c 2) Rumus penimbangan media X gram= gram x V2 ÷ 1000 3) Ditimbang media NA: 120 ml, MC:130 ml, BA: 130 ml, dan KIA: 70 ml, MIO: 183 ml, MR: 183 ml, VP:157 ml, SCA:616 ml , UREA: , LIA 216 ml 4) Ditimbang:
NA 0,72, dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian dicampurkan pada
erlenmeyer dan letakan diiatas hotplet sampai terlihat uap pada media tersebut MC:0,78 dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian dicampurkan pada
erlenmeyer dan letakan diiatas hotplet sampai terlihat uap pada media tersebut BA: 0,78 dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian dicampurkan pada
erlenmeyer dan letakan diiatas hotplet sampai terlihat uap pada media tersebut KIA: 0,84 dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian dicampurkan
pada erlenmeyer dan letakan diiatas hotplet sampai terlihat uap pada media tersebut MIO: 1,1 dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian dicampurkan pada
Erlenmeyer dan letakan diiatas hotplet sampai terlihat uap pada media tersebut
MR: 1,1 dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian dicampurkan pada erlenmeyer dan letakan diiatas hotplet sampai terlihat uap pada media tersebut
VP: 0.94 dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian dicampurkan pada
erlenmeyer dan letakan diiatas hotplet sampai terlihat uap pada media tersebut SCA: 3,7 dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian dicampurkan pada
erlenmeyer dan letakan diiatas hotplet sampai terlihat uap pada media tersebut LIA: 1,3 BA: 0,78 dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian
dicampurkan erlenmeyer dan terlihat uap pada media tersebut.
letakan diiatas hotplet sampai
BA: 0,78 BA: 0,78 dan ukur pH aquadest 7,00 kemudian
dicampurkan erlenmeyer dan
letakan diiatas hotplet sampai
terlihat uap pada media tersebut 5) Kemudian media ( KIA, MIO, MR, VP, SCA LIA UREA) dituangkan kedalam tabung reaksi. Pada tabung UREA, KIA, dan LIA dimiringkan sedangkan pada media (NA, MC, BA) dituangkan kedalam cawan petri kemudian didiamkan, setelah itu dibungkus dengan kertas dan dimasukan kedalam autoclave untuk disterilisasikan selama 15 menit dengan suhu 1210c. II.
Isolasi sampel Swab kulit ke media a. Hari pertama Isolasi dan identifikasi bakteri dari dahak
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan 2. Dengan menggunaka ose bulat diambil sampel pada bagian yang purulent atau berwarna kuning kehijauan. 3. Dan diisolasikan pada media BA, AC, dan MC. 4. Media diinkubasi dalam incubator selama 1x24 jam dalam 37oC. Dilakukan Pewarnaan BTA
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. 2. Dengan menggunakan ose buat preparat dahak ukuran 2x3 3. Diteteskan larutan carbol fuchsin hingga menutupi ppreparat. 4. Dan di panaskan sediaan dengan sulu api hingga keluar uap. 5. Dibilas sediaan dengan As. Alcohol 3% hingga sediaan memucat. 6. Dibilas sediaan dengan air mengalir. 7. Ditambahkan methylene blue diatas sediaan biarkan 10-15 detik. 8. Keringkan sediaan dan dibaca pada mikroskop 100x dengan oil emersi.
b. Hari ke-dua Diinokulasi bakteri yang telah tumbuh :
1. Bakteri yang telah tumbuh pada ketiga media kemudian dipilih salah satunya lalu diinokulasikan pada media TSIA dan MSA. 2. Diinkubasi dalam incubator selama 1x24 jam dengan suhu 370c Pewarnaan Gram :
1. Bakteri hasil inokulasi yang telah tumbuh pada media BA, AC dan MC dilakukan pewarnaan gram. a) Dimbil 1-2 koloni letakan pada objek glass difiksasi pada api Bunsen b) Ditambahkan 1-2 tetes gention violet (diamkan 3 menit) kemudian dicuci dengan air mengalir c) Ditammbahkan 1-2 tetes lugol (diamkan 1 menit) kemudiaan dicuci d) Ditambahkan 1-2 tetes aqudest 96% kemudian dicuci dengan air mengalir e) Ditambahkan 1-2 tetes air fuksin (diamkan 1 menit) kemudian dicuci dengan air mengalir f) Dikeringkan dan diamati dibawah mikroskop (40X dan 100X) 2. Jika bakteri gram positif coccus maka dilanjutkan dengan uji katalase dan ditanamkan pada media MSA. c. Hari ke-empat Diamati hasil dari media MSA dan KIA. Dan inokulasi bakteri ke
media IMVIC uji Biokimia. 1. Diinokulasikan bakteri ke media MIO, MR, VP, SCA, LIA, dan UREA. 2. Diambil pertumbuhan bakteri yang terdapat pada media KIA dan diinokulasi pada media MIO, MR, VP, SCA, LIA, UREA. Pada media dengan menggunakan ose bulat
3. Diinkubasi diinkubator selama 1x24 jam dengan suhu 370c d. Hari ke-Lima
Pengamatan pada uji biokimia, dilihat hasil dari uji kimia bakteri.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. HASIL a. Hari ke-2
Nama media
Ciri-ciri pertumbuhan bakteri
BA
Koloni
Tumbuh
dengan
pertumbuhan Beta hemolysis. AC
Koloni Tumbuh
MC
Koloni Tumbuh bulat warna merah.
b. Hari ke-3 Pengamatan pada mediaTSIA dari meida MC dan BA Nama
Ciri-ciri pertumbuhan bakteri pada KIA/TSIA
Media
Slunt
Butt
-
-
gas
H2S
-
-
BA AC MC
MSA BA
+
AC
_
c. Hari ke-4 Nama media
Keterangan
MIO a) Motiliy
Motoliti (-)
b) Indol
Indol (-)
c) Ornihine
Ornitin (-)
MR
MR (+)
VP
VP(-)
SCA
SCA(+)
UREA
UREA (-)
LIA
LIA (-)
B. GAMBAR 1. Hari pertama
Sampel dahak
Isolasi bakteri ke media BA
Media BA
Teknikk penggoresan Quadran
Media AC
Perlakuan sampel
Media MC
Perlakuan sampel
Dilakukan pewarnaan BTA
Carbol Fucsin
Hasil pewarnaan BTA
Hasil koloni bakteri dari media
Methilen Blue
HASIL Pewarnaan
Hasil koloni bakteri
Kolni pada media MSA
Proses Inokulasi
Hasil inokulasi ke mediA IMVIC
Proses inokulasi
Proses Inokulasi
HASIL UJI BIOKIMIA
2. PEMBAHASAN Dalam praktikum isolasi bakteri, memerlukan lingkungan dan medium
yang berisi zat hara untuk pertumbuhan sel, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme, dan pergerakan yang sesuai dengan mikroorganisme. Medium biakan yang digunakan untuk menumbuhkan mikrobia dalam bentuk padat, semi padat, dan cair. Yang digunakan dalam praktikum adalah medium padat yaitu agar, medium cair, dan semi padat. Diantaranya NA, MC, BA, TSIA, MIO, MR-VP, SCA, dan LIA, Medium-medium pada dasarnya untuk isolasi atau inokulasi bakteri diperlakukan sama yaitu diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37oC, ini berfungsi dalam isolasi sekaligus mengidentifikasi jenis bakteri berdasarkan morfologi dan karakteristik biokimia. Serratia adalah bakteri gram negatif famili Enterobateriaceae yang memiliki flagella peritrik, sehingga bersifat motil. Habitat Serratia terutama di air dan tanah, pada permukaan daun, serta di dalam tubuh serangga, hewan, dan manusia (Khanafari et al ., 2006). Pemanfaatan bakteri merah sebagai agensia pengendali hayati belum banyak dilakukan, karena selain dianggap sebagai patogen lemah, masalah keamanan penggunannya juga masih dipertanyakan, sebab S .marcescens juga dikenal sebagai patogen oportunistik ada manusia. Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna bagi laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan ini mempunyai tahapan penting
dalam
pencirian
dan
identifikasi
bakteri.
Pewarnaan
gram
memilahkan bakteri menjadi bakteri gram negatif dan gram positif. Bakteri gram positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violetyodium tetao dipertahankan walaupun diberi larutan pemucat (alkohol 96 %), sedankan bakteri gram negatif berwarna merah karena tidak mampu mempertahankan zat warna pertama sewaktu di tambahkan larutan pemucat. Pada hari ke-1 prkatikum untuk isolasi bakteri media yang digunakan adalah media MC, BA dan AC hasil yang didapatkan baktei tumbuh pada ke-
3 media namun pada media MC hanya tumbuh 1 koloni, dan bakteri BA menunjukan ciri-ciri berupa Beta hemolitik. Setelah pewarnaan gram hasil yang didapatkan adalah sebagai berikut pada media MC berua bakteri gram negatif batang, pada media BA hasil yang didapatkan adalah bakteri Coccus gram negatif, dan pada media AC hasilny adalah bakteri Coccobasil gram negatif. Pada hari ke-2 dan ke-3 diinokulasikan bakteri dari media BA dan AC ke media MSA, setelah diinkubasi 1x24 jam hasil yang didapatkan adalah pada media MSA inokulasi dari BA positif ditandai dengan warna kuning, diseluruh koloni yang tumbuh. Sedangkan pada media MSA inokulasi dari AC adalah negatif. Media MSA atau Manitol Salt Agar ini adalah media yang digunakan untuk membedakan Staphylococcus yang bersifat patogen dan non patogen. Hal ini dikarenakan media ini mengandung NaCl tinggi, sehingga mampu menghambat pertumbuhan bakteri namun bakteri Staphylococcus tidak dihambat, Staphylococcus akan membentuk zona warna kuning, sedangkan S.epidermidis akan membentuk zona warna merah. Warna kuning disebabkan oleh fermentasi manitol dosertai dengan pembentukan asam. Pada hari ke-4 dilakukan pengamatan uji biokimia IMVIC terhadap hasil inokulasi dari media sebelumnya. Hasil yang didapatkan pada masingmasing uji yaitu sebagai berikut : Pada media MIO yag dilihat adalah uji Idol setelah penambahan reagen Kovacs yang akan bereaksai dengan indol sehingga terbentuk warna merah pada permukaan medium, yang menunjukan bahwa tes indol positif (+) dan hasil yang didaptkan adalah positif(+). Kemudia uji motility pada uji motiliy dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya pergerakan dari bakteri jika terjadi pergerakan maka pada media akan terjadi pertumbuhan seperti kabut dan hasil yang di dapatkan adalah positif (+)
Uji media MR pada uji media MR hasil yang didapatkan adalah positif (+) hal ini di karenakan media MR-VP bertujuan untuk mengetahui hasil fermentasi asam campuran
atau fermentasi butanidol, sehingga pada
penambahan methyl red dapat menunjukan adanya perubahan pH menjadi asam yang ditandai dengan warna merah yang terbentuk. Uji Voges-Proskauer hasil dari uji VP adalah negatif (-), hal ini dikarenakan pada media bakteri tidak melakukan fermentasi karbohidrad menjadi 2,3-butanidol, dan hasil postif jika setelah penambahan 40% KOH dan 5% alphanaphtol maka akan terbentuk warna merah pada medium. Uji Sitrat adalah uji biokimia yang menggunakan media SCA. Hasil yang didapatkan adalah (-), hal ini dikarenakan mikroorganisme yang tumbuh tidak mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Hal ini postif jika mikroorganisme yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbom maka akan terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru. Uji Urea pada media urea agar, pada praktikum pengamatan bakteri pada media UA adalah untuk melihat adanya pembentukan urea oleh bakteri yang ditandai dengan urea positiff jika : media berubah menjaadi warna merah, urea negatif jika media tetap kuning, dan Lambat jika : Media berarna stengah merah setengah kuninng. Namun hasil praktikum menunjukan tidak ada pembentukan urea oleh bakteri. Uji LIA (Lysin Iron Agar) adalah media agar miring jika bakteri positif pada media LIA maka akan terbentuk perubahan warna media dari warna biru menjadi warna Keunguan, dan negatif jika tidak terjadi perubahan warna. Dan pada praktikum hasil yang didapatkan pada uji media LIA adalah LIA negatif karena tidak terjadi perubahan warna. Berdasarkan dari hasil identifikasi dan pengamatan pertumbuhan bakteri pada media uji Biokimia, hal tersebut mencirikan dari ciri-ciri bakteri Serratia sp (Serratia Rubidae).
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan
Dari hasil praktikum isolasi mikroorganisme dari sampel Sputum (Dahak) di dapatkan hasil sebagai berikut : 1. Pada media Mc hasil pewarnaan gram bakteri berupa batang gram negative. 2. Pada media BA hasil pewarnaan gram berupa bakteri cocus gram negative. 3. Pada media AC hasil pewarnaan gram Cocobasil gram negative. 4. Dan hasil uji Biokima menggunakan media IMVIC menunjukan ciri-ciri dari bakteri Seratia sp. B. Saran Saran saya adalah untuk praktikum berikutnya dapat lebih baik lagi dari
praktikum yang sekarang, dan diharapkan untuk praktikan agar lebih di tingkatkan lagi pemahaman tentang tujuan dan manfaat dari praktiukum dan sebaiknya praktikan memiliki buku panduan atau acuan sebagai pegangan pribadi.
