UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA
PRACTICA N° 5 : METABOLISMO BACTERIANO PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS I. INTRODUCCION: El Metabolismo bacteriano consiste de un gran número de reacciones químicas destinadas a transformar transformar las moléculas nutritivas en energía y componentes estructurales necesarios necesarios para los microorganismos, dichas reacciones químicas son catalizadas por enzimas. Las necesidades mínimas para el crecimiento son una fuente de carbono, nitrgeno, una fuente de energía, agua y diversos iones. !unque el o"ígeno es esencial para unas bacterias, para para otras otras consti constituy tuye e una susta sustanci ncia a t"ic t"ica. a. Este Este tipo tipo de bacte bacteria rias s son conoci conocidas das como como anae anaerrobia obias s estr estric icta tas. s. En camb cambio io otra otras s bact bacter eria ias s como como Mycobacterium tuberculosis requier requieren en la presen presencia cia de o"ígeno o"ígeno molecular molecular para su crecimi crecimiento ento y en consecue consecuencia ncia se denominan !erobias estrictas y otras pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de o"ígenos a estas se les llama anaerobias facultativas. !unque algunas bacterias obtienen la energía de compuestos químicos otros lo toman directamente de la energía luminosa
II. COMPETENCIAS: COMPETENCIAS: !l #nalizar la sgte. $ractica el alumno ser% capaz de& ' (ealizar pruebas bioquímicas que son de utilidad general para la identi#cacin de bacterias. ' (ealiz ealizar ar las lectur lecturas as e interp interpre retac tacion iones es corre correspo spond ndien ientes tes de las prueba pruebas s bioquí bioquímic micas as efectuadas
III. MATERIALES Y MÉTODOS: )omogenizados de de ce cepas ba bacterianas ' *u *ubos co con !g !gar *+ *+ $lacas con !gar -utritivo ' *ubos con !gar L! $lacas con !gar Mac on/ey ' *ubos con agar +M+ $lacas con !gar 0L1 ' *ubos con !gar itrato de +imonds $lacas con !gar ++ ' *ubos con !gar 2rea de hristiansen *ubos con aldo -utritivo ' Mecheros !nzas de cultivo ' 3radillas
IV. IV. PROCEDIMIENTO PR OCEDIMIENTO A. DEGRADACIÓN DE GLUCOSA, LACTOSA, SACAROSA, PRODUCCIÓN DE GAS E H 2S ! "#$% A&'( TSI: )T($*+ A-'(, H$((%/ Medio empleado para la diferenciacin de enterobacterias en base a la fermentacin de los hidratos de carbono glucosa, sacarosa y lactosa y a la produccin de %cido sulfídrico Muestra& ultivos 4acterianos 4acterianos Medio de ultivo& *+
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(otular los tubos con medio de *+ oger una asa de siembra en punta y 5amear al ro6o vivo de6a enfriar oger un cultivo bacteriano y sembrar por picadura en el fondo y estría en la super#cie del medio *+ 5ameando la boca del tubo ncubar a 789 por :; hrs. (ealizar la lectura
L01(' $!0(*(0'$! #+ TSI: a< L' #&('#'$! # +%3 '-'(3 con formacin de %cido =acidez positiva< se mani#esta por un cambio de color del indicador R%4% # !%+ que hace virar ' el color color del del medio medio de de anaran6 anaran6ado ado ro6iz ro6izo o a amari amarillo, llo, en caso caso de acidez acidez y se simboliza simboliza con la letra !, ' o por un vira6 vira6e e del medio medio de anar anaran6a an6ado do ro6iz ro6izo o a ro6o ro6o intens intenso o en caso caso de alcali alcaliniza nizacin cin =alcalinidad positiva< y se simboliza con la letra >.
b< L' *(3!$' # &'3 se mani#esta por el resquebra6amiento del medio =3as positivo<. +e simboliza según su intensidad de ?@ a 7@. c< P(%#1$! # H2S& El tiosulfato es reducido por algunos gérmenes a %cido sulfhidríco, el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro que se mani#esta por un *($*$0'#% !&(% en el medio =):+ positivo<. +e simboliza de acuerdo a su intensidad de ?@ a 7@.
#/ L01(': ' ' ' '
$ico alcalinoAfondo alcalino =--<& -o hay fermentacin de azúcares. aracterística de bacterias no fermentadoras. $ico alcalinoAfondo !marillo =>A!< & 3lucosa fermentada, -i lactosa ni sacarosa fermentadas. $ico alcalinoAfondo !marillo y negro =>A!A) :+ @<& 3lucosa fermentada, -i lactosa, ni sacarosa fermentadas, produccin de %cido sulfhídrico. $ico !marilloAfondo !marillo = !A!A):+ ' <& 3lucosa y lactosa yAo sacarosa fermentadas. ):+ & -egativo.
B. DESCARBO6ILACION DE LA LISINA ! "#$% '&'( LIA: Esta prueba permite diferenciar los microorganismos que producen descarbo"ilacin o desaminacin de la lisina. +e puede detectar adem%s la produccin de ) :+ y es m%s sensible que el *+ para la deteccin ) :+ Es muy utilizado para descartar +almonella de aislamientos primaros. Muestra& ultivos 4acterianos Medio de ultivo& L!
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(otular los tubos con medio de L! oger una asa de siembra en punta y 5amear al ro6o vivo de6a enfriar oger un cultivo bacteriano sembrar tanto por por picadura central en el taco como por estría sobre la super#cie inclinada. ncubar a 789 por :; hrs. (ealizar la lectura
L01(' $!0(*(0'$! #+ A&'( LIA: La Lisina puede ser descarbo"ilada )D3'(7%8$+'$!/ por microorganismos L1 positivas, que la transforman en la amina cadaverina, esto produce un vira6e del indicador P-(*1(' # 7(%"%(3%+ a un color violeta intenso. +e simboliza con la letra >. $uesto que la descarbo"ilacin solo tiene lugar en un medio %cido =p) inferior a B< es necesario que se produzca previamente la acidi#cacin del medio de cultivo por fermentacin de la glucosa. Los microorganismo L1 negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un vira6e al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. +e simboliza con la letra !. La incubacin prolongada puede ocasionar una alcalinizacin en la zona de la super#cie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un vira6e al violeta. La produccin de ) :+ produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro producido.
C. DESAMINACIÓN DE LA LISINA ! "#$% A&'( LIA: Las cepas del grupo P(%013 9 P(%$#!$', con e"cepcin de algunas cepas de P(%013 "%(&'!$$, desaminan la Lisina a %cido alfa'cetocarbnico formando compuestos pardoro6izos en la super#cie del medio con la sal de hierro y ba6o la in5uencia del o"ígeno. +e simboliza con la letra (.
D. PRUEBA DE MOVILIDAD, HIDROGENO SULFURADO Y PRODUCCIÓN DE INDOL ! Medio de cultivo& A&'( SIM El medio +M es un medio semislido destinado a veri#car la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
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(otular los tubos con medio +M oger una asa de siembra en punta y 5amear al ro6o vivo de6a enfriar oger un cultivo bacteriano sembrar por picadura central en la columna vertical del medio ncubar a 789 por :; hrs. (ealizar la lectura
L01(' I!0(*(0'$!: La motilidad se pone de mani#esto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido e"clusivamente a lo largo de dicho canal. La formacin de ):+ se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento. La produccin de ndol pone de mani#esto la presencia de la Enzima *riptofanasa que degradar% el triptofano y liberar% al medio ndol que se combina con el aldehido =paradimetilbenzaldehido< presente en el reactivo de >ovacs, si hay indol se formar% un anillo ro6o en la super#cie.
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E. DEGRADACIÓN DEL CITRATO ! "#$% A&'( C$0('0% # S$"%!3 !lgunas enterobacterias tienen la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía Cinalidad& 1eterminar la utilizacin del citrato por bacterias como la única fuente de carbono. Medio de cultivo& !gar itrato de +imons
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(otular los tubos con medio *(!*D oger una asa de siembra en punta y 5amear al ro6o vivo de6a enfriar oger un cultivo bacteriano sembrar por estría en la super#cie del medio ncubar a 789 por :; hrs. (ealizar la lectura
L01(' $!0(*('0$! La degradacin del citrato como única fuente de carbono origina la alcalinizacin del medio. Este aumento de p) se visualiza con el indicador '1+ # 7(%"%0$"%+ que vira a azul oscuro, dando una reaccin positiva =itrato @< si el crecimiento es visible y como reaccin negativa =citrato '< si no cambia de color
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F. DEGRADACION DE LA UREA Evalúa en las bacterias la capacidad de utilizar la urea como fuente de nitrgeno, mediante la enzima ureasa, que degrada la urea en di"ido de carbono y amoniaco. El amoniaco actúa como fuente de nitrgeno y capta protones, transform%ndose en amonio y alcalinizando el medio. ontiene ro6o fenol como indicador de p), el cual vira el medio a fucsia cuando el p) se torna alcalino. Cinalidad& 1eterminar la hidrlisis de la 2rea por bacterias. Medio de cultivo& !gar 2rea de hristensen
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(otular los tubos con medio 2rea oger una asa de siembra en punta y 5amear al ro6o vivo de6a enfriar oger un cultivo bacteriano sembrar por estría en la super#cie del medio ncubar a 789 por :; hrs. (ealizar la lectura
L01(' I!0(*(0'$! # +%3 (31+0'#%3. La positividad viene dada por una coloracin rosada o fucsia en el medio. E6m Proteus sp es positivo para la prueba
G. AGAR M CON;EY : El !gar Mc on/ey es un medio +lido, 1iferencial y +electivo para el aislamiento de Enterobacterias
$ermite diferenciar bacterias que fermentan o no, la lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de gran parte de la 5ora 3ram positiva.
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(otular las placas oger una asa de siembra en aro y 5amear al ro6o vivo de6a enfriar oger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la super#cie del medio ncubar a 789 por :; hrs. (ealizar la lectura
F1!#'"!0%: $or fermentacin de la lactosa, se producir% %cido lo que disminuye el p) alrededor de la colonia. Esto produce un vira6e del color del indicador de p) =ro6o neutro<, y dar%n al medio un aspecto ros%ceo con un halo turbio debido al descenso del p) provocados por los %cidos biliares en las colonias. +i por el contrario son Lactosa ='< el medio se alcalinizar% por el uso de la peptona y se tornar% amarillo o incoloro
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L01(' I!0(*(0'$!
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Las colonias lactosa positivas son ro6as o rosadas con un halo turbio debido al descenso de p) •
Las colonias Lactosa negativas son incoloras
H. A&'( 6LD : El !gar 0L1 =0ilosa Lisina 1eso"icolato< es un medio selectivo y de diferenciacin, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de enterobacterias patgenas especialmente del género +almonella, +higella y $rovidencia. ' '
' '
La "ilosa se incorpora en el medio dado que la fermentan pr%cticamente todos los entéricos, e"cepto +higella, y esta propiedad hace posible la diferenciacin de dicha especie La lisina se incluye para permitir la diferenciacin del grupo +almonella de los organismos no patgenos, dado que, sin lisina, +almonella fermentaría r%pidamente la "ilosa y no se distinguiría de las especies no patgenas. uando la +almonella agota el suministro de "ilosa, la lisina es atacada por la enzima lisina descarbo"ilasa, lo que genera un cambio a un p) alcalino que imita la reaccin de +higella. 2tiliza el deso"icolato de sodio como agente selectivo y, por consiguiente, inhibe los microorganismos gram positivos El tiosulfato y la sal de hierro revelan la formacin de %cido sulfídrico por la precipitacin de sulfuro de hierro produciendo un color negro en las colonias.
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(otular las placas oger una asa de siembra en aro y 5amear al ro6o vivo de6a enfriar oger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la super#cie del medio ncubar a 789 por :; hrs. (ealizar la lectura
L01(' $!0(*(0'$!: La degradacin de la "ilosa, lactosa y sacarosa a %cido produce un vira6e al color amarillo alrededor de las colonias por su indicador ro6o de fenol =0ilosas @< Las bacterias que descarbo"ilan la lisina, produciendo cadaverina, se reconocen por la presencia de un color ro6o púrpura, debido al aumento de p), alrededor de sus colonias =0ilosas '< •
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I. AGAR SS )SALMONELLA Y SHIGELLA/ E"*+% I!0(*(0'$!:
Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de especies de +almonella y +higella a partir de muestras clínicas, heces y de alimentos El verde brillante, la bilis de buey y la elevada concentracin de tiosulfato y de citrato inhiben considerablemente la 5ora acompaFante, bacterias 3ram positivas, la mayoría de bacterias 3ram negativas on el tiosufato e iones de hierro se pone de mani#esto la formacin de sulfuro por el ennegrecimiento de las correspondientes colonias. Las colonias de coliformes quedan seFaladas por la demostracin de la degradacin de lactosa a %cido, a cargo del indicador de p) (o6o de fenol
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(otular las placas oger una asa de siembra en aro y 5amear al ro6o vivo de6a enfriar oger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la super#cie del medio ncubar a 789 por :; hrs. (ealizar la lectura
L01(' $!0(*(0'$!: Las colonias de gérmenes Lactosa @ son rosadas hasta ro6as Las colonias de gérmenes lactosa G negativas son incoloras Las colonias de microorganismos formadoras de ) :+ presentan un centro negro.
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V. RESULTADOS: El alumno deber% dibu6ar cada uno de los medios utilizados del color de inicio y las variaciones de color que éstos tuvieron con su debido fundamento, ordenadamente. H. CUESTIONARIO: I$or qué es necesario a6ustar el p) del medioJ I$ara qué se aFade el agar'agarJ IKué cualidades tiene esta sustanciaJ •
PRINCIPALES PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS M#$% # 1+0$%
P(17' ):+
TSI
3lucosa, +acarosa y Lactosa, 3as
I!#$'#%( *iosulfato de sodio y sulfato ferroso (o6o de fenol burbu6as de aire o resquebra6amiento del medio
C%+%( $!$$'+ (o6o naran6a (o6o naran6a
C%+%(
R31+0'#%
-egruzco !marillo
):+ =@< ):+ ='<
!marillo ro6o
!cido& ! !lcalino& >
3as =burbu6as< -o 3as
3as =@< 3as ='<
LIA LIA C$0('0% # S$"%! 3
1ecarbo"ilas a
$úrpura de 4romocresol
1eaminasa
$úrpura de 4romocresol
itrato
Motilidad
!zul de bromotimol *ransparencia del medio
violeta
Hioleta intenso !marillo
violeta
(o6izo
1ecarbo"ilacin =@< 1ecarbo"ilacin ='< 1eaminacin =@<
!zul Herde
itrato =@< itrato ='<
verde transpare nte
SIMS ):+
ndol
UREA
2reasa
M C%!= 9
Cermentaci n de la Lactosa
6LD
Cermentaci n de la 0ilosa
SS
Cermentaci n de la Lactosa
*iosulfato de sodio y sulfato ferroso $aradimetilbenzaldeh ído =reactivo de >ovacs<
*urbidez del medio -egruzco
Motilidad =@< ):+ =@<
transpare nte transpare nte
(o6o de fenol
amarillo
(o6o -eutro
olor del medio
(o6o de fenol
ro6o
(o6o de fenol
$urpura ba6o
!nillo 3rosella !nillo !marillo
ndol =@< ndol ='<
(osado amarillo olonias rosadas . incoloras
2rea& @ 2rea& ' Lactosa @ Lactosa '
olonia amarillas incoloras (osadas ncoloras
0ilosas @ 0ilosas ' Lactosa @ Lactosa '
