Practica # 2: DIGESTION DE NUTRIENTES (AMILASA SALIVAL). UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE QUIMICA LAB. METABOLISMO – METABOLISMO – A
Daniel Ernesto Pabón Moreno
2110575
Valentina Hernández Espinosa
2111394
RESUMEN : la practica consistió en la determinación cualitativa de la actividad de la alfa-amilasa salival y los cambios en su actividad cuando es sometida a diferentes PHs y / o temperaturas. Para esto la práctica se dividió en tres partes, en la primera se realizaron pruebas cualitativas cualitativas con Lugol, Fehling A y B, para ver la reacción de la alfa amilasa. En la segunda parte se probó la actividad de la alfa amilasa ante los cambios de pH. Finalmente en la tercera parte se midió la actividad a la alfa amilasa al transcurrir el tiempo, cuando es sometida a diferentes temperaturas.
INTRODUCCION: Amilasa: La amilasa, denominada también sacarasa o ptialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 1-4 del componente α-Amilosa α-Amilosa al digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, se produce principalmente principalmente en las glándulas salivares(sobre salivares(sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene actividad enzimática a un pH de 7.
descomponiéndolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es más rápida que la β-amylasa. β -amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH óptimo está entre 6.7 y 7.2.
Alfa Amilasa: α-Amilasa (Figura 1) (Nombre alternativos: 1,4-α 1,4- α-D-glucanoglucanohidrolasa; glucogenasa) Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actúan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos,
Figura 1
Almidón: es una mezcla de dos polisacáridos: amilosa (10-20%) y amilopectina (80-90%), ambos formados por unidades de glucosa. La amilosa (figura 2) es el producto de la condensación de D-glucopiranosas por medio de enlaces glucosídicos glucosídicos a (1,4), que establece largas cadenas lineales con 200-2500 unidades y pesos moleculares hasta de un millón; es decir, la amilosa es una a-D(1,4)-glucana cuya unidad repetitiva es la a-maltosa. Tiene la facilidad de adquirir una conformación tridimensional helicoidal, helicoidal, en la que cada vuelta de hélice consta de seis moléculas de glucosa.
El licor de Fehling consiste en dos soluciones acuosas:
Sulfato cúprico cristalizado, 35 g; agua destilada, hasta 1.000 ml. Sal de Seignette (tartrato mixto de potasio y sodio), 150 g; solución de hidróxido de sodio al 40%, 3 g; agua, hasta 1.000 ml.
Ambas se guardan guardan separadas hasta hasta el momento de su uso para evitar la precipitación del hidróxido de cobre (II).
El objetivo del laboratorio fue determinar cualitativamente la actividad enzimática de la α-amilasa α -amilasa salival; asi mismo evaluar los efectos de pH y temperatura sobre esta.
Figura 2
MATERIALES Y METODOS Reacción de Lugol: la reacción del Lugol es un método que se usa para identificar algunos polisacáridos, como el almidón, el glucógeno y algunas dextrinas. El almidón en contacto con el reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta. Esa coloración se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. por lo tanto, no es una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta.
Reactivo de Fehling: Es una solución descubierta por el químico alemán vander Fehling y que se utiliza como reactivo para la determinación determinación de azúcares reductores.
- Baño termostatizado - Tubos de ensayo - Baño a 100oC - Papel de filtro - Embudo - Pipetas - Solución de almidón al 0,2% (preparar en agua destilada calentando) - Solución de Lugol (comercial) -Fehling A: 17,34 g CuSO4/100 ml agua (comercial) - Fehling B: (comercial) 173 g Tartrato sódico
pasado este tiempo se realizo pruebas de yodo, Fehling A y B a cada tubo.
1. Pruebas cualitativas Se numeraron 4 tubos de ensayo y a cada uno se le agrego lo siguiente: TUBO TUBO TUBO TUBO 1 2 3 4 2ml de 2ml de 2ml de 2ml de almidón almidón almidón almidón + 4 + 1 ml + + 0,5 gotas de 0,5 ml ml de de Fehling de saliva Lugol A y 1ml saliva (diluido) de Fehling B. Luego de preparados los tubos se procedió a incubar el tubo 2 a 100ºC, el tubo 3 y 4 a 35ºC por 15 min, y el tubo 1 solo se observó su coloración, se anoto resultado. Al tubo 2, se anoto resultado. Pasado el tiempo estipulado sele agrego al tubo 3, 4 gotas de Lugol, se anoto el resultado. Al tubo 4, se le agrego 1 ml de Fehling A y 1ml de Fehling B, sometiendo después a 100ºC, hasta cambio de color, se anoto resultado.
Se anotaron resultados.
3. Influencia de la temperatura en la velocidad enzimática. Se enumeraron tubos del 1 al 8, los cuales se distribuyeron de la siguiente manera: 1
2
3
4
2 ml de almidón
5
6
2ml de (diluida)
7
8 saliva
Agregados estos volúmenes en cada tubo se procedió a llevarlos de a pareja a diferentes temperaturas de la siguiente manera:
Tubos 1 y 5: Baño de hielo, por 15 min
Tubos 2 y 6: Temperatura ambiente, por 15 min.
Tubos 3 y 7: 37 ºC, por 15 min.
Tubos 4 y 8: Ebullición baño María, por 15 min.
2 .Efecto del PH sobre la amilasa salival Se enumeraron 3 tubos a los cuales se les agrego: TUBO 1
TUBO 2
2ml de HCl + 2ml de almidón + 2 ml de saliva diluida
2 ml de NaOH + 2ml de almidón + 2 ml de saliva diluida
TUBO 3 Agua destilada + 2ml de almidón + 2 ml de saliva diluida
Se procedió a agitar y tomar PH de cada tubo, se anoto resultado. Más tarde se sometieron a baño termostático a 37º C por 15 min, y
Terminado el tiempo estipulado, se procede a verter el contenido del tubo 5 (saliva), en el tubo 1 (almidón); esto se repitió de la misma manera entre cada pareja; luego se procede a dejar a sus respectivas temperaturas. temperaturas. Seguidamente Seguidamente en una placa multipocillo se procede a sacar muestras de cada tubo, cada minuto hasta completar 8 muestras; es decir 8 minutos; Finalmente estas muestras se someten a prueba con Lugol. Se observan los cambios y se anotaron resultados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Pruebas cualitativas
TUBO TUBO 1 2 2ml de 2ml de almidón almidón + 4 + 1 ml gotas de de Fehling Lugol A y 1ml (diluido) de Fehling B.
TUBO 3 2ml de almidón + 0,5 ml de saliva
TUBO 4 2ml de almidón + 0,5 ml de saliva
2ml de HCl + 2ml de almidón + 2 ml de saliva diluida
2 ml de NaOH + 2ml de almidón + 2 ml de saliva diluida
Agua destilada + 2ml de almidón + 2 ml de saliva diluida
Toma de pH TUBO 1
Tubo 1: Se observo un color morado
pH Azul. 1
TUBO 2
TUBO 3
Rojo. 12
Verde. 7
oscuro con tendencia a negro.
Tubo 2: Se observo un color azul marino, sin cambios después calentar a 37 ºC, por 15 min.
de
Resultados después de incubación TUBO 1
TUBO 2
TUBO 3
Morado oscuro
Morado claro
Marrón oscuro
2 fases:
Azul marino
Tubo 3: Se observo un color amarillo quemado, con presencia de precipitado color marrón.
Tubo 4: Se observo un cambio de color muy marcado en donde predominaron varias fases de colores naranjas y con presencia de precipitado. Discusión: en el tubo 1 se pudo verificar cualitativamente la presencia de almidón debido a su coloración por acción del lugol, en el tubo 2 la prueba para la determinación de azucares reductores fue negativa pues no se presento el color rojo propio de la oxidación del yodo; en el tubo 4 por acción de la α-amilasa α -amilasa que hidroliza los enlaces glucosídicos del almidón produciendo glucosa se puedo observar la presencia de azucares reductores presentándose un color rojo con precipitado.
PEDIR FOTOS
2. Efecto del PH sobre la amilasa salival.
TUBO 1
TUBO 2
TUBO 3
Yodo
Fehling Azul fuerte, A y sin Fehling precipitado B.
-azul oscuro. -azul claro con precipitado
Discusión: como se pudo observar en el tubo 1 por prueba de yodo se da muestra de la presencia de polisacáridos, pero no de azucares reductores pues el reactivo de fehling resulto negativo (color azul) con lo que se infiere que la α-amilasa α -amilasa salival fue inhibida a pH 1. En el tubo 2 se comprueba la presencia de almidon por yodo (color morado) y la poca presencia de azucares reductores (fehling color azul claro con precipitado) por lo que la α-amilasa α -amilasa salival tuvo una acción catalítica baja a pH 2. En el tubo 3 nuevamente se comprueba la presencia de polisacáridos, y la inactivación de la enzima α-amilasa α -amilasa (color azul marino). Según la teoría la α-amilasa posee mayor actividad catalítica a pH 7 por lo que este resultado pudo ser consecuencia de un artefacto o de la baja concentración de α-amilasa en la saliva extraida.
PEDIR FOTOS
3. Influencia de la temperatura en la velocidad enzimática.
BIBLIOGRAFIA Bello, L.A. y O. Paredes (1999) “El almidón: lo comemos, pero no lo conocemos”. Perspectivas, Perspectivas, 50 (3): 292933. Erbil Y, Ozluk Y, Giriş M, et al. (June 2007). «Effect of lugol solution on thyroid gland blood flow and microvessel density in the patients with Graves' disease». J. Clin. Endocrinol. –9 Metab. 92 (6): pp. 2182 –9 Maton Anthea; Jean Hopkins, Charles William McLaughlin, Susan Johnson, Maryanna Quon Warner, David LaHart, Jill D. Wright. Human Biology and
Health . Prentice Hall, 1993. Englewood Cliffs, Jason Mraz, Beyonce, New Jersey, USA. ISBN: I SBN: 0-13-981176-1
