FQB 144 – Bioquímica I Lab 4: Purifcación de proteína
Carrera Biología
Purificación de proteínas 1. INTRODUCCIÓN En este laboratorio desarrollaremos un método asequible para aislar una proteína que se encuentra en una mezcla junto con otras 20 proteínas. Lograremos esto utilizando el programa “Protein Purification.” Esta aplicacin puede ser descargada para sus !ersiones "indo#s$ %ac&'($ Linu)$ *ndroid + iP,one$ o puede ser utilizada en linea mediante la !ersin -a!a del programa ,ttp/###.agboot,.compp1aja)inde).,tmllocale3es ,ttp/###.agboot,.compp1aja)inde).,tmllocale3es 4. * continuacin continuaci n se encuentra la descripcin del problema + algunas consideraciones que debe tomar en cuenta antes de comenzar el programa.
1.1. ESCENARIO 5sted ,a sido incorporado a un laboratorio de in!estigacin + se le ,a asignado la tarea de purificar una o m6s enzimas de la manera m6s econmica posible. (e le ,a facilitado todo el equipamiento + materiales que necesite. 7ambién cuenta con la a+uda de un técnico mu+ ,6bil pero no comunicati!o. comunicati!o. * 8ltimo 8ltimo minuto su super!isor !iaja en una !isita e)tendida para un laboratorio en el e)tranjero. En otras palabras$ usted est6 solo. 5sted debe tomar las decisiones e instruir al técnico seg8n su criterio. 9uena (uerte:
1. CO!EN"ANDO ;uando usted selecciona “;omienzo”$ podr6 seleccionar una nue!a mezcla + una proteína a purificar. *ntes *ntes de comenzar$ comenzar$ se debe registrar la proteína que se quiere purificar. (e le indicaran características sobre la acti!idad enzim6tica de la enzima que ,an sido identificadas identificadas pre!iamente. (u técnico ,a seleccionado tres anticuerpos monoclonales + un anticuerpo policlonal específico para su proteína.
1.# ESTRATE$IA 1.3.1 Consideraciones iniciales 7odas las células$ +a sean procariontes o eucariontes$ contienen decenas de miles de diferentes proteínas con un amplio rango de acti!idades biolgicas. La purificacin de proteínas es entonces central para cualquier an6lisis biolgico de su estructura + funcin. >o ,a+ un procedimiento 8nico para purificar + aislar todas las proteínas en forma pura$ pero e)iste un set de procedimientos utilizados para distinguir entre proteínas en base a características estructurales o funcionales específicas. (eleccionando los procedimientos adecuados + aplic6ndolos cuidadosamente en una secuencia de pasos$ es tericamente posible obtener un alto grado de purificacin + alto rendimiento de la proteína de interés. >o ,a+ un orden est6ndar en el cual estos procedimient procedimientos os puedan puedan ser efectuad efectuados os para obtener una purifica purificacin cin ptima. Por las diferenc diferencias ias estructur estructurales ales + funcionales entre las proteínas$ una secuencia ideal para una proteína$ ser6 posiblemente posiblemente incorrecta para otra. El conocimiento de las bases tericas de cada procedimiento$ permitir6 al in!estigador escoger un orden inicial de técnicas para intentar una purificacin. (in embargo el desarrollo de un protocolo optimizado in!olucra numerosa e)perimentacin de ensa+o + error para probar el potencial de cada paso de la purificacin. ?ndependientemente ?ndependientemente del esquema de purificacin adoptado$ se debe tomar en cuenta que las proteínas son moléculas l6biles. (u e)posicin a temperaturas moderadas Ej. @AB;4 causa su lenta denaturacin$ por lo que todos los pasos de la purificacin se deben efectuar en condiciones refrigeradas$ a menos que se especifique lo contrario. Las proteínas también son sensibles al pC$ por lo que se deben utilizar soluciones tamponadas + e!adir pCs e)tremos. Dinalmente las proteínas son m6s inestables en soluciones diluidas$ por lo que las soluciones de proteínas no se deben diluir m6s de lo necesario. 1.3.2. Aislamiento Aislamiento de proteína proteína en forma soluble *unque este programa simula la purificacin de proteínas desde una fase acuosa$ el punto de partida para la purificacin de !laborado por: "r# $ergio %uti&rre' Corte'
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una proteína es usualmente un culti!o bacteriano$ células !egetales$ de culti!o celular o un tejido u rgano de origen animal. El requerimiento inicial es liberar la proteína desde las células sin causar la pérdida de su acti!idad biolgica. 5n procedimiento e)tensamente utilizado para células animales es la ,omogenizacin. 9acterias$ le!aduras + células !egetales tienen paredes celulares gruesas que requieren el uso de métodos de disrupcin m6s dr6sticos$ como sonicacin + el uso de alta presin. 5na !entaja de la ,omogenizacin$ es que los ma+ores organelos se pueden conser!ar intactos$ por esto si la proteína est6 restringida en un organelo$ por ejemplo proteínas del n8cleo$ mitocondrias o lisosomas$ o quiz6s unida a la membraba celular$ se puede realizar una sustancial purificacin al efectuar un fraccionamiento celular. Posteriormente$ si la proteína deseada se encuentra en forma soluble en el interior del organelo$ puede ser liberada rompiendo el organelo con un detergente no inico o por sonicacin. 5na !ez que la proteína ,a sido liberada$ se puede purificar utilizando los métodos est6ndar simulados en este programa. 1.3.3. Elección de métodos de purificación Ca+ numerosos métodos de purificacin disponibles$ algunos de los cuales son m6s com8nmente utilizados. El diseo e)perimental de la purificacin para una proteína en particular depende principalmente de las propiedades funcionales + estructurales de la proteína de interés + de los contaminantes desde los cuales tiene que ser purificada. * continuacin ,a+ algunas líneas generales en la seleccin de técnicas pero se debe recordar que las condiciones precisas para la aplicacin de esos métodos$ se definen por e)perimentacin de ensa+o + error. ?4
Los primeros pasos de un esquema de purificacin son usualmente aquellos que tienen el menor poder resoluti!o$ como la precipitacin por sulfato de amonio$ o para algunas proteínas la denaturacin por calor. Estos procedimientos tienen la !entaja de reducir en gran manera la cantidad total de proteína en la muestra comparado con los procedimientos cromatogr6ficos$ que son tericamente capaces de alcanzar alta resolucin. Procedimientos de alta resolucin$ pero de poca capacidad$ como el isoelectroenfoque ?ED4$ pueden ser aplicados en las etapas finales de la purificacin cuando ,a+ relati!amente baja concentracin de proteínas$ para remo!er proteínas contaminantes remanentes e impurezas presentes en la muestra.
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Es típicamente m6s eficiente escoger una serie de métodos que apro!ec,an diferentes propiedades físicas o funcionales de las proteínas$ que una serie de pasos que e)ploten la misma cualidad. Por ejemplo esquemas de purificacin que utilizan columnas cromatogr6ficas de purificacin $ usualmente inclu+en un procedimiento de e)clusin por tamao filtracin por gel4 + un procedimiento de fraccionamiento por carga cromatografía de intercambio inico4
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*lgunas técnicas de fraccionamiento$ en partícular geles (<(&P*FE$ ?soelectroenfoque + electroforesis bi& dimensional$ no son utilizados usualmente como procedimientos preparati!os para purificacin de proteínas pero si para re!isar el progreso de la purificacin. Estas son técnicas analíticas de alta resolucin.
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'tra consideracin importante al escoger una técnica de fraccionamiento es el costo. *mbos$ el material consumido + el tiempo del personal consumido tienen que ser considerados/ *lgunas técnicas son relati!amente baratas + r6pidas$ como el tratamiento con calor + el fraccionamiento con sulfato de amonio$ mientras otros tienden a ser de alto costo + demandan la in!ersin de muc,o tiempo. Las técnicas particularmente de alto costo son las que consumen anfolitos$ como el isoelectroenfoque preparati!o. Por lo tanto$ mientras algunas técnicas
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aparecen a primera !ista mu+ atracti!as en términos de la alta resolucin que ofrecen$ a ma+or escala son poco pr6cticas$ por su alto costo.
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+a que esta depender6 de las capacidades intrínsecas de cada enzima. En cambio el aspecto importante es cmo la acti!idad específica cambia durante la purificacin. El grado de enriquecimiento de la enzima alcanzada en cada etapa puede ser calculada como se muestra a continuacin/
Ni%e& de purificación 3 acti!idad específica de la fraccin acti!idad específica original 5na purificacin e)itosa no slo tiene que aumentar la acti!idad específica de la enzima$ adem6s la enzima debe ser recuperada con un buen rendimiento. Esto puede ser calculado como sigue/
Rendi'iento 3 unidades de enzima luego del paso de purificacin ) =00M unidades de enzima en la preparacin original. >ote que el rendimiento de una enzima luego de una purificacin en particular puede ser baja no porque el procedimiento sea incorrecto para purificar la proteína$ pero porque produce inacti!acin de la enzima. 1.3.'. Medición de la pure"a En el paso final de la purificacin de la proteína$ cuando coincide el perfil de proteína + de acti!idad enzim6tica$ se puede creer que la enzima se encuentra purificada. La prueba de que la proteína se encuentra pura solo se puede obtener por secuenciacin química o por espectrometría de masas.
. INSTRUCCIONES 7rabaje en parejas + elabore un documento que entregar6 al final del laboratorio con las acti!idades que se describen a continuacin. El documento debe ser en!iado como pdf a sergioNN=NO+a,oo.es . *seg8rese de guardar el documento como Lab J1*pellido=&*pellido2.pdf. Entregue una copia impresa del documento el martes 2J a las =J/00 en clase. Parte I.
Para familiarizarse con el uso del programa$ ,aga clic en *+uda Ejercicios 7utoriales. En este tutorial$ usted encontrar6 una serie de preguntas + ejercicios a realizar. Qesponda a todas las preguntas inclu+a las gr6ficasesquemas pertientes4 en el documento separado que tendr6 que entregar al final del laboratorio. Parte II
El pen8ltimo ejercicio del tutorial consiste en la purificacin de la proteína =0 de una mezcla de 20 proteínas. Pruebe !arios esquemas de purificacin$ imprima pantalla para mostrar el progreso de la purificacin Digura =4 en cada caso. (eleccione el esquema que tiene el ma+or rendimiento posible + en el documento que entregar6$ discuta qué pasos en este esquema fueron cla!es para lograr este rendimiento. *djunte las figurasesquemas que sustenten sus argumentos.
(i)ura 1. Ta*&a de pro)reso de &a purificación Parte III
Qealice el 8ltimo ejercicio de este tutorial. Qealice las acti!idades propuestas en el programa$ adjunte sus resultados + discusin en el documento que entregar6 al final del laboratorio.
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+e*&io)rafía, 1. -ttp,///.uc&.ac.u0uc*cda*en2puren23'pur.-t'En esta p4)ina pueden re%isar &os funda'entos de &as t5cnicas de separación 6ue aparecen e& e& pro)ra'a. 7a8en -asta e& fina& de &a p4)ina 3 encontrar4n &in0s para cada una de &as t5cnicas.
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