Isolasi dan Visualisasi DNA Genomik Bakteri Eschericia coli
Laporan Genetika Molekuler
Kelompok 4 :
Metta Padmalia
412008002
Jily Gavrila Sompie
412008018
Program Studi Biologi Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga 2011
I.
Pendahuluan
A. Latar Belakang Menurut
Micklos
et
al.
(2003),
elektroforesis
digunakan
untuk
memisahkan fragmen-fragmen DNA yang sudah dipotong sebelumnya, atau sama sekali belum dipotong. DNA merupakan materi genetik dalam organisme. Selain DNA, terdapat pula RNA sebagai materi genetik. Materi-materi genetik menyandi berbagai informasi untuk sintesis protein pada organisme. Salah satu perbedaan fundamental antara jasad prokaryot dan eukaryot adalah pada organisasi bahan genetiknya (Yuwono, 2008). Pada kelompok prokaryot, umumnya hanya ada satu unit bahan genetik utama yang membawa semua informasi genetik yang diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan jasad tersebut. Sebaliknya, pada kelompok eukaryot, bahan genetik utama terdiri atas beberapa unit independen yang terpisah, tetapi semua unit bahan genetik merupakan satu kesatuan genom yang menentukan kelangsungan hidup suatu spesies eukaryot (Yuwono, 2008). Isolasi DNA genom sangat penting dalam rangka pengklonan DNA atau gen sasaran. Konstruksi pustaka genom dan pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. Bila terpotongnya DNA bukan karena reaksi enzimatik, maka fragmen DNA tersebut sulit disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. Oleh sebab itu, isolasi DNA genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk pengklonan (Suharsono dan Widyastuti, 2006 dalam Anam, 2010). Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap (1) pemanenan sel, (2) perusakan dan pembuangan dinding sel, (3) lisis sel, (4) pembuangan remukan sel, serta (5) pemisahan DNA dari protein dan RNA. Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan
1
protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse. Molekul DNA yang telah diisolosi tersebut kemudian dimurnikan, misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi dikatakan baik apabila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak mengalami fragmentasi (Anonim, 2008). Fragmen-fragmen DNA yang telah diisolasi kemudian dielektroforesis, untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA. Elektroforesis merupakan teknik biologi sel untuk analisis DNA. Fragmen molekul DNA dapat ditentukan ukurannya melalui medium gel agarosa, suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (Yatim, 2003). Elektroforesis dilakukan berdasarkan ukuran makromolekul, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Kecepatan gerak molekul pada elektroforesis bergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya dan pada bentuk molekulnya. Fragmen yang kecil akan berjalan cepat, sedangkan fragmen yang berukuran lebih besar akan berjalan lebih lambat (Yuwono, 2008). Visualisasi terhadap hasil elektroforesis DNA yang telah diisolasi tersebut penting untuk dipelajari. Hasil tersebut merupakan pengetahuan awal untuk proses analisa dan riset di bidang biologi molekuler. Pengetahuan awal yang didapatkan akan mendasari penelitian-penelitian selanjutnya yang lebih mendalam, misalnya dampak obat dan antibiotik. Selain itu, kebutuhan masyarakat akan informasi genetik dan teknologi pun dewasa ini kian berkembang. Hal tersebut menyebabkan praktikum isolasi dan visualisasi DNA hewan merupakan hal yang sangat penting untuk dipahami dan dipelajari.
B.
Tujuan Praktikum
Untuk mengisolasi DNA genomik bakteri Eschericia coli secara bertahap dan mengamati hasil running dari DNA bakteri pada medium gel agarosa pada visualisasi menggunakan UV.
2
II.
Bahan dan Metode
A. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum dilaksanakan pada bulan November – Desember 2011; di Laboratorium Biokimia dan Biologi Molekuler, Fakultas Biologi, Universitas Kristen Satya Wacana, Salatiga.
B.
Alat dan Bahan
Beberapa alat yang digunakan adalah hot plate, stirrer, beaker glass 100 ml, cetakan gel agarosa, selotipe bening, sisir sumuran, centrifuge, seperangkat alat elektroforesis, tip, UV, microtube (ependorf), waterbath, vortex, wadah es, mortar, pestel, sarung tangan dan mikropipet. Beberapa bahan yang digunakan adalah agarosa, bibiter es dan selotip. Bahan analisis yang digunakan fenol:klorofom (50v:50v), ethanol 70 %, H 2O steril, ethidium bromida, buffer I (10 mM glukosa, 20 mM EDTA pH, 0,50 mm Tris pH 8,0), buffer II (0,2 M NaOH, 1% SDS), kalium asetat 5M, ethanol absolut, buffer TE, buffer TAE, dan buffer pewarna. Bahan uji yang digunakan adalah sampel DNA Bakteri E. coli.
C. Prosedur Kerja 1. Pemanenan Sel dari Kultur Bakteri
Kultur overnight (semalam) bakteri ( E. coli) dikultivasi ke media cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni bakteri ke media LB (Luria Bertani). Inkubasi dilakukan di dalam shaker-incubator dengan kecepatan o
rotasi 125 rpm pada suhu 37 C selama 16 jam ( overnight ). Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 16 jam tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam microtube kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm
selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang, sehingga dalam microtube hanya terdapat pellet. Ke dalam microtube berisi pellet kembali
dituangkan 1,5 ml kultur hasil inkubasi sebelumnya dan kembali diulang
3
memasukkan kultur inkubasi ke dalam tabung microtube sebanyak 1,5 ml dan disentrifugasi selama 5.000 rpm.
2. Perusakan dinding sel, lisis sel dan pembuangan remukannya
Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri. Pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE (Bufer Sodium Tris-EDTA) dengan cara vortex dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl o
lisozim dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 jam (dalam prakteknya tahap ini dilewati karena tidak terdapatnya lisozim pada laboratorium). Tabung sentrifuge hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis ditambah bibiter ( fresh), diresuspensi dengan cara digojog (± 1 menit). Ke dalam tabung ditambah 100 µl CI (kloroform Isoamil alkoholdan), 100 µl fenol dingin, diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi o
kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung sentrifuge dan diperkirakan besar volumenya. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan, diresuspensi dengan cara o
dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung sentrifuge yang baru dan diperkirakan besar volumenya.
3. Pemisahan DNA dari protein dan RNA
Supernatan tersebut ditambah Na asetat 3 M pH 5,2 sebanyak 0,1 volume supernatan dan etanol absolut sebanyak 2x volume supernatan. Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu o
20 C selama 2 jam.Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi o
kecepatan tinggi 13.000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl etanol 70%, diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi o
kembali dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit. Supernatan dibuang kembali, tabung dikeringkan, ditambah 50 µl TE dan
4
diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi DNA kromosom bakteri.
4. Elektroforesis dan visualisasinya
Untuk melakukan eletroforesis terhadap sampel, mula-mula gel agarosa dibuat dengan konsentrasi 0,8% (Lampiran). Agarosa ditambahkan pada pelarut buffer TAE. Campuran dididihkan dalam hot plate dan stirrer, kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang sudah diatur posisinya bersama sisir sumurannya, dan didinginkan hingga mengeras pada suhu ruang. Pada DNA yang telah diisolasi ditambahkan buffer pewarna sebanyak 4
L dan H2O steril 6 L. Setelah dicampurkan, microtube ditutup kembali
dan disimpan di dekat es batu, sementara dipersiapkan gel agarosa.Gel agarosa yang telah mengeras dikeluarkan dari cetakannya dengan hati-hati. Gel agarosa tersebut dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dengan hatihati pula. Selanjutnya, direndam dengan buffer TAE secukupnya. Campuran DNA E. coliyang telah diisolasi dimasukkan pada sumur gel agarosa dengan mikropipet P20. Chamber elektroforesis ditutup dan disambungkan dengan kabel
penghubung arus listriknya. Arus listrik 80 V dialirkan selama 2 jam, kemudian arus listrik dimatikan. Gel agarosa diambil, dicat dengan EtBr yang telah disiapkan selama 8 menit dalam ruang UV. Langkah terakhir, hasil elektroforesis DNA divisualisasikan dengan radiasi UV transilluminator.
5
III.
Hasil dan Pembahasan
A. Hasil
Sampel DNA bakteri E. coli diisolasi dengan menambahkan beberapa larutan/ senyawa tertentu dengan fungsi spesifik. Hasil isolasi DNA kemudian dielektroforesis dan divisualisasi untuk dianalisis DNA genomikyang terdapat pada E. coli tersebut (Gambar 1). b
c
d
e
a
f
h
g
Keterangan : a
: sumuran
e
: sampel DNA bakteri
b
: sampel DNA hewan
f
: DNA hewan (smear )
c
: sampel DNA tumbuhan
g
: DNA jamur (smear , tipis)
d
: sampel DNA jamur
h
: DNA bakteri (smear )
Gambar 1. Hasil visualisasi dari elektroforesis beberapa sampel DNApada gel
agarosa setelah diberi penyinaran UV (Dok. pribadi, 2011).
6
Pada hasil foto dari visualisasi elektroforesis, tampak adanya DNA hewan, jamur, dan bakteri yang tervisualisasi.Sedangkan dari sampel tumbuhan, DNA masih belum tampak. Pada sampel bakteri dan hewan, smear tampak jelas, berbeda pada jamur yang walaupun tampak tetapi sangat tipis.
B. Pembahasan Tahap pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA bakteri adalah pemanenan seluntuk mendapatkan pellet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya. Setelah sel dipanen, dilakukan pelepasan DNA dari sel. Hal yang harus diperhatikan dalam tahap tersebut adalah sebagai berikut. Dalam penghomogenan, harus sampai larut supaya enzim bekerja merata dan efektif. Selain itu, setelah diberi fenol dan dibolak-balik seharusnya terdapat lendir jika tutup tube dibuka. Lebih baik semua tahap dilakukan di atas es yang telah diserut, untuk menjaga suhu supaya dingin.Pemberian bibiter bertujuan untuk mencerna dinding sel. SDS dapat melarutkan protein membran dan enzim.EDTA mengikat 2+
ion Mg
sehingga mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein
membran hilang) dan menghambat DNAse (Muttaqin, 2010). Penggunaan pelarut organik akan menggumpalkan DNA dapat dilihat pada gambar berikut.
Gambar 2 . Pengaruh pemberian C-I untuk mempresipitasi DNA.
7
Gambar 3 . Pengaruh pemberian SDS dan EDTA terhadap dinding sel.
Tahap selanjutnya adalah pemisahan dan pemekatan DNA. Penambahan C-I dilakukan dua kali karena protein mungkin masih tersisa pada tube dari pembersihan dengan C-I pertama.Prinsip pemekatan DNA kromosom hampir sama dengan pemekatan plasmid.Penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. Etamol absolut dingin bertujuan mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid(Muttaqin, 2010). Etanol dapat mempresipitasi DNA karena penambahan garam berfungsi +
2+
sebagai penetral charge pada gula fosfat DNA. Ion-ion seperti kation (Na , Mg ) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif.Jika di dalam air, gaya +
elektrostatik antara ion + (Na ) dan
(DNA) masih lemah karena sebagian rantai
DNA masih berikatan dengan air (air memiliki 2 muatan (+) pada H dan
pada
O). Atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi.Fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tersebut. Atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na
+
sehingga
membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. Ilustrasinya sebagai berikut (Gambar 4).Selanjutnya, ditambahkan etanol 70% yang berguna untuk membersihkan lagi dan lebih memekatkan DNA(Muttaqin, 2010).
8
Gambar 4 . Ilustrasi pengaruh penambahan etanol dibandingkan dengan air pada
rantai DNA.
Setelah dilakukan tahap isolasi DNA bakteri E. coli , berikutnya dilakukan elektroforesis terhadap sampel tersebut. Elektroforesis ternyata telah dapat memberikan hasil visualisasi yang cukup baik pada sampel bakteri, demikian pula pada hewan dan jamur. Sayangnya masih belum digunakannya marker / penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. Namun, pada sampel DNA tumbuhan, tidak tampak hasil visualisasi. Diduga, ada tiga kemungkinan penyebab visualisasi yang kurang memuaskan. Pertama, DNA berukuran terlalu besar, sehingga tidak maksimal saat dielektroforesis. Dan yang kedua, electrophoresis migration rate yang dialami terlalu singkat, sehingga saat diamati di bawah UV, masih tidak tampak running jelas dari sampel hasil isolasi. Ketiga, dinding sel tumbuhan masih belum lisis karena tidak digunakannya nitrogen cair. Agar DNA yang terlalu besar dapat tervisualisasi dengan baik, maka voltage dapat diperkecil dan gel agarosa diencerkan. Sedangkan dugaan kedua,
yaitu running yang sedikit sekali terjadi karena waktu yang diberikan untuk elektroforesis cukup singkat, hanya sekitar satu jam. Mengingat ukuran DNA yang terlalu besar, maka apabila elektroforesis dilakukan hanya satu jam atau kurang, electrophoresis migration rate yang terjadi pada gel agarosa belum dapat menunjukkan keberadaan DNA yang berukuran besar tersebut (Becker et al., 2009).
9
Menurut Becker (2009), electrophoresis migration rate (migrasi rata-rata eletroforesis) selama DNA bergerak menembus gel agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor utama, yaitu sebagai berikut. 1. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat. 2. Konsentrasi gel agarosa Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan bergerak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarosa yang digunakan. 3. Konformasi DNA Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/ konformasi DNA. Ada tiga macam bentuk DNA, yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. 4. Penggunaan voltage (tegangan listrik) dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Misalnya,
untuk DNA
2 kb pada gel agarosa bergerak 5 v / cm. Untuk masing-masing
ukuran DNA yang bergerak ideal pada tegangan tertentu, menghasilkan laju migrasi yang berbeda. 5. Pengaruh temperatur Mobilitas DNA stabil pada temperatur 4-30 C dan elektroforesis gel agarosa dilakukan pada suhu kamar. 6. Keberadaan pewarna DNA Intercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence
untuk deteksi asam nukleat. EtBr akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single stranded atau double stranded asam nukleat (DNA atau RNA).
7. Komposisi buffer elektroforesis Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarosa. Misalnya tris-acetate ; umum dipakai untuk preparatif, kemampuan paling rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarosa.
10
IV.
Kesimpulan
Dari hasil yang didapatkan, dapat dilihat adanya DNA E. coli dari hasil visualisasi dengan menggunakan sinar ultra violet (UV). Dengan elektroforesis memberikan hasil memuaskan pada visualisasi DNA E. coli. Sayangnya masih belum digunakannya marker / penanda sehingga ukuran DNA yang tervisualisasi tidak dapat diketahui. Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA bakteri tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak), sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA. Jadi pada isolasi DNA Bakteri ini kita mendapatkan DNA yang belum benarbenar murni.
11
Daftar Pustaka Anam K. 2010. Laporan II – Isolasi DNA Genom. Institut Pertanian Bogor. Anonim. 2008. Isolasi DNA Kromosom Bakteri. (http://23bios1unsoed.wordpress.com/praktikum/petunjuk-praktikum/i-isolasidna-kromosom-bakteri/ ). Diakses tanggal 20 Oktober 2011. Becker, W.M., L.J. Kleinsmith, J. Hardin, dan G.P. Bertoni. 2009. The World of the Cell . San Fransisco : Pearson Education, Inc. Micklos, D.A, G.A. Freyer, dan D.A. Crotty. 2003. DNA Science – A First Course. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. Muttaqin M. 2010. Isolasi DNA Genom dan Polymerase Chain Reaction (PCR) Gen Penyandi 16s rRNA. ( http://biofin.wordpress.com/2011/03/17/isolasi-dnagenom-2/ ). Diakses tanggal 19 Oktober 2011. Pasande, R. 2006. Peningkatan Kemurnian Genom DNA Rumput Laut Melalui Penambahan Kalium Asetat dalam Metode Ekstraksi DNA. (http://www.rca prpb.com/UserFiles/File/BTLA%20vol%205%20no%202%202006/DNA%20rum put%20laut.pdf ). Diakses tanggal 27 Oktober 2009. Yatim, W. 2003. Kamus Biologi. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia. Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler . Jakarta : Erlangga.
12
Lampiran Pembuatan gel agarosa 0,8% pada cetakan
Ukur volume cetakan untuk membuat gel agarosa
Cetakan diberi selotip bening pada samping-sampingnya
Akuades dituangkan ke dalam cetakan yang sampingnya telah rapat oleh selotip
Diukur banyaknya akuades yang dituangkan dalam cetakan hingga cetakan tersebut penuh
Diketahui bahwa volume akuades untuk memenuhi cetakan adalah 35 ml
Gel agarosa yang hendak dibuat adalah 0,8%, sehingga agarosa yang dipakai dapat dihitung sebagai berikut. 0,8% x volume cetakan =
= 0,28 ml = 0,28 g
Jadi, sebanyak 0,28 g gel agarosa dilarutkan dengan pelarut buffer TAE hingga volume 35 ml, untuk memenuhi cetakan gel agarosa.
13
Komposisi masing-masing larutan yang ditambahkan untuk isolasi DNA bakteri
14
