BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Belakang Kromatografi afinitas pertama kali ditemukan oleh Pedro Cautrecasas dan Meir Wilcheck pada tahun 1968. kromatografi afinitas adalah teknik ang !erlaku digunakan untuk memurniakan protein. "al ini dilakukan tergantung pada keuntungan dari afinitas tinggi protein untuk kelompok kimia ang spesifik. spesifik. Metode Metode ini umumna umumna digunakan digunakan untuk mengisolasi mengisolasi protein tertarik dari kolom protein. Kolom diisi dengan mekanik#mekanik ang mengandung residu residu glukos glukosaa ko$ale ko$alen n terpasa terpasang. ng. "al ini diam!i diam!ill dengan dengan pertim pertim!an !angan gan !ah%a residu ang dipilih sesuia dengan protein target. &e!agai campuran protein dituangka kedalam kolom' protein akan melakukan per(alanan ke!a%ah melalui mekanik#mekanik. Protein target akan dilalui dan ter(a!ak untuk kolom dengan ikatan ko$alen ko$alen akrena akrena afinitas afinitas untuk untuk glukos glukosa. a. &isan &isanaa protei protein n akan akan !er(ala !er(alan n ke kolom dan akan dipisahkan. Bagian !uffer perlu ditam!ahkan ke kolom untuk mencuci sepenuhna protein tak ter!atas. )erakhir larutan terkonsentrasi dari glukosa untuk memisahkan protein target dari residu glukosa. Kromot Kromotogr ografi afi afinit afinitas as merupa merupakan kan cara ampuh ampuh mengis mengisola olasi si factor factor transkri transkripsi psi'' protei protein n ang ang mengatu mengaturr ekspre ekspresi si gen dengan dengan cara mengik mengikat at spesifik *+,. Protein dengan afinitas tinggi untuk urutan akan mengikat dan dipertahankan. *alam hal ini' factor transkripsi dilepaskan dengan mencuci dengan larutan ang mengandung konsentrasi garam ang tinggi. -mumna' kromatografi afinitas akan dilakukan melalui kromatografi kolom. Pertama# tama' kemampuan mengikat protein harus dipela(ari. Kemudian medi padat dimodifikas dimodifikasii dengan dengan !ahan pengikat dikemas dikemas dalam kolom kromatograf kromatografi. i. Kemud Kemudian ian campu campuran ran a%al a%al ang ang meng mengan andu dung ng prot protei ein n ang ang diin diingi gink nkan an ditam!ahkan melalui kolom untuk memungkinkan ter(adi pengikatan.
1. /umusan /umusan Masalah Masalah
1. Bagaimana Bagaimana cara pemisahaan pemisahaan dengan dengan menggu menggunakan nakan metode metode kromatogra kromatografi fi afinitas0 . Bagaimana Bagaimana aplikasi aplikasi ang digunakan digunakan dalam kromatografi kromatografi afinitas0 afinitas0 1. )u(uan )u(uan Penulisa Penulisan n Maksud dan tu(uan dari makalah ini adalah untuk mengetahui cara pemisahaan
dengan menggunakan metode kromatografi afinitas
dan
mengetahui !agaimana aplikasi ang digunakan dalam kromatografi afinitas.
BAB II
KROMATOGRAFI AFINITAS
Kromatograf afnitas adalah metode pemisahan campuran biokimia didasarkan pada interaksi yang sangat spesifk. Seperti antara antigen dan antibodi, enzim dan substrat, atau reseptor dan ligan. Pemur emurni nian an
enzi enzim m
atau atau
prot protei ein n
mengg enggun unak akan an
tekn teknik ik
kromatograf afnitas pada saat ini sangat populer dan menjadi piliha pilihan n utama utama.. Pemur emurnian nian ini dilak dilakuk ukan an berdas berdasark arkan an afnit afnitas as enzim atau protein protein terhadap terhadap biomolekul biomolekul lain (ligan), (ligan), misalnya misalnya enzi enzim m ter terhada hadap p inhib inhibito itor, r, su subs bstr trat at atau atau prod produk ukny nya, a, afnit afnitas as antibo antibodi di terhad terhadap ap antige antigenny nnya, a, atau atau afnita afnitas s horm hormon on terhad terhadap ap resep esepto torrnya. nya.
Fase ase
diam diam bias biasan anya ya matr matrik iks s
gel, gel, seri sering ng dari dari
agaro agarosa sa molek molekul ul gula gula linear linear yang yang berasa berasall dari dari gangga ganggang. ng. !iasanya !iasanya titik a"al adalah adalah
kelomp kelompok ok heterogen heterogen terdefni terdefnisi si
molekul molekul dalam larutan, seperti lisat sel, media pertumbuhan atau serum darah. Pemurn emurnian ian dengan dengan teknik teknik krom kromato atogra graf f afnita afnitas s dis disebu ebutt pemu pemurrnian nian satu satu taha tahap p (one step step purifc purifcati ation on)) #ala #alam m pros proses es pemu pemurrnian nian
satu satu
taha tahap p
meng menggu guna naka kan n
krom kromat atog ogra raf f
afni afnita tas s
diperlukan interaksi spesifk antara protein rekombinan dengan suatu ligan. Pemisah emisahan an terjad terjadii kare karena na intera interaksi ksi$in $inter teraks aksii biokim biokimia" ia"ii yang yang sang sangat at sp spes esif ifk. k. Fase ase diam diam meng mengan andu dung ng gugu gugus$ s$gu gugu gus s molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi$ kondisi ondisi yang yang terka terkait it dengan dengan muata muatan n dan sterik sterik terten tertentu tu pada pada samp sampel el yang yang sesu sesuai ai (seb (sebag agai aima mana na dala dalam m
inte intera raks ksii
anta antara ra
antige antigen n dan antibo antibodi) di).. Krom Kromato atogra graf f jenis jenis ini dapat dapat diguna digunaka kan n untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
Skema yang paling umum untuk melakukan kromatograf afnita afnitas s adalah adalah dengan dengan melak melakuk ukan an tahap tahap elusi elusi gradie gradien, n, %lusi %lusi gradien di defnisikan sebagai penambahan kekuatan &ase gerak selama analisis kromatograf berlangsung, e&ek dari elusi gradien adalah adalah memper mempersin singk gkat at "aktu "aktu reten retensi si dari dari senya" senya"a a senya" senya"a a yang tertahan kuat pada kolom Skema Skema ini meliba melibatk tkan an injeks injeksii sampel sampel ke dalam dalam kolom olom afnitas dengan adanya &ase gerak (dengan p' yang tepat) dan komposisi komposisi pelarut untuk ikatan solut$ligan. Pelarut ini, yang menggambarkan &ase gerak lemah pada kolom olom afni afnita tas, s, dise disebu butt deng dengan an bu&e bu&err apli aplika kasi si.. Sela Selama ma &ase &ase aplikasi pemisahan, senya"a$senya"a yang komplemen dengan ligan afnitas afnitas akan akan berikatan berikatan karena karena sampel sampel dile"atka dile"atkan n kolom kolom dengan dengan bu&er aplikasi. aplikasi. Karena Karena selektift selektiftas as interaksi interaksi solut$iga solut$igan n yang tinggi, sampel$sampel lain yang tidak terikat akan mele"ati kolom tanpa tertahan. Setelah komponen$komponen yang tidak tertahan telah tercuci secara sempurna dari kolom, solut yang tert tertah ahan an dapa dapatt diel dielus usii deng dengan an meng menggu guna naka kan n pela pelaru rutt yang yang mampu ampu
menge engelu luar ark kann annya
dari ari
kolom olom
atau tau
yang yang
mampu ampu
memecah kompleks kompleks ligan$solut. Pelarut Pelarut ini merupakan merupakan &ase gerak yang kuat dan seringkali dikenal dikenal sebagai sebagai ba*er elusi. solut yang dikehe dikehenda ndaki ki keluar eluar dari dari kolom, olom, maka maka solut solut dapat dapat diuku diukurr atau atau dikumpulkan untuk penggunaan lebih lanjut. Kolom selanjutnya diir iiregene enerasi
dengan
cara
mensetimbangkan
kembali
menggunakan menggunakan bu&er aplikasi sebelum injeksi lanjut. Komple ompleme mente nterr molek molekul ul yang yang mengi mengika katt (ligan (ligan)) pertam pertama a ko+alen o+alen digabu digabungk ngkan an ke larut larut matrik matriks, s, sepert sepertii kecil ecil agaro agarosa sa manik$m manik$manik, anik, dan matriks matriks dituangk dituangkan an ke dalam kolom. kolom. Suatu Suatu campuran campuran tidak murni murni mengandu mengandung ng protein protein untuk untuk diisolasi diisolasi ini kemudia emudian n ditera diterapk pkan an pada pada kolom olom dan memung memungkin kinka kan n untuk untuk berinteraksi dengan ligan amobil Pada tahap ini, protein yang akan akan diis diisol olas asii meng mengik ikat at seca secara ra khus khusus us untu untuk k liga ligan n amob amobil il
sementara sisa molekul dalam aliran campuran melalui kolom. Protein kepentingan kemudian dapat dielusi dari kolom di ba"ah kondisi yang mengganggu interaksinya dengan ligan. !u&er !u &er pengel pengelusi usi mengan mengandun dung g zat yang yang ber&un ber&ungsi gsi untuk untuk memutus memutuskan kan ikatan antara antara protein protein yang akan akan diambil diambil dengan dengan ligannya. ligannya. adi, bu*er pengelusi pengelusi ini dapat berkompet berkompetisi isi tempat tempat dengan dengan ligan ligan terik terikat, at, sehing sehingga ga prote protein in lepas lepas dan selanj selanjutn utnya ya keluar bersama eluen. -unculnya puncak pada grafk serapan &raksi &raksi$&r $&raks aksii prote protein in hasil hasil pemur pemurnia nian n tergan tergantun tung g pada pada bu&er bu&er pengelusi. ika bu&er pengelusi kurang kuat untuk memutuskan ikatan
antara
ligan
dengan
protein,
maka
akan
terjadi tailing, yait yaitu u punc puncak ak yang yang mele meleba barr. Sela Selain in itu, itu, +olu +olume me matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan yang ada ada sema semaki kin n bany banyak ak.. adi adi,, sem semakin akin besa besarr +olu +olume me matri atriks ks semakin lebar puncak serapan, sehingga protein yang dihasilkan lebih banyak. Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi secara spesifk dengan suatu ligan. ligan. adi, adi, jika jika tidak tidak diketa diketahui hui ligan ligan yang yang dapat dapat berint berintera eraksi ksi seca secara ra sp spes esif ifk k maka maka tida tidak k dapa dapatt dila dilak kukan ukan pemu pemurrnian nian satu satu tahap. amun Keterbatasan ini sekarang dapat diatasi dengan adanya adanya teknol teknologi ogi &usi &usi prote protein. in. denya denya adalah adalah memb membuat uat suatu suatu prot protei ein n &usi &usi yang yang ter terdiri diri dari dari prot protei ein n yang yang akan akan dimu dimurrnika nikan n dengan protein yang diketahui dapat berikatan spesifk dengan ligan tertentu. Kromatograf !atch -engikat ke &ase padat dapat dicapai dengan kromatograf kolom dimana media padat dikemas dikemas ke kolom, campuran a"al dijalanka dijalankan n melalui melalui kolom kolom untuk untuk memungki memungkinka nkan n pengatura pengaturan, n, bu*er mencuci dijalankan melalui kolom dan bu*er elusi kemudian kemudian diterapkan pada kolom dan dikumpulkan. /angkah$ langk langkah ah ini biasan biasanya ya dilak dilakuk ukan an pada pada tekana tekanan n ambien ambien.. 0t 0tau, au,
mengika mengikatt
dapat dapat
dicapai dicapai
dengan dengan menggunak menggunakan an
pengobata pengobatan n
batch, misalnya, dengan menambahkan campuran a"al ke &ase padat padat dalam dalam kapal kapal,, pencam pencampur puran, an, memi memisah sahka kan n &ase &ase padat, padat, menghilangkan
&ase
cair,
c u c i,
menambah menambahkan kan
bu*er
elusi, elusi,
kembal kembalii
kembali
pemusingan,
mensentri mensentri&ugas &ugasii
dan
menghapus eluat tersebut. Kadang$kadang metode hybrid yang digunakan sedemikian rupa sehingga mengikat dilakukan dilakukan dengan metode batch, tetapi &ase padat dengan molekul target terikat dikemas ke dalam kolom dan mencuci dan elusi dilakukan pada kolom. kolom. -etode -etode ketiga, ketiga, memperlu memperluas as tempat tempat tidur adsorpsi, yang menggabungkan keunggulan dari dua metode yang disebutkan di
atas,
juga
telah
dikembangkan.
Partikel
&ase
padat
ditempatkan dalam kolom di mana &asa cair dipompa masuk dari ba"a ba"ah h dan dan
keluar eluar di bagi bagian an atas. atas. 1ra+ 1ra+it itas asii dari dari part partik ikel el
memastikan bah"a &ase padat tidak keluar kolom dengan &ase cair. Kolom afnitas dapat dielusi dengan mengubah konsentrasi garam garam,, p', p, biaya biaya dan kekuat ekuatan an ion secara secara langsu langsung ng atau atau melalui gradien untuk menyelesaikan partikel partikel bunga. -enggunakan spesifk Kromat Kromatograf ograf afnitas afnitas dapat dapat digunaka digunakan n dalam sejumlah sejumlah aplikasi, termasuk pemurnian asam nukleat, pemurnian protein dari ekstrak bebas sel, dan pemurnian dari darah. mmunoa2nity /ain digunakan untuk prosedur adalah pemurnian afnitas antibodi dari serum darah. ika serum diketahui mengandung antibodi terhadap antigen tertentu (misalnya jika serum berasal dari organisme yang diimunisasi antigen bersangkutan) maka dapat digunakan untuk pemurnian afnitas antigen itu. 'al ini juga dikenal sebagai immunoa2nity immunoa2nity 3hromatography. 3hromatography. Sebagai contoh jika suatu organisme diimunisasi terhadap protein 1S4$ &usion &usion akan akan menghasi menghasilkan lkan antibodi antibodi terhadap terhadap &usi protein, protein, dan mungkin antibodi terhadap tag 1S4 juga. Protein kemudian kemudian dapat
ko+alen digabungkan ke dukungan dukungan yang solid seperti agarosa dan digunakan sebagai ligan afnitas dalam pemurnian antibodi dari serum kekebalan. 5ntu 5ntuk k
ketel etelit itia ian n
prot protei ein n
1S4 1S4
dan dan
prot protei ein n
1S4 1S4$&us $&usio ion n
masing$m masing$masing asing dapat dapat digabungk digabungkan an secara secara terpisah. terpisah. Serum Serum ini a"alnya diizinkan untuk mengikat matriks 1S4 afnitas. ni akan meng mengha hapu pus s anti antibo bodi di terh terhad adap ap 1S4 1S4 bagi bagian an dari dari prot protein ein &usi &usi.. Serum tersebut kemudian lepas dari dukungan yang solid dan memungki memungkinka nkan n untuk untuk mengika mengikatt ke 1S4$&usi 1S4$&usion on protein protein matriks. matriks. 'al ini memungkinkan setiap antibodi yang mengenali antigen yang yang akan akan diamb diambil il pada pada dukung dukungan an yang yang solid. solid. %lusi %lusi antibo antibodi di bunga yang paling sering dicapai dengan menggunakan bu*er p' rendah seperti p' glisin 6.7. %luat yang dikumpulkan menjadi netral tris atau penyangga &os&at, untuk menetralkan p' bu*er elusi rendah dan menghentikan degradasi akti+itas antibodi. ni adalah contoh yang bagus seperti pemurnian afnitas digunakan untuk untuk memurn memurnika ikan n protein protein 1S4$&usio 1S4$&usion n a"al, a"al, untuk untuk menghapu menghapus s yang tidak diinginkan antibodi anti$1S4 dari serum dan untuk memurnikan antibodi sasaran. Sebuah strategi sederhana yang sering digunakan untuk memurnikan antibodi yang dihasilkan terhadap antigen peptida. Ketika Ketika antigen peptida yang diproduksi secara sintetis, residu sistein terminal ditambahkan baik pada atau 3$terminus dari peptida. 8esidu sistein ini berisi gugus &ungsional sul&hidril yang memungkinkan peptida yang akan dengan mudah terkonjugasi dengan dengan protein protein pemba"a pemba"a (Keyho (Keyhole le limpet limpet 'emocyani 'emocyanin n (K/'). (K/'). Sama sistein yang mengandung peptida juga bergerak ke resin agarosa melalui residu sistein dan kemudian digunakan untuk memurnikan memurnikan antibodi.
Kebanyakan antibodi monoklonal telah dimurnikan menggunakan kromatograf kromatograf afnitas berdasarkan$imunoglobulin berdasarkan$imunoglobulin spesifk Protein Protein 0 atau Protein 1, berasal dari bakteri. Protein 8ekombinan -ung -ungki kin n peng penggu guna naan an pali paling ng umum umum dari dari krom kromat atog ogra raf f afnitas afnitas untuk untuk pemurni pemurnian an protein protein rekomb rekombinan. inan. Protein Protein dengan dengan afnitas yang dikenal adalah protein ditandai dalam rangka untuk membantu
pemurnian
mereka.
Protein
mungkin
telah
dimo dimodi difk fkas asii seca secara ra gene geneti tik k sehi sehing ngga ga memu memung ngki kink nkan an untu untuk k dipilih untuk afnitas mengikat ini dikenal sebagai protein &usi. 4ags 4ags termasuk termasuk glutathione$S$trans&er glutathione$S$trans&erase ase (1S4), he9ahistidine (ya), dan maltosa mengikat protein (-!P). 4ag histidin memiliki afni afnita tas s nik nikel atau atau kobal obaltt ion ion yang yang tela telah h ber bergera gerak k deng dengan an membe emben ntuk tuk
ikat ikatan an
ko+ale +alen n
koor oordin dinasi asi
den dengan
chel chelat ator or
ter tergabu gabung ng dala dalam m &ase &ase diam diam.. 5ntu 5ntuk k elus elusi, i, juml jumlah ah keleb elebih ihan an seny senya" a"a a dapa dapatt bert bertin inda dak k seba sebaga gaii liga ligan n ion ion loga logam, m, sepe sepert rtii imidazole, imidazole, digunaka digunakan. n. 1S4 memiliki memiliki afnitas afnitas untuk untuk glutathion glutathione e yang yang tersed tersedia ia secara secara komer komersia siall berger bergerak ak sebaga sebagaii glutat glutathio hione ne agarosa. agarosa. Selama Selama elusi, elusi, kelebih kelebihan an glutathion glutathione e digunakan digunakan untuk untuk menggantikan menggantikan protein ditandai. /ektin /ectin kromatograf afnitas adalah bentuk kromatograf afnitas
mana
lektin
yang
digunakan
untuk
memisahkan
komponen komponen dalam sampel. /ektin, seperti 3oncana+alin 0 adalah protein yang dapat mengikat karbohidrat tertentu (gula) molekul. 0plikasi yang paling umum adalah untuk glikoprotein terpisah dari protein non$glikosilasi, atau satu glyco&orm dari glyco&orm lain. TUJUAN
4ujuan 4ujuan dari kromatograf afnitas afnitas adalah adalah untuk memisahkan memisahkan semu semua a mole molek kul dari dari kekhu ekhusu susa san n tert terten entu tu dari dari kesel eselur uruh uhan an seluruh molekul dalam campuran.
PRINSIP
Krom Kromat atog ogra raf f afni afnita tas s adal adalah ah peng pengik ikat atan an sp spes esif ifk k liga ligan n dengan dengan resep reseptor tor.. adi, adi, dalam dalam krom kromato atogr graf af afnita afnitas s minim minimum um harus ada dua senya"a yang berikatan spesifk.
PENGGUNAAN
Kromatograf Kromatograf afnitas dapat digunakan untuk: ;. -emur -emurnik nikan an dan berkons berkonsent entras rasii zat dari campura campuran n ke dalam larutan penyangga 6. -engur -engurang angii jumlah jumlah zat dala dalam m campur campuran an <. -emb -embed edak akan an apa apa yang yang meng mengik ikat at seny senya" a"a a biol biolog ogis is untuk zat tertentu =. -emurnik -emurnikan an dan berk berkonsen onsentras trasii larutan larutan enzim. enzim. PROSEDUR
#i siapk siapkan an kolom kolom afnita afnitas s dengan dengan matri matriks ks dan ligan ligan yang yang sesuai
&el &el Protei Protein n dimasuk dimasukkan kan k kolom kolom dan protei protein n akan akan melalui melalui saringa saringan n matriks afinitas manik#manik.
Protein berinteraksi dengan afnitas ligan dengan beberapa prot protei ein n
yang ang
mengi engik kat deng dengan an erat erat,,
long longga garr
dan tak tak
berikatan.
Protein yang tidak mengikat akan tercuci oleh bu*er aplikasi.
Protein yang mengikat di cuci dengan bu*er elusi.
Protein Protein elusi yang mengika mengikatt erat ligan dan mengumpu mengumpulkan lkan protein murni penting.
BAB III KESIMPULAN Kromatograf afnitas adalah kromatograf yang digunakan untuk untuk menganalis menganalisii antigen antigen dan antibodi, antibodi, enzim dan substrat, substrat, atau reseptor reseptor dan ligan. ligan. #an dalam kromato kromatograf graf afnitas ini penggunaan nya adalah untuk memurnikan memurnikan zat dari campuran ke dala dalam m
laru laruta tan n
peny penyan angg gga, a,
meng mengur uran angi gi
juml jumlah ah
zat zat
dala dalam m
campuran, membedakan apa yang mengikat senya"a biologis untuk untuk zat terten tertentu, tu, memur memurnik nikan an dan berko berkons nsent entras rasii laruta larutan n enzim.
DAFTAR PUSAKA
;. #ay, #ay, 8.0 8.0 dan 5nder" 5nder"ood ood.;> .;>7;. 7;. Analisa Analisa Kimia Kuantitati Edisi Keepat. akarta:%rlangga akarta:%rlangga soebagio, dkk.6??6. kimia 0nalitik . -alang : F-P0 uni+ersitas negri malang. 6. Pharmacia !iotech, 0mersham. Chromatography.
6?;;.
!andung: 80/ #esign 0!.
Anity
