Departamento Acadêmico de Química Curso Técnico Integrado Disciplina: Microbiologia Industrial Relatório de Aulas Práticas
Alunos: Maria Luiza Andrade Aquino Mariana Gabriela de Oliveira Ruslam Romaine Eleutério Subturma: T3 Professora: Fernanda Badotti
COLORAÇÃO DE GRAM 1. Introdução A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 por Hans Christian Joachim Gram, médico bacteriologista dinamarquês. É um procedimento de coloração diferencial, pois não cora todos os tipos de células igualmente; e muito útil, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas e gram-negativas, de acordo com diferenças na parede celular das bactérias. Consiste no tratamento sucessivo do esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, etanol - acetona e fucsina básica. Os difer diferen entes tes tipos tipos de ba bact ctéri érias as reagem reagem de mo modo do difer diferen ente te à colo colora raçã çãoo de Gram Gram,, po porqu rquee difer diferenç enças as estr estrutu utura rais is em suas suas pared paredes es celu celula lares res af afeta etam m a reten retençã çãoo ou liber liberaç ação ão de um umaa combinação de violeta de genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I). Entre outras diferenças, as bactérias gram-positivas têm uma parede celular mias espessa de peptideoglicana (dissacaríde (dissacarídeos os e aminoá aminoácidos cidos)) que as bactérias bactérias gram-negativ gram-negativas. as. Além disso, as bactérias bactérias gramnegativas contêm uma camada de lipopolissacarídeos (lipídeos e polissacarídeos) como parte de sua parede celular. Quando aplicada a células gram-positivas e gram-negativas, a violeta de genciana e o iodo penetram facilmente nas células. Dentro as mesmas, a violeta de genciana e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo é maior que a molécula CV que entrou na célula e, devido ao seu tamanho, não pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das células gram-positivas pelo álcool. Nas células gram-negativas o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é removido através da camada fina de peptideoglicano, que não consegu con seguee reter reter o com comple plexo. xo. Com Comoo result resultado, ado, as cél célula ulass gram-p gram-posi ositiv tivas as retêm retêm o corante corante e permanecem de cor púrpura. As células gram-negativas não retêm o corante e ficam incolores até serem contracoradas com um corante vermelho, após o que adquirem cor rosa. O método de Gram é uma das mais importantes técnicas de coloração em microbiologia médica. Porém, os result resultados ados da col colora oração ção de Gram Gram não são uni univer versal salmen mente te apl aplicá icávei veis, s, poi poiss alg alguma umass cél célula ulass bacterianas coram-se fracamente ou não adquirem cor. A reação de Gram é mais consistente quando usada em bactérias jovens, em crescimento.
A reação de Gram de uma bactéria pode fornecer informações valiosas para o tratamento de uma doenç doe nçaa já qu quee bac bactér téria iass gram gram-p -pos osititiv ivas as tende tendem m a ser ser mo mort rtas as fac facililme mente nte por pen penic icililina inass e cefalosporinas e as bactérias gram-negativas geralmente são mias resistentes, pois os antibióticos não podem penetrar na camada de lipopolissacarídeos. O método de coloração de Gram consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias gram-positivas quanto gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a camada lipídica das membranas externas das bactérias bactérias gram-negativas, gram-negativas, deixando também pequenos buracos na fina camada de peptide peptideoglic oglicana ana pelos quais o complexo complexo CV-I se espalha , decorando decorando as células. células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, portanto, dependen dependente te das propriedades físicas e químicas químicas das paredes celulares celulares bacterianas bacterianas tais como espessura, espessura, densidade, porosidade porosidade e integridade. integridade. Em seguida, a amostra amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Como as bactérias gram-negativas ficam incolores após a lavagem com álcool, a adição do contracorante colore as células. Ao microscópio, as células gram-positivas aparecerão coradas em violeta e as gram-negativas em rosa. Em células de bactérias gram-positivas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de amostra nova é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanolacetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo azul de metil metileno eno e a fucsina básica pode ser substituído substituído pelo corante vermelho vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactérias gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora cora prontam prontament entee alg alguma umass esp espéci écies es de bac bactéri térias. as. O sol solvent ventee etan etanolol-ace acetona tona pode ser substituído por álcool 95%.
2. Objetivos Desenvolver habilidades para executar as técnicas de preparação de esfregaços e para o método de coloração de Gram, sabendo diferenciar diferenciar e classific classificar ar as bactérias de acordo com a coloração coloração obtida e relacionando-as à composição química da parede celular das mesmas. Desenvolver a
habilidade, também, para utilizar o microscópio óptico, observando as bactérias após a coloração de Gram.
3. Materiais necessários 3.1 Reagentes: •
Água
•
Álcool
•
Cristal violeta
•
Lugol
•
Safranina 3.2 Materiais •
Alça de Platina
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Lâminas de vidro
•
Pipetas de Pasteur
•
Suporte para coloração das lâminas
•
Placa com crescimento bacteriano: E.coli e S.aureus
•
Tubo de ensaio 3.3 Equipamentos
•
Microscópio óptico
•
Bico de Bunsen
4. 1ª etapa: Preparação da atividade prática 4.1 Preenchimento Preenchimento da Ficha Formativa de Reagentes (Tabela 01)
Nomes Meios de cultura/ reagentes
Composiçã o Química
- C25H30ClN3
Cristal Violeta
Descrição Físicoquímica
Riscos à saúde/ impacto ambiental
Solubilidade em água: 20 g/L (20 °C)
Suspeito de provocar cancro. Nocivo por ingestão. Provoca lesões oculares graves. Muito tóxico para os organismos aquáticos com efeitos duradouros.
Ponto de fusão: 189 - 194 °C Massa molar: 407.99 g/mol Densidade: 1.19 g/cm3 (20 °C) pH: 2.5 - 3.5 (10 g/l, H2O, 20 °C)
Manu Ma nusei seio o
- Pipetas de pasteur - uso de jaleco
Esto Estoca cagem gem
Referência bibliográfica
Ver referência s bibliográficas (Item 5.1.4)
- Iodeto de potássio
Lugol
- Cristais de iodo - Água destilada
- Solúvel em água à 20 ºC - Densidade 1,01 g/cm³ a 20 ºC
- Não é perigoso para a água
- Pipetas de pasteur - uso de jaleco
- pH: 3,5 (H2O, 20 ºC)
Ver Armazenar de 15°C a referência 25°C s bibliográficas (Item 5.1.4)
- Ponto de ebulição: 100 ºC
Safranina
- C20H19ClN4
Solubilidade em água:
50 g/L (20 °C) Massa molar: 350.85 g/mol
- Forte contaminante de água
- Pipetas de pasteur - uso de jaleco
- pH: 10 (10 g/l, H2O, 20 °C)
5. 2ª etapa – Execução da atividade principal
5.1 Procedimentos/metodologia
I) Coloração e esfregaço Utilizando-se da área estéril em volta do bico de Bunsen ou a capela de fluxo laminar, retirar, com o auxílio da alça de platina, uma pequena porção da bactéria desejada (já inoculada em placa petri). Colocar uma gota de água destilada em um lâmina, esfregar a ponta da alça de platina com a bactéria na gota, fazendo um círculo. Secar a água com o auxílio do bico de bunsen. Corar com Cristal violeta por 60 segundos. Lavar com esguicho de água destilada Corar com Lugol por 60 segundos. Lavar com esguicho de água destilada.
Passar álcool acetona até que não haja mais desprendimento de corante. Lavar com esguicho de água destilada. Corar com fucsina por 30 segundos. Lavar com esguicho de água destilada e esperar secar.
II) Microscópio Ligar o microscópio na tensão adequada. Acoplar a lâmina à mesa (platina) do microscópio. Focalizar utilizando o parafuso macrométrico, ajustar o foco com o parafuso micrométrico. No caso da lente de maior aumento, colocar óleo de imersão, imergir a lente no óleo, focar utilizando o parafuso macrométrico e ajustar com ajuda do micrométrico. Após o término da visualização, retirar a lâmina e limpar a objetiva que imergiu no óleo com um papel absorvente.
5.1.1 Leitura e interpretação dos resultados
Os microorganismos roxos, com forma de cocos, vistos no microscópio eram gram-positivos (Staphylococcus aureus ), enquanto os de coloração rosa com forma de bastonetes eram gram-negativos (Escherichia coli). Essa diferença de cor ocorre, pois as bactérias grampositivas possuem uma densa camada de peptideoglicano em sua parede celular, enquanto as gram-negativas possuem uma fina camada desse composto e uma membrana externa, constit constituída uída por lipopo lipopolilisaca sacaríde rídeos. os. Ao corar corar as bac bactéri térias as com cristal cristal violeta violeta e lug lugol, ol, o complexo de cristal violeta-iodo é absorvido por ambas, porém, ao serem tratadas com álcool álc ool,, as esp espess essas as paredes paredes cel celula ulares res das bac bactéri térias as gram-pos gram-positi itivas vas são des desidr idratad atadas, as, provoca provocando ndo a con contraç tração ão dos poros poros do pep peptid tideogl eoglica icano, no, tornand tornando-as o-as imp imperm ermeáv eáveis eis ao comple com plexo; xo; enqu enquanto anto a porção porção lipídi lipídica ca das mem membra branas nas ext externa ernass das bac bactéri térias as gramgramnegativas se dissolve, deixando o complexo ser removido. Ao corar ambas com a safranina, as gram-negativas absorvem esse contracorante por estarem incolores, diferentemente das gram-positivas, que não absorvem por já estarem coradas. Foi possível a observação de bactérias descoradas em ambos esfragaços (Staphylococcus aureus e Escherichia coli ); ); e também algumas algumas bactérias do tipo Staphylococcus aureus
com uma cor mais roseada e outras do tipo Escherichia coli em um tom mais roxeado roxeado em comparação com as outras do mesmo esfregaço. Isso pode ter ocorrido por causa de uma má colo colora raçã çãoo ou até até me mesm smoo de devi vido do ao tipo tipo de cult cultur uraa da dass ba bact ctér éria ias. s. A et etap apaa de descoloração na Coloração de Gram é uma das mais importantes. Isso, porque se for muito prolongado o tempo de exposição ao solvente (álcool), o complexo cristal violeta-iodo pode ser removido de ambos tipos de bactérias (gram-positivas e gram-negativas) e ambas serem coradas pelo contracorante (safranina) na próxima etapa do procedimento, o que explica a cor roseada de algumas gram-positivas, e se o tempo for curto, pode não haver remoção do complexo cristal violeta-iodo das bactérias gram-negativas, o que explica a coloração roxeada de algumas delas no esfregaço. A descoração das bactérias pode ser explicada pela retenção ou não do corante, já que depende das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas, tais como densidade, espessura, porosidade e integridade. Outras explicações para esses resultados adversos podem estar ligadas a células células velhas, velhas, células células mortas ou células células com envelopes danificados danificados por agentes quími químicos cos ou físicos, tais como o aquecimento no bico de bunsen, utilizado para a secagem do esfregaço. Outro problema nas etapas de coloração pode ser o quanto espesso é um esfregaço, já que é mais difícil descora-las e até mesmo permitir a observação no microscópio. Por esses motivos, a Coloração de Gram nunca deve ser utilizada como um diagnóstico definitivo para a classificação de bactérias e sim como um ponto de partida. Visto isto, a Coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil quando corretamente realizada e interpretada e com o uso de culturas em que se saiba, pelo menos, o tempo de incubação.
5.1.2 Apresentação de propostas de minimização, reutilização, tratamento e descarte dos resíduos gerados
Os meios utilizados podem ser reaproveitados transformando estes em alimentos para animais e adubos. Para a produção dos alimentos e adubos seria necessário o tratamento dos produtos gerad gerados os pe pela la deg degra radaç dação ão do me meio io e pel peloo me metab tabol olis ismo mo das bac bactér téria ias. s. Porém Porém,, nã nãoo foram foram encontradas pesquisas nessa área. O tratamento existente consiste na combustão dos meios, o que gera muita poluição por gás carbônico e resíduos sólidos não identificados. (concertar)
5.1.3 Conclusão
5.1.4 Bibliografia
- MICHAEL J. PELCZAR PELCZAR JR. & E.C.S. CHAN & NOEL R. KRIEG. Microbiologi Microbiologia: a: Conceitos e Aplicações - vol. 1. 2ª Ed. - TORTORA, Gerard J., FUNKE, Berdell R. e CASE, Christine L. Roberta Marchiori Martins. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2005. -
MERCK
CHEMICALS
Brazil.
Disponível
em:
http://www.merck-chemicals.com.br/is-
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