Karakterisasi dan pengaruh berbagai variasi senyawa terhadap aktivitas enzim katalase pada kentang
1. Tujuan :
Mengetahui aktivitas enzim katalase pada kentang
Mengetahui pengaruh variasi senyawa terhadap aktivitas enzim katalase pada kentang
2. Latar Belakang
Enzim merupakan protein yang memilki sifat katalitik yang sangat tinggi. Enzim dapat mempercepat reaksi namun tidak mempengaruhi kesetimbangan akhir. enzim bekerja hanya pada satu macam reaksi dan sangat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, pH, suhu, dan kofaktor. Enzim Katalase adalah enzim yang terdapat di dalam hampir semua sel hidup, dapat mengkatalase penguraian H2O2 menjadi air dan oksigen. Kentang merupakan salah satu tanaman yang memiliki enzim katalase yang terdapat di dalam sel peroksisomnya. Penelitian ini menggunakan bahan dasar kentang karena kentang mudah didapat dan memiliki sel peroksisom dalam jumlah besar yang terdapat dalam daging buahnya. Enzim katalase merupakan enzim yang tahan panas, karena sifat tersebut maka katalase digunakan sebagai indikator untuk mengetahui aktivitas enzimnya dalam kentang melalui berbagai perlakuan.
3. Tinjauan Pustaka
2.1. Enzim Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator dalam reaksi pemecahan dan pembentukan (metabolisme) suatu zat yang terjadi didalam sel jaringan. Enzim dihasilkan oleh sel hidup (eukariotik dan prokariotik) dan berfungsi sebagai katalis biologi yang spesifik, namun aktifitasnya dipengaruhi oleh kondisi fisik dan kimia. Seluruh reaksi kimia yang berlangsung di dalam sel memerlukan jasa enzim. Enzim disintesis di dalam sel, tetapi aktivitasnya tidak selalu di dalam sel. Berbagai reaksi kimia yang dikendalikan oleh enzim, antara lain respirasi, pertumbuhan, kontraksi otot, fotosintesis, pencernaan, fiksasi nitrogen, dan pembentukan urine. Enzim mempunyai sifat – sifat sifat :
1. Enzim berfungsi sebagai katalisator, artinya sebagai zat yang mampu mempercepat reaksi kimia, tetapi enzim tidak ikut bereaksi.Denagn demikian enzim tidak diperlukan dalam jumlah yang banyak. 2.
Enzim adalah adalah suatu protein, protein, ini terbukti terbukti karena karena enzim di dalam larutan membentuk suatu koloid.
3.
Kerja enzim enzim bersifat khusus/khas, artinya bahwa enzim tidak dapat bekerja pada pada semua zat
4. Enzim tidak tahan panas, Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu lingkungan dalam sel.Kebanyakan enzim akan aktif pada kisaran suhu tertentu. Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim: 1. Suhu, pada suhu 0 o C (minimum) enzim non aktif tapi tidak rusak. Jika suhu dinaikkan enzim akan aktif dan bekerja optimum pada suhu 30 – 40 C. Pada suhu 60 C enzim ˚
˚
mengalami denaturasi (rusak pada bagian sisi aktifnya dan tidak bisa balik) sehingga tidak bisa mengikat substrat. 2. pH, pH optimum pada masing – masing enzim bervariasi. Khusus enzim katalase pH optimum 7 – 7,2 (sedikit basa). Perubahan pH menyebabkan sisi aktif enzim berubah sehingga tidak sesuai dengan substratnya. 3. Konsentrasi enzim, konsentrasi enzim setara dengan kecepatan reaksi (jika konsentrasi enzim ditambah maka reaksinya pun semakin cepat berlangsung) 4. Zat penggiat (aktivator), berfungsi untuk memacu / menggiatkan kerja enzim sehingga bekerja lebih cepat (kofaktor : ion logam, koenzim koenzim : vitamin B kompleks) 5. Zat penghambat (inhibitor), pada dasarnya ada 2 macam berdasarkan sifatnya, yaitu : Reversibel (bisa kembali ke bentuk semula dengan memperbanyak substrat, misalnya kompetitif [inhibitor mirip substrat], non kompetitif [sisi aktif rusak]), Irreversibel (sisi aktif enzim mengikat kuat inhibitor dan tidak dapat balik) 6. Konsentrasi substrat, jika konsentrasi substrat ditambah maka kecepatan reaksi pun semakin lambat (Yulia,2009:1) 2.2. Enzim Katalase Pada tahun 1818 Thenart penemu hydrogen peroksida H2O2 menyatakan bahwa H2O2 dapat diuraikan oleh suatu enzim. Hal ini dibuktikan oleh Jacobson pada tahun 1892 . Dan pada tahun 1901 lowie menamai enzim ini sebagai katalase. Sebagian besar enzim bekerja di dalam sel, yang disebut enzim intraseluler. Salah satu contoh enzim intraseluler adalah enzim katalase. Katalase memecah senyawa berbahaya, seperti Hydrogen peroksida (H2O2) di dalam sel hati. Dalam hal ini Hydrogen peroksida bertindak sebagai substrat.
Hydrogen peroksida merupakan senyawa reaktif dan dapat merusak sel, kemudian akan didegrasi oleh katalase. Katalase mendegrasi Hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O) dan oksigen (O2). Berdasarkan mekanisme kinerja dan aktivitas yang diketahui, mayoritas enzim komersial adalah hidrolase( termasuk protease,karbohidrolase,esterase ) dan oksidoreduktase. Salah satu klasifikasi enzim yang sering dipelajari adalah osidoreduktase yang di dalamnya termasuk katalase. Katalase merupakan protein dengan gugus prostetik berupa empat gugus protohemin terkonjugasi (ferriheme/Fe3+-Protohemin IX) yaitu heme b atau heme d. Molekul katalase berupa tetramer yang tersusun atas empat sub unit identik (monomer) yang masing-masing memiliki sebuah gugus protohemin (hemoprotein) pada sisi katalitiknya (Balasubramanian 1987:1).
Struktur Heme b
Struktur Heme d cishydroxychlorin cishydroxychlorin spirolactone
Gambar 1. Struktur heme b dan dan heme d Keempat ikatan koordinasi enam VI dari besi dalam protohemin berinteraksi dengan keempat nitrogen cincin pirol (atom – atomnitogen atomnitogen porifirin, A, B, C, D). Haem iron coordination
Pentacoordinate
Haem iron coordination
Haem iron coordination
Hexacoordinate
Hexacoordinate
Gambar 2. Struktur heme Fe koordinasi ((Murshudov,1996:1).
Hidrogen peroksida merupakan salah satu zat sisa hasil sampingan dari metabolisme tubuh, baik manusia, hewan maupun tumbuhan. Apabila hidrogen peroksida tidak diuraikan, maka akan terjadi kematian sel secara massal. Enzim katalase mampu memecah ikatan hidrogen peroksida, menjadi dua zat yang tidak berbahaya, yaitu hidrogen (H2) dan air (H2O). Meskipun demikian, karena enzim katalase mempunyai mayoritas bahan dasar berupa protein, maka sifat-sifat protein juga masih melekat erat di dalam enzim katalase. Salah satu sat u sifat enzim adalah termolabil, atau rentan rusak jika suhu lingkungan terlalu panas. Enzim akan mengalami denaturasi, sehingga tidak bisa melakukan fungsinya. Demikian pula dengan enzim katalase, jika suhu lingkungan terlalu panas, maka enzim ini tidak akan mampu bekerja optimal. Enzim katalase dapat bekerja pada rentan keasaman (pH) yang sempit. Enzim katalase bekerja maksimum pada pH netral (pH 7). Ketika kondisi keasaman bergeser menjadi sedikit asam sedikit asam (pH < 7) ataupun sedikit basa (pH > 7), maka kapasitas enzim katalase untuk menguraikan H2O2 akan semakin berkurang. Malah menurut beberapa literatur, pada pH tertentu enzim katalase akan sama sekali tidak mampu bekerja. Selain pH, juga masih ada beberapa faktor beberapa faktor lain yang dapat mempengaruhi kerja enzim katalase. Faktor-faktor tersebut di antaranya suhu, konsentrasi (banyaknya) substrat, konsentrasi (banyaknya) enzim, keberadaan aktivator (pemicu enzim untuk bekerja lebih cepat) serta adanya inhibitor (penghambat kerja enzim). Mengingat begitu sempitnya rentang kerja enzim katalase, maka menjaga kondisi tubuh supaya tetap sehat sangatlah penting, sehingga semua enzim di dalam tubuh dalam tubuh kita dapat bekerja dengan optimal (Anne ahira,2010:1) Katalase dinilai memiliki potensial komersial yang menarik karena spesifitasnya yang tinggi terhadap substratnya (H 2O2) dan produk reaksinya yang sangat aman (H 2O dan O2), diantaranya sebagai scavenger dan enzim antioksidan dalam jaringan suatu organisme. Katalase juga sering digunakan sebagai biomaterial risety risety pada berbagai disiplin ilmu biokimia molekuler. Katalase merupakan komponen sistem protektan dan
antioksidan
endogen terpenting dalam jaringan tanaman, terutama pada kentang yang mengandung mengandung 2 % protein dan memiliki suseptibilitas (rangsangan) cukup tinggi terhadap gangguan gangguan fisiologis. Enzim katalase pada kentang terletak pada dagingnya karena dalam daging kentang terdapat sel peroksisom yang dapat menghasilkan enzim katalase. Kentang yang memiliki banyak enzim katalase adalah a dalah kentang yang belum tumbuh tunasnya Selain Selai n itu katalase dapat dijadikan indikator terjadinya proses pematangan pada buah atau browning. Senyawa browning. Senyawa volatile yang dihasilkan merupakan proses browning enzimatis dan non enzimatis. Browning enzimatis tersebut diakibatkan oleh adanya aktifitas berbagai enzim, salah satunya enzim katalase (Anonim,2010:1)
Katalase adalah enzim yang mengkatalisis dekomposisi hidrogen peroksida (H 2O2) selain peroksidase dan glutation peroksidase. Produk reaksi dekomposisi oleh katalase adalah molekul air (H2O) dan oksigen (O 2). Hidrogen peroksida sebagai substrat merupakan salah satu metabolit atau spesi oksigen reaktif yang bersifat sitotoksik dan sebagai inhibitor beberapa enzim (Anonim,2010:1). Mekanisme pembentukan enzim katalase untuk memecah H 2O2 yaitu saat melakukan respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H 2O2. Bakteri yang memiliki kemampuan memecah H2O2 dengan enzim katalase maka segera membentuk suatu sistem pertahanan dari toksik H2O2 yang dihasilkannya sendiri. Bakteri katalase positif akan memecah H2O2 menjadi H2O dan O2 dimana parameter yang menunjukkan adanya aktivitas katalase tersebut adalah adanya gelembung-gelembung oksigen seperti pada percobaan yang telah dilakukan. Dengan enzim katalase, H 2O2 diurai dengan reaksi sebagai berikut: 2H2O2 --> 2H2O + O2 -
Siklus terjadinya reaksi enzim katalase
Pada siklus reaksi katalase diatas yang bereaksi dengan molekul dari peroksida untuk membentuk campuran intermediate/antara dari suatu kation porfirin radikal berisi FeIV. Berikutnya, oksidasi dari suatu donor elektron mengembalikan campuran siklus reaksi dari katalase-katalase mulai dengan highspin ferric (FeIII) pada (FeIII) pada kondisi awal (Simon,2008:1). -
Sifat-Sifat Enzim Katalase Aktivitas katalitik katalase memiliki dua jenis reaksi yaitu secara katalitik dan
peroksidatik yang mendekomposisi mendekomposisi hydrogen peroksida dan hidroperoksida hidroperoksida Katalitik
: H2O2 + H2O2
Peroksidatik : H2O2 + 2 AH 2
2 H2O + O2 2 H2O + HAAH (suatu produk terpolimerisasi).
Katalase memiliki berat molekul berkisar antara 53.000-65.000 Da. Molekul katalase memiliki lebih dari 500 residu asam amino tiap rantai protoprofirinnya. Katalase aktif pada kisaran pH 2-12 dan optimum pada pH 5,0 – 9,0. 9,0. Katalase tidak stabil terhadap panas dengan
temperatur optimum berkisar 0 – 55°C, sehingga katalase akan kehilangan aktifitasnya dengan cepat pada 35°C dan akan rusak pada 65°C. Katalase akan mengalami denaturasi dingin bila dibiarkan pada temperatur rendah bukan beku atau chilling . Katalase merupakan enzim oksidoreduktase (Wikipedia,2010:1). 2.3 Ekstraksi dan Fraksinasi Enzim Ektraksi merupakan salah satu metode pemisahan kimia. Pada percobaan ini ektraksi dilakukan dengan cara penyaringan. Penyaringan merupakan pemisahan endapan dari larutan induknya, tujuannya adalah agar agar endapan dan medium penyaring secara kuantitatif kuantitatif bebas dari larutan. Media yang digunakan untuk penyaringan adalah : 1. Kertas saring 2. Penyaring asbes murni (krus gooch) atau platinum ( krus munroe) 3. Lempeng berpori yang terbuat dari kaca bertahanan, silika atau porselen (Vogel,1994:). Fraksinasi adalah presipitasi ekstrak kasar dengan konsentrasi bertingkat dari garam atau pelarut organik jenuh . Metode ini dilakukan secara bertahap atau step by step agar didapatkan zat fraksi – fraksi fraksi enzim yang lebih murni. Metode ini dapat menggunakan garam (NH4)2SO4, presipitasi dengan (NH4)2SO4 didasarkan pada kecenderungan protein untuk memebentuk agregat dan mengendap dalam larutan akibat adanya garam berkonsentrasi tinggi (salting out).(NH4)2SO4 lebih dipilih sebagai garam yang digunakan karena memiliki kelarutan dan daya pengendapan yang tinggi, memiliki panas pelarutan yang rendah dan fleksibilitas pH , serta tidak akan mempengaruhi bentuk dan fungsi enzim (Winarno.1995). Selain itu, metode pemisahan dalam fraksinasi biasa dilakukan dengan sentrifugasi untuk memurnikan suatu senyawa. Sentifugasi merupakan tahap pertama dalam fraksinasi, memisahkan organel berdasarkan ukuran dan densitasnya. Prinsip sentrifugasi ialah bahwa untuk memperoleh organel yang besar, diperlukan kecepatan sentrifugasi yang rendah, dan sebaliknya (Anonim,2010:1) Enzim dapat diisolasi (difraksinasi) berdasarkan informasi tentang lokasi enzim tersebut di dalam sel. Enzim ekstraseluler (Eksoenzim) lebih mudah diisolasi karena dapat diperoeh tanpa pemecahan sel, sedangkan enzim intraseluler (Endoenzim) diisolasi dengan memecah dinding sel dan organel di dalam sel secara kimia maupun fisika. Sebagai makromolekul yang memiliki ukuran, bentuk dan muatan tertentu, maka enzim dapat dipisahkan atau dimurnikan terhadap campuran enzim yang ada. Berbagai cara dapat dilakukan diantaranya adalah melalui presipitasi, dialysis, adsorpsi, pertukaran ion, filtrasi dalam gel, ultrafiltrasi, pengikatan berdasarkan afinitas dan hidrofobisitas diisolasi dari sel
organisme melalui pemecahan dinding sel, membran sel, dan organel. Pada percobaan ini dilakukan menggunakan metode Fisika Mekanik yaitu dengan diblender. Katalase merupakan enzim intraselular (Endoenzim) sehingga dapat diisolasi dari sel organisme melalui pemecahan dinding sel, membran sel, dan organel. Pada percobaan ini dilakukan menggunakan metode Fisika Mekanik yaitu dengan diblender (Whitaker,1994:1).
4. Metodologi Percobaan 4.1 Alat dan Bahan 4.1.1 Alat
1. Blender 2. Sentrifugasi 3. Tabung reaksi 4. Beaker glass (100 mL) 5. Pipet tetes 6. Botol 7. Gelas ukur (50 mL dan 10 mL) 8. Labu ukur (10 mL) 9. Corong 10. Kertas saring 11. Termometer 12. pH-meter 12. pH-meter 13. Neraca 13. Neraca Analitik
4.1.2
Bahan
1. Kentang 2. Hidrogen Peroksida 3. Asam Askorbat
4. KCN 5. Asam Sitrat 6. NaCl 7. Bovine Serum Albumin (BSA) 8. Natrium fosfat ( ) (0,05M) 4.2 Prosedur Kerja 1. Ekstraksi
Sebanyak 15 gram kentang dikupas dan potong kecil-kecil. Kemudian sampel ditambahkan dengan 10 mL buffer Natrium Fosfat dengan konsentrasi 50 mM dengan pH 7, dan 0,5 gram asam askorbat. Campuran diatas dihomogenkan dengan cara blender. Setelah campuran diblender, didiamkan selama kurang lebih 5 jam pada suhu 4 0C agar dihasilkan enzim yang maksimal. Kemudian saring dan ambil filtratnya untuk dilakukan sentrifugasi. Lamanya proses sentrifugasi ini adalah selama 30 menit dan kemudian ambil bagian supernatannya untuk kemudian dilakukan pengujian lebih lanjut. 2. Penentuan Protein Supernatan yang diperoleh dari prosedur sebelumnya kemudian dilakukan pengujian kadar protein dengan menggunakan bovine serum albumin sebagai pengujinya. 3. Penentuan Enzim Aktivitas enzim ditentukan pada suhu 25 0C. Campuran reaksi yang berisi 30 mM H2O2 pada 50 mM buffer natrium fosfat pH 7,0 dan 0,1 mL enzim pada volume total 3 mL. Aktivitas enzim diperkirakan dengan penurunan absorbansi H2O2 pada 240 nm 4. Melihat pengaruh pH, suhu dan inhibitor
Pengaruh pH
Pengaruh pH pada aktifitas CAT pada kentang perbedaan nilai pH (pH 3-9). pH optimum dari CAT pada kentang ditentukan
Pengaruh Suhu
Pengaruh suhu suhu pada aktifitas CAT pada
kentang perbedaan suhu suhu (pH 20-80). suhu
optimum dari CAT pada kentang ditentukan
Pengaruh Inhibitor
Pengaruh inhibitor KCN, asam sitrat, dan CuSO4
