LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK INSTRUMENTASI DAN BIOMOLEKULER
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
(ELISA)
Oleh : dr. Nurlaili Susanti NIM. 136070100111017
Pembimbing : Dr.dr.Loeki Enggar Fitri, MKes, SpParK.
PROGRAM STUDI MAGISTER BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2013
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah teknik biokimia yang
digunakan dalam imunologi untuk mendeteksi dan mengukur antigen dalam sampel (Walker dan Rapley, 2005). Tes ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen dan antibody dalam sampel dengan menggunakan enzim sebagai penanda (Lequin, 2005). ELISA banyak diaplikasikan di laboratorium klinis. Tes ini secara umum digunakan untuk mendeteksi protein dari patogen atau marker yang mengindikasikan adanya infeksi atau penyakit. Aplikasi umum ELISA dalam mendeteksi infeksi adalah dengan mengidentifikasi antibodi spesifik patogen dalam serum. ELISA secara rutin digunakan untuk diagnosis infeksi virus atau bakteri seperti hepatitis, antrax dan malaria, bahkan saat ini sedang dikembangkan untuk diagnosis infeksi HIV ( Human Immunodeficiency Virus) (Walker dan Rapley, 2005). Teknik ELISA didasarkan pada reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang memiliki sensitivitas dan spesifitas tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikator. Prinsip kerja ELISA adalah adanya ikatan antara kompleks antigen dan antibodi dengan penambahan substrat tertentu dan enzim peroksida yang akan memberikan perubahan warna pada hasil yang positif (Yusrini 2005). ELISA memiliki 4 teknik yaitu direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA dan competitive ELISA.
Direct ELISA merupakan metode ELISA yang paling
sederhana. Direct ELISA digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen pada sampel. Direct ELISA mendeteksi antigen dengan cara mengikat antigen dengan antibodi yang telah dilabel seara langsung dengan enzim. Reaksi pengikatan tersebut terjadi secara spesifik (Ausubel, 2003). Diret ELISA memiliki keuntungan
diantaranya lebih cepat karena prosedur dan reagen yang dibutuhkan lebih sedikit (Sylvest, L. 2010). Indirect ELISA banyak digunakan untuk mengukur konsentrasi antibodi.
Enzim diikatkan pada antibodi sekunder yang berikatan dengan antibodi primer. Antibodi sekunder biasanya adalah antispeies antibody dan sering dipakai antibody
poliklonal.
Indirect
ELISA
memeiliki
keuntungan
diantaranya
sensitivitasnya tinggi dan lebih hemat karena membutuhkan antibody berlabel yang lebih sedikit (Sylvest, L. 2010). Sandwich ELISA dicirikan oleh antibodi penangkap antigen yang diikatkan
pada fase padat. Teknik tersebut terdiri dari dua macam, yaitu direct sandwich ELISA dan indirect sandwich ELISA. Antibodi penangkap pertama kali diletakkan ke dalam well kemudian antigen dari darah atau urin ditambahkan ke dalam well sehingga berikatan dengan antibodi penangkap. Jika ke dalam well langsung ditambahkan antibodi detektor yang telah dilabel enzim maka disebut dengan direct sandwich ELISA, sedangkan apabila ditambahkan antibodi detektor yang
tanpa dilabel enzim terlebih dahulu disebut dengan indirect sandwich ELISA (Berg 2002). Prosedur ini memiliki keuntungan diantaranya spesifitasnya tinggi, dapat digunakan untuk sampel kompleks dan sensitif (Sylvest, L. 2010). Competitive ELISA adalah teknik paling kompleks yang digunakan untuk
mengukur
konsentrasi
antigen
atau
antibodi
dalam
sampel
dengan
mengobservasi campur tangan pada output sinyal yang diinginkan. Teknik ini sering digunakan ketika hanya ada satu antibodi tersedia untuk antigen yang diinginkan atau ketika sampel sedikit dan tidak dapat diikat oleh dua antibodi yang berbeda (Sylvest, L. 2010). Pengamatan hasil ELISA dilakukan secara kuantitatif maupun kualitatif. Hasil ELISA secara kuantitatif dapat diamati dari nilai optical density (OD) yang diukur dengan menggunakan ELISA reader . Hasil kuantitatif diinterpretasikan dalam perbandingan dengan kurva standar (purifikasi antigen) agar dapat secara tepat digunakan untuk menghitung konsentrasi antigen dalam berbagai sampel (Sylvest 2010). Hasil ELISA secara kualitatif dapat diamati dengan adanya
perubahan warna menjadi kuning pada reaksi pengujian jika sampel yang diuji mengandung antigen. Semakin tinggi intensitas warna yang terbentuk, maka semakin tinggi pula konsentrasi antigen pada sampel tersebut (Miller 2006). Data ELISA biasanya digambarkan dengan nilai optical density (OD) dan konsentrasi log untuk menghasilkan kurva sigmodial. Hal ini dapat dilakukan dengan menggambar grafik langsung atau dengan software curve fitting yang biasanya ada pada ELISA reader (Sylvest 2010).
1.2 Tujuan
Adapun tujuan dilakukan praktikum ini adalah untuk memahami prinsip kerja ELISA dan menjawab pertanyaan : 1. Antibodi apakah yang digunakan dalam praktikum? 2. Antigen apakah yang diuji? 3. Apakah perbedaan ELISA dan immunohistokimia? 4. Jelaskan kelebihan dan kekurangan ELISA ?
BAB II METODE PRAKTIKUM
2.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ELISA antara lain 96 well plate, multichannel pipet, tips, ELISA reader , dan ELISA washer . Bahan yang digunakan
pada praktikum ELISA adalah washing buffer , blocking buffer , antigen, antibodi penangkap (antibodi monoklonal atau antibodi poliklonal), 50 antibodi detektor yang telah dilabel dengan enzim phosphatase dan 75 substrat chromogenic.
Substrat
chromogenic dapat
berupa
4- methylumbelliferyl
phosphate (MUP) atau p- nitrophenyl phosphate (NPP).
2.2 Prosedur Kerja
Praktikum yang dilakukan menggunakan teknik direct ELISA. Adapun prosedur kerja yang dilakukan saat praktikum adalah sebagai berikut : 1. Siapkan reagen dan sampel sesuai instruksi telah disiapkan oleh laboran 2. Tambahkan 100µl sampel atau standar ke masing-masing well, inkubasi o
selama 2 jam pada suhu 37 C telah disiapkan oleh laboran, well hanya diisi sampel dengan konsentrasi berbeda yaitu 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,32 dan 0,16 3. Buang cairan pada masing-masing well, karena tidak memakai kit maka diberi coating buffer untuk menempelkan sampel pada well sehingga well harus dicuci 4. Tambahkan 100µl antibody berlabel biotin ke masing-masing well, inkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC saat praktikum, inkubasi hanya dilakukan selama 30 menit 5. Aspirasi dan cuci 3 kali
6. Tambahkan 100µl HRP-avidin ke masing-masing well, inkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC saat praktikum, inkubasi hanya dilakukan selama 30 menit 7. Aspirasi dan cuci selama 5 kali 8. Tambahkan 90µl substrat ke masing-masing well, inkubasi selama 15-30 menit pada suhu 37oC, lindungi dari cahaya saat praktikum, inkubasi dilakukan selama 15 menit, well ditutup dengan alumunium foil, inkubasi hanya dilakukan pada suhu ruang 9. Tambahkan 50µl stop solution ke masing-masing well. Baca pada ELISA reader dengan panjang gelombang 450nm selama 5 menit.
BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil
Adapun hasil yang terbaca pada ELISA reader adalah absorbance report , sebagai berikut : A
0,000
B
0,664
C
0,771
D
0,757
E
0,671
F
0,792
G
0,754
H
0,805
3.2 Pembahasan
Sampel yang digunakan dalam praktikum ini adalah serum darah manusia untuk mendeteksi protein rekombinan TLR4. Sampel diencerkan dengan konsentrasi berbeda yaitu 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,32 dan 0,16. Pemberian coating buffer pada praktikum bertujuan agar sampel dapat menempel pada well
karena tidak memakai standar kit, sehingga well harus dicuci terlebih dahulu sebelum diberikan antibodi. Antibodi yang digunakan adalah antibodi poliklonal. Washing buffer adalah larutan buffer yang berfungsi untuk menghilangkan
antigen dan antibodi yang tidak berikatan. Larutan yang digunakan saat praktikum adalah phosphate buffer saline (PBS). Inkubasi dilakukan agar antibodi dan antigen dapat saling berikatan dengan sempurna.
Pada saat praktikum,
inkubasi yang dilakukan kurang maksimal karena keterbatasan waktu. Enzim yang digunakan adalah HRP-avidin (Horseradish Peroxidase-avidin). Pemberian chromogenic substrate TMB akan menyebabkan substrat teroksidasi menjadi
hidrogen peroksida yang berwarna biru.. Setelah ditambahkan substrat, well
harus dilindungi dari cahaya agar tidak terpengaruh oleh warna sinar UV. Langkah terakhir adalah penambahan stop solution. Pada saat praktikum digunakan H2SO4, tujuannya adalah untuk menghentikan reaksi enzimatis sehingga berubah warna menjadi kuning. Langkah terakhir adalah pembacaan ( optical density ) OD dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm selama 5 menit. Hasil absorbansi yang didapatkan saat praktikum menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi nilai OD semakin kecil. Seharusnya pada konsentrasi lebih besar, nilai OD juga lebih tinggi. Hasil yang tidak konsisten ini kemungkinan dikarenakan prosedur praktikum yang dilakukan kurang standar seperti lama inkubasi dan suhu saat inkubasi yang lebih pendek dan rendah.
BAB IV KESIMPULAN
Kesimpulan dari pertanyaan praktikum : 1. Antibodi yang digunakan adalah antibodi poliklonal 2. Antigen yang digunakan adalah protein rekombinan TLR4 dari serum darah manusia 3. Perbedaan antara ELISA dan immunohistokimia adalah : Perbedaan Sampel
ELISA Serum, plasma, urine,
Immunihistokimia Jaringan
saliva Media
Multi well plate
Obyek glass
Pengukuran data
Kuantitatif atau
Kualitatif
semikuantitatif Enzim
HRP avidin
SA-HRP
Pengamatan
ELISA reader
Mikroskop
Antibodi
Primer
Direct (primer) Indirect (primer dan sekunder)
4. Kelebihan dan kekurangan ELISA dibanding Immunohistokimia adalah : Kelebihan : a. Teknik pengerjaannya relatif sederhana b. Hasil memiliki sensitivitas relatif tinggi c. Dapat digunakan mendeteksi antigen meskipun kadarnya sangat rendah Kekurangan : a. Antibodi yang digunakan adalah antibodi monoklonal yang harganya relatif mahal b. Pada beberapa teknik, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat control negative yang menunjukkan respon positif yang disebabkan inefektifitas
larutan blocking sehingga antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi berlabel enzim dan menimbulkan sinyal c. Reaksi antara enzim dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat
DAFTAR PUSTAKA
Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith & K. Struhl. 2003. Current Protocols in Molecular Biology . John Wiley & Sons, Inc., USA. Berg,
J.
M.
2002.
Indirect
ELISA
and
Sandwich
ELISA .
(Online).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov /books/NBK22420/ diakses 19 Oktober 2013. Lequin, RM (2005). Enzyme Immunoassay (EIA) / Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Clinical Chemistry . Miller, D. C. 2006. Mechanism of enhanced vascular cell response to polymeric biomaterials with nano-structured surface features . ProQuest Information
and Learning Company, Ann Arbor. Sylvest, L. 2010. An Introduction to ELISA. (Online). http://www.abdserotec.com /resources/elisa-technical-resources-and-troubleshooting/an-introductionto-elisa.html diakses 19 Oktober 2013 Walker, J. M. & R. Rapley. 2005. Medical biomethods handbook . Humana Press Inc., New Jersey.
