LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA PRÁCTICA NÚMERO 4 Facultad de Ciencias Médicas Cátedra de Microbiología Tercer Semestre
COLORACIÓN DE ZIEHL-
REALIZADO POR: POR: JESSICA G. JIMÉNEZ B. REVISADO POR: DR. ROBERTO AGUIRRE
Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador
UNIDAD DE COMPETENCIA: Iden Identi tifi fica carr prác prácti tica came ment nte e los los micr microo oorg rgan anis ismo moss pató patóge geno noss co con n los los alteraciones orgánicas por ellos producidas: con responsabilidad y orden ELEMENTO DE COMPETENCIA: 4.- Comprende los pasos necesarios para realizar la tinción de Zhiel Neelsen además además de recono reconocer cer los microo microorga rganis nismos mos Zhiel Zhiel Nee Neelse lsen n positi positivos vos con orden e iniciativa. NÚCLEOS DE CONOCIMIENTO: 4.- Técnica de tinción – Coloración de Zhiel Neelsen. Realización de tinción de Ziehl Ziehl-N -Neel eelse sen n a part partir ir de expec expecto torac racion iones es de los los prop propios ios alumn alumnos os.. Visualización de tinciones de Ziehl-Neelsen positivas. ACTIVIDADES TRABAJO AUTÓNOMO: Guía Guía de prác prácti tica cass desc descrip ripti tiva va.. Re Real aliza izaci ción ón de de una una co colo lorac ración ión Zieh Ziehll Neelsen y visualización en el microscopio. CRITERIOS DE EVALUACIÓN: Comprender la aplicabilidad clínica de la tinción Gram y la morfología bacteriana en cuestión de distinción entre Gram positivas y Gram negativas. •
“La razón habla, la ignorancia y el error gritan” anónimo.
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Coloración de Ziehl Neelsen. OBJETIVOS: Realizar la tinción de Ziehl-Neelsen a partir de expectoraciones de los propios alumnos. Visualizar las tinciones de Ziehl-Neelsen positivas. •
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FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial que se basa en que las paredes celulares de ciertas ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos átomos de carbono) carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-acido, después de la tinc tinció ión n co con n co colo lora rant ntes es bási básico cos. s. La Lass micob micobac acte teri rias as abso absorb rben en los los colorantes solo muy lentamente debido a la elevada proporción de ceras y lípidos en la pared celular. Para acelerar la absorción del colorante fuscina y así la formación del complejo micolatofusina en la pared celular, se calienta la solución de fuscina fenicada aplicada sobre el preparado normalmente hasta la formación de vapores. Una vez que las micobacterias han absorbido el colorante, difícilmente lo ceden a pesar del tratamiento con solución decolorante alcohol-ácido clorhídrico. Por esto se denominan bacilos alcohol acido resistente o BARR y aparecen en el preparado microscópico teñidas de rojo, mientras que todos los microorganismos no resistentes a los ácidos se tiñen de acuerdo con la contratinción.1 Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos ácido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterimum Mycobacterimum tuberculosis tuberculosis son patógenos muy importantes importantes para los humanos.2
MICOBACTERIAS. Las micobacterias son bacilos aerobios no formadores de esporas, existen más de 50 especies de Mycobacterium, las cuales incluyen muchas que son saprófi saprófitas tas.. Entre Entre las especi especies es consid considera eradas das patógenas tenemos tenemos al M. tuberculosis cuyo único reservorio es el humano, es el agente causal de la tuberculosis pulmonar y diseminada. El M. leprae en el causante causante de la lepra y al igual que en el M. tuberculosis su reservorio es el humano. Mycobacterium bovis tamb también ién esta esta co cons nside idera rado do dent dentro ro de este este grup grupo, o, origina una enfermedad similar a tuberculosis.3 Otras especies especies potencialmente patógenas avium men humanos tales como: el M. aviu intr intrac acell ellul ular are e y las atíp atípic icas as co con n frec frecuen uenci cia a infectan a pacientes con SIDA, son patógenos oportunistas en otras personas inmunodeficie inmunodeficientes, ntes, y en ocasiones ocasiones producen enfermedad en pacientes pacientes con sistema inmunitario normal.3
Las Las mico micoba bact cter eria ias s no cons consti titu tuye yen n el ún únic ico o grup grupo o qu que e tien tienen en Nocardia ia y Lass espe especi cies es de Nocard propiedades alcohol-acido resistentes. La Rhodococcus pose poseen en una una alco alcoho holl-ac acid ido o resi resist sten enci cia a parc parcia iall así así co como mo “La razón habla, la ignorancia y el error gritan” anónimo.
Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador Legionella Legionella micdadei micdadei causan causante te de neumon neumonía. ía. Los quistes quistes de los géneros géneros Cryptosporid Cryptosporidium ium e Isospora Isospora tienen resistencia definida a las tinciones con
acido alcohol.5
Pare Pared d Celu Celula larr de las las bact bacter eria ias s AcidoAlcohol Resistentes (BAAR). Químic Químicamen amente, te, la pared pared celul celular ar de los BAAR BAAR co cons nsis iste te en un esquele esqueleto to formado por dos tipos de polímeros, unidos covalentemente entre sí: Un peptidoglucano especial (la diferenc diferencia ia más importa importante nte es que en vez de N-acetil murá murámi mico co exis existe te N-gl N-gluc ucol olil il-murámico); Un arabinogalactano de gran peso molecular.7
Ambos polímeros se encuentran enlazados a través de fosfodiéster entre una unidad de murámico y una de las arabinosas. Pero a su vez, este esqueleto se une covalentemente a los ácidos micólicos.7 Los ácidos ácidos micólic micólicos os son ß-hidro ß-hidroxiá xiácid cidos os grasos grasos ramific ramificado adoss en a, cuya cuya longitud de cadena es grande (desde C78 a C91 en Mycobacterium). Están unidos al esqueleto de la P.C. de forma uniforme, a través de enlaces con los -OH en 5 de las unidades de arabinosa.7 Por lo tanto, el esqueleto de la P.C. de estas bacterias consiste en: peptidoglucano---arabinogalactano-peptidoglucano---arabinogalactano---ácidos -ácidos micólicos.
Pero aparte de este esqueleto complejo, la P.C. de las bacterias ácidoalcohol resistentes exhibe una variedad de lípidos: 1) Glucolípidos: Glucolípidos: a) Micolatos de trehalosa : Constituyen el llamado factor de crecimiento en cuer cuerda das, s, debi debido do a que que son son resp respon onsa sabl bles es de la agre agrega gaci ción ón de los los individuos bacterianos en forma de “cuerdas”. b) Sulfolípidos de trehalosa: están localizados en la periferia de la P.C., y pare parece cen n ser ser impo import rtan ante tess fact factor ores es de viru virule lenc ncia ia.. En Myco Mycoba bact cteri erium um tuberc tuberculos ulosis is estos estos sulfol sulfolípid ípidos os de trehal trehalosa osa funcio funcionan nan como como evasin evasinas, as, es decir, facilitan el que la bacteria escape a la acción de los macrófagos inhibiendo inhibiendo la fusión del fagosoma fagosoma con el lisosoma, lisosoma, lo cual puede explicar explicar el hech hecho o de que que esto estoss micr microo oorg rgan anis ismo moss teng tengan an éxit éxito o co como mo pará parási sito toss intracelulares. c) Micósidos: Localizados en la periferia, consisten en la unión por enlace éste ésterr entr entre e ác ácido idoss micó micólic licos os y azúc azúcar ares es (inc (inclu luyen yendo do ác ácid idos os urónic urónicos os,, desoxiosas, aminozúcares, etc.). tioceroles (alcoholes ramificados ramificados 2) Ceras: Unión de ácidos micólicos con tioceroles de alto peso molecular).7 El alto alto co cont nten enido ido en lípi lípido doss co conf nfier iere e una seri serie e de prop propied iedad ades es a esta estass bacter bacterias ias (apart (aparte e de la ácidoácido-alc alcoho oholl resist resistenc encia ia ya citada citada): ): aspect aspecto o y “La razón habla, la ignorancia y el error gritan” anónimo.
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consistencia cérea de sus colonias; crecen formando grumos en medios líquidos; gran impermeabilidad de la P.C., que a su vez condiciona una gran resistencia a la desecación y gran resistencia a sustancias antibacterianas (detergentes, oxidantes, ácidos, bases, etc).5
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. Las estadísticas muestran que un tercio de la población mundial está infectada infectada por el bacilo causante causante de la tuberculosis tuberculosis.. Según la Organización Organización Mundia Mundiall de la Salud, Salud, “Una persona persona con tubercul tuberculosi osiss activa, activa, no tratada, tratada, infecta un promedio de 10 a 15 personas al año y cada segundo se produce en el mundo una nueva infección por el bacilo de la tuberculosis. Del 5 % al 10% de las personas infectadas por el bacilo de la tuberculosis, enferman o son contagiosas en algún momento de sus vidas. La tuberculosis es la principal causa de muerte en las personas infectadas por el VIH.8
En el Ecuador , la tasa de prevalencia de tuberculosis para el año 2007 fue de 36.7 x 100.000 habitantes y la tasa de incidencia de 32.6 x 100.000 habitantes; tuberculosis pulmonar con baciloscopía positiva, que es la forma contagiante de la enfermedad se presentaron 3448 casos que corresponden al 78% del total; tuberculosis pulmonar con baciloscopía negativa 480=11%, y extrapulmonares 503=11%.8 La transmisión de los los bac bacilo ilos de la tuber ubercculos ulosis is se prod produc uce e ca cassi exclusivament exclusivamente e por medio de núcleos núcleos suspendidos suspendidos en pequeñas pequeñas gotas que son son expu expuls lsad adas as co con n la expe expect ctor orac ació ión n de las las pers person onas as afec afecta tada dass por por tube tuberc rcul ulos osis is pulm pulmon onar ar.. Esta Estass pequ pequeñ eñas as gota gotass pued pueden en perm perman anec ecer er infectantes en el aire durante bastante tiempo y pueden ser inhaladas por otras otras persona personas. s. La infecci infección ón de los contac contactos tos es más probable probable cuando cuando conviven o permanecen durante un tiempo prolongado cerca del enfermo que está expectorando bacilos y en un ambiente poco ventilado. No todas las personas infectadas enferman, sólo una de cada diez aproximadamente, que son las más suscep susceptib tibles les.. La tuberc tuberculos ulosis is puede puede manifestarse en cualquier órgano, porque M. tuberculosis se disemina por todo el organismo; sin embargo, la enfermedad pulmonar es la más frecuente (80-85% de todos los casos diagnosticados) debido a que el bacilo necesita abundante oxígeno para multiplicarse. En los pulmones de los enfermos se pueden formar cavidades en las que se alojan grandes poblaciones de bacilos que pued pueden en ser ser detec detecta tado doss en mues muestr tras as de espu esputo tos. s. Los Los síntom síntomas as más característicos de la tuberculosis pulmonar son la tos y la expectoración persistentes por más de 2 semanas. A las personas con estos síntomas se Los llama Sintomáticos Respiratorios (SR). Otras manifestaciones pueden ser pérdida de peso, febrícula, sudores nocturnos, cansancio físico y dolores de tórax.4 cert rtez eza a de tube tuberc rcul ulos osis is pued puede e hace hacers rse e en form forma a El diagnóst diagnóstico ico de ce confiable en el laboratorio demostrando la presencia de bacilos en una muestra de La lesión o el cultivo.4
LA MUESTRA. La muestra más examinada es el esputo debido a que, como se ha dicho, la tuberc tuberculos ulosis is pulmon pulmonar ar es la más frecuente frecuente.. Sin embarg embargo, o, dado dado que la enfermedad puede manifestarse en cualquier órgano, con menor frecuencia puede requerirse requerirse la investigación investigación de muestras muestras muy variadas: variadas: orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades
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abiert abiertas, as, biopsi biopsias. as. Estas Estas muestra muestrass de lesion lesiones es extrapu extrapulmon lmonare aress deben deben procesarse también por cultivo.4
EL ESPUTO. El envase. Debe tener las siguientes características: • Boca ancha: de no menos de 50 mm de diámetro • Capacidad entre 30 y 50 ml: para facilitar que el paciente pueda Depositar la expectoración con facilidad dentro, sin ensuciar sus Manos o las paredes del frasco y para que en el laboratorio se pueda Seleccionar y tomar la partícula más adecuada, con comodidad, para Realizar el extendido. • Cierre hermético: con tapa a rosca, para evitar derrames durante El transporte y la producción de aerosoles cuando se abre en el laboratorio. • Material plástico transparente , resistente a roturas, para poder Observar la calidad de la muestra cuando la entrega, evitar Rotturas Ro uras y derr derra ame mess de ma mate teri rial al infe infecccios ioso y para para que que pued pueda a ser desechado.4
Obtención espontánea del esputo. Para la recolección de las muestras: • Elegir un lugar bien ventilado y que ofrezca privacidad. Puede ser una habitación bien ventilada y con acceso de luz natural (sol) o algún lugar abierto no concurrido.2 • Entregar el envase de recolección ya rotulado con su nombre o número de identificaci identificación ón y el servicio que solicita. solicita. Estos datos deben ser escritos en la pared del frasco y no en la tapa para evitar errores, con rótulos que no se despeguen o con lápiz indeleble. • Obtener una buena muestra de esputo instruyendo al paciente con lenguaje simple y comprensible para que: - inspire profundamente llenando sus pulmones de aire tanto como sea posible - retenga el aire un momento (10 a 15 segundos) - expulse luego la expectoración expectoración con un esfuerzo de tos, tratando de arrastrar las secreciones del pulmón - recoja el esputo producido dentro del envase tratando de que entre en su totalidad, sin manchar sus manos o las paredes externas del frasco - repita esta operación otras dos veces colocando todas las secreciones en el mismo frasco - limpie el exterior del envase con un pañuelo de papel y se lave las manos con agua y jabón “La razón habla, la ignorancia y el error gritan” anónimo.
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Calidad de la muestra La muestra de esputo mucopurulenta, proveniente de árbol bronquial, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos Una buena buena muest muestra ra tiene tiene aproxi aproximad madamen amente te 3 a 5ml, es general generalment mente e espesa espesa y mucoide. Puede ser fluida con partículas partículas de material material purulento. purulento. El colo co lorr es vari variab able le (blan (blanco co,, am amar arill illen ento to y hast hasta a verd verdos oso) o).. A vece vecess son son sanguinolentas. Las secreciones nasales, faríngeas o la saliva no son buenas muestras para invest investiga igarr tuberc tuberculo ulosis sis,, aunque aunque es conven convenient iente e examina examinarla rlas, s, de todas todas formas, porque siempre existe la posibilidad de que contengan parte de la expectoración o bacilos expulsados por la tos que hayan quedado en la boca, nariz o faringe.3
Mucopurulenta Mucopurulent a
Sanguinolenta Sanguinolent a
Mucosa
Salivosa
Si las muestras de esputo no van a ser procesadas en el día, es aconsejable introducir cada envase en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa encima de la tapa, de manera que quede sujeta firmemente. Las muestras deben ser conser conservad vadas as en refriger refrigerado ador, r, preferen preferentem tement ente e dentro dentro de la caja caja de plástico. Si no se cuenta con refrigerador, ubicarlas en un lugar fresco y protegidas de la luz.4
PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION ZIEHL- NEELSEN. El ca calen lenta tamie mient nto o del del port portao aobje bjeto toss permi permite te ma mayo yorr penet penetra ranc ncia ia de la carbolfuscin carbolfuscina a en la pared celular. Los ácidos micólicos y las ceras forman comp co mple lejo joss co con n el co colo lora rant nte e bási básico co,, que que lueg luego o no se elim elimin inan an co con n la decoloración con ácidos débiles.5
MATERIALES: Portaobjetos Mechero Asa de siembra Pipetas Pinzas de madera Microscopio óptico Equipo de tinción (barras paralelas) REACTIVOS: Fucsina fenicada básica Alcohol acido 3,0 % Azul de metileno Microorganismos uno BAAR y uno no BAAR Aceite de inmersión PROCEDIMIENTO: (ver anexo 1) 1. Se fija fija los portaobjetos portaobjetos al calor calor con con la muestr muestra. a. 2. Se cubre el frotis con el reactivo de colorante de carbolfuscina y se calienta con suavidad hasta la aparición de vapores durante 1 minuto
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3. 4. 5.
6. 7. 8.
mediante flameo por debajo de la rejilla de sostén con un mechero de gas. Se deja actuar actuar el colorant colorante e sobre el portao portaobjetos bjetos durante durante 4-5minu 4-5minutos, tos, sin calentar. Se lavan lavan los frotis frotis con agua destil destilada ada y se los inclina inclina para elimina eliminarr el exceso de agua. Se decoloran con acido alcohol al 3,0 % durante 2 minutos. Se lavan los frotis con agua destilada y se los inclina para escurrir el resto de agua. Se cubr cubren en los los frot frotis is co con n reac reacti tivo vo de azul azul de me meti tile leno no dura durant nte e 1 minuto. Se lavan lavan con agua agua destilada destilada y se dejan dejan secar secar al aire. aire. Se examinan con aceite de inmersión en búsqueda de BAAR.5
RESULTADOS: Positiva Negativo
rojos azul
BAAR no BAAR
Un hall hallaz azgo go posi positi tivo vo sign signif ific ica a “pre “prese senc ncia ia de baci bacilo loss alco alcoho holl ac acid ido o resistentes” y un hallazgo negativo significa “ausencia de bacilos alcohol acido resistentes”.6
BAAR
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ANEXO 1
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BIBLIOGRAFÍA 1. - CLARE, George. Stains and staining (microscopy). 4ta edition Williams and Williams. 2.- Prácticas de Microbiologí Microbiología. a. Departamento Departamento de Microbiología Microbiología y Genética Genética Universidad de Salamanca 3.- Jawetz Jawetz Ernest Ernest,, Microb Microbiol iología ogía médica, médica, 17ª edición edición en españo español, l, Manual Manual moderno, México, México 2002 4.- SEQUEIRA, L. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis normas y guía técnica. OPS 2008 5.5.- Bail Bailey ey & Scot Scott, t, Diag Diagnó nóst stic ico o micr microb obio ioló lógi gico co,, 11ª 11ª edic edició ión, n, Edit Editor oria iall Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2 004. 6.- Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana, 110 − 111. 7. - Mandell, Bennett, & Dolin: Principles and Practice of Infectious Diseases 6th ed. Copyright © 2005. Churchill Livingstone, An Imprint of Elsevier. 8.- http://www.opsecu.org/informativo/informativo5/tuberculosis.htm
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