Jurnal Metode Analisis Kloramfenikol Salep

SUSANTI, et al./ VALIDASI METODE BIOAUTOGRAFI UNTUK DETERMINASI KLORAMFENIKOL

Validasi Metode Bioautografi untuk Determinasi Kloramfenikol Validation of Bioautographic Method for the Determination of Chloramphenicol Meliana Susanti, Isnaeni, Sri Poedjiarti Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya

ABSTRACT Background: Contact bioautography method has been developed for determination of chloramphenicol concentration. Validation of bioautography method has beed carried out by using parameters including linearity, accuracy, precision, and detection limit. Methods: Thin Layer Chromatography of chloramphenicol has been performed by using Silica gel 60 F254 as a stationary phase, chloroform : methanol (80:20, v/v) and UV lamp as a solvent and for spot visualization respectively. Before spotting, analyte of the chloramphenicol was dissolved in aceton as solvent. Bioautography has been performed by using Escherichia coli ATCC 25922 as a bacterial and Nutrient Agar as medium test. Results: It was found that one spot visualized on the chromatogram has Rf value 0.5. The result showed that respon of activity to be linear at the amount of chloramphenicol between 100 ppm-200 ppm, with regression quotion: Y = 2.8X - 4.3, r value =0.9 and Vxo = 1.8%. Accuracy and precision of the method are 2.8% + 2.3 and 96.2% + 4.7 respectively. Conclusion: Detection Limit (DL) value is 0.06 µg could be expressed as Minimum Inhibition Concentration (MIC). Jurnal Kedokteran Indonesia: 1 (1): 15-24 Keywords: chloramphenicol, bioautography, Validation method

PENDAHULUAN Kloramfenikol adalah salah satu jenis antibiotika turunan amfenikol yang secara alami diproduksi oleh Streptomyces venezuelae (Reynolds, 1982). Melalui pengembangan teknologi fermentasi, kloramfenikol dapat diisolasi, disemisintesis menjadi antibitoka turunannya, antara lain tiamfenikol dan turunan lain melalui berbagai reaksi kimia dan enzimatis (http://www. springerlink. com/ content/p573u390x883183 k). Senyawa dengan rumus molekul C11H12Cl2N2 O5 dan nama kimia D(-) treo-2-dikloroasetamido1-p-notrofenilpropana-1,3-diol, memiliki struktur molekul tersaji pada Gambar di bawah ini (USP XXXI, 2008).

Gambar 1. Struktur Bangun Kloramfenikol

Struktur bangun pada Gambar 1 memberi informasi bahwa kloramfenikol memiliki dua atom karbon asimetrik, sehingga menghasilkan 4 stereoisomer. Mekanisme kerja kloramfenikol sebagai anti bakteri bersifat stereospesifik, karena hanya satu stereoisomer yang memiliki aktivitas anti bakteri, yaitu D(-) treo-isomer. Kloramfenikol bekerja pada spektrum luas, efektif baik terhadap Gram positif maupun Gram negatif. Mekanisme kerja kloramfenikol melalui penghambatan terhadap biosintesis protein pada siklus pemanjangan rantai asam amino, yaitu dengan menghambat pembentukan ikatan peptida. Antibiotika ini mampu mengikat subunit ribosom 50-S sel mikroba target secara terpulihkan, akibatnya terjadi hambatan pembentukan ikatan peptida dan biosintesis protein. Kloramfenikol umumnya bersifat bakteriostatik, namun pada konsentrasi tinggi dapat bersifat bakterisid terhadap bakteri-bakteri tertentu (Ganiswarna, 1995). Spektrum antibakteri kloramfenikol meliputi D. pneumoniae, Str. pyogenes, Str. viridans, Neisseria, Haemophilus, Bacillus spp, Listeria, Bartonella, Bru-

15

JURNAL KEDOKTERAN INDONESIA, VOL. 1/NO. 1/JANUARI/2009

cella, P. multocida, C. diphtheriae, Chlamydia, Mycoplasma, Rickettsia, Treponema dan kebanyakan mikroba anaerob. Senyawa ini juga efektif terhadap kebanyakan galur E. coli, K. pneumoniae, dan Pr. mirabilis (Ganiswara, 1995). Kloramfenikol efektif mengobati riketsia dan konjungtivitas akut yang disebabkan oleh mikroorganisme, termasuk Pseudomonas sp. Kecuali Pseudomonas aeruginosa, senyawa ini juga efektif untuk pengobatan infeksi berat yang disebabkan oleh Bacteroides fragilis (infeksi kuman anaerob di bawah diafragma), Haemophylus influenzae (meningitis purulenta), Streptococcus pneumoniae (pneumoniae) (Soekardjo et al., 2000). Akhir-akhir ini, makin sering dilaporkan adanya resistensi S. typhi terhadap kloramfenikol, namun secara generik kloramfenikol masih dianggap sebagai obat pilihan untuk mengobati demam tifoid. Pada saat ini, kloramfenikol muncul dalam komoditas perikanan udang dan produk frozen foods yang lain (ikan, katak dsb.), yang digunakan bukan hanya untuk komoditas dalam negeri, tetapi juga kebutuhan ekspor. Sebagai contoh, kloramfenikol digunakan oleh petani tambak dengan maksud mencegah penyakit udang yang disebabkan oleh bakteri Salmonella (Efendi, 2007). Selain itu, dari hasil analisis sampel udang yang harus memenuhi persyaratan bebas atau dalam batas yang diijinkan sebelum diekspor, ditemukan residu kloramfenikol yang melampaui batas yang dipersyaratkan (0.1-1 ppb). Residu kloramfenikol juga dilaporkan terdeteksi pada hati dan ginjal ayam petelur apkir (Anonim, 2004), serta dalam produk yang dihasilkan oleh lebah (Dharmananda, 2003). Fenomena ini menimbulkan problematika spesifik terkait resistensi antibiotika, yang harus ditangani secara intensif. Para pembeli frozen foods ekspor menindak tegas pemasok yang melanggar batas residu dalam produknya, bahkan apabila terdeteksi residu antibiotik dalam jumlah melampaui batas yang telah ditetapkan, seluruh produk dalam containers akan dibakar dan pemasok dimasukkan ke dalam “black list”. Untuk itulah para distributor atau produsen mengantisipasi produknya sebelum laik ekspor harus melalui uji lolos residu antibiotik. Artikel ini disajikan untuk merespon kebutuhan para pengguna jasa analisis, khususnya kloram-

16

fenikol dalam matriks yang komplek. Berbagai metode analisis yang dikembangkan, misalnya untuk mendeteksi residu kloramfenikol dalam udang antara lain KLT dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Salah satu metode yang dikembangkan berbasis pada gabungan sifat fika-kimia dan mikrobiologi adalah bioautografi. Metode ini sangat membantu dalam melakukan skrining atau penapisan awal kloramfenikol dalam matrik yang komplek baik tunggal maupun dalam bentuk campuran dengan antibiotika lain, karena keberadaan kloramfenikol dalam sampel dapat diidentifikasi tidak hanya berdasarkan sifat fisikakimianya, melainkan berdasarkan aktivitas biologisnya sebagai anti mikroba. Metode tersebut didasarkan pada aktivitas biologi analit baik sebagai antibakteri, antifungi, antitumor, maupun antiprotozoa (Choma, 2005). Bioautografi sering digunakan untuk mendeteksi antibiotik yang dapat dianalisis dengan KLT atau kromatografi kertas. Pada umumnya, efek biologi senyawa yang dapat dikatakan menghambat pertumbuhan organisme dinyatakan sebagai zona hambat (Touchstone dan Dobbins, 1983). Dari kromatogram KLT dapat diketahui jumlah komponen dalam sampel yang ditotolkan berdasarkan jumlah noda (dengan penampak noda yang sesuai), sedang data bioautogram memberikan informasi jumlah komponen sampel yang memiliki aktivitas terhadap mikroba uji baik secara kualitatif maupun kuantitatif (Isnaeni, 2005). Prinsip uji mikrobiologi pada bioautografi menggunakan metode difusi. Metode tersebut sama dengan metode pada uji sensitivitas kerja antibiotik. Besar daya hambat pertumbuhan bakteri pada metode difusi diperoleh dengan mengukur diameter zona hambat (Choma, 2005). Penelitian tentang penggunaan metode bioautografi untuk penentuan kadar kloramfenikol telah dikembangkan, namun data validasi metodenya belum pernah dilaporkankan. Untuk mengetahui bahwa metoda ini dapat memberikan hasil yang baik, mendekati kebenaran dan dapat dipercaya, maka diperlukan uji validasi dengan parameter yang meliputi linieritas, akurasi, presisi, dan limit deteksi (LOD) (Indrayanto, 1994).


SUBJEK DAN METODE BAHAN Kloramfenikol p.a. (Phyto Technology Laboratories), aseton p.a., Escherichia coli ATCC 25922, serat agar (Food grade), serbuk instant Nutrient Broth (Difco), larutan salin, metanol p.a., kloroform p.a., dan asam asetat glasial p.a. ALAT Neraca analitik (Sartorius), bejana kromatografi, cawan petri diameter 15 cm, hair dryer, vortex, kawat Öse, pipet ukur, lempeng KLT Silika gel 60 F254, inkubator (Memmert), mycrolyter syringe, pipet mikro, jangka sorong (Tricle brand), otoklaf (Huxley HV340 Speedy), spektrofotometer (Shimadzu), micro balance (Shimadzu). Lampu UV (254 nm).

suspensi dikocok menggunakan vortex sampai seluruh koloni pada permukaan agar terlepas ke dalam larutan salin. Kerapatan optik inokulum bakteri diatur dan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25%, bila perlu dilakukan pengenceran atau pemekatan (Isnaeni, 2005). 3. Pembuatan Larutan Baku Kloramfenikol Larutan baku induk kloramfenikol disiapkan dengan cara ditimbang seksama kloramfenikol p.a sebanyak 25 mg dan dilarutkan dalam aseton sampai 25.0 mL (1000 ppm). Larutan baku kerja disiapkan dengan mengencerkan larutan baku induk 1000 ppm hingga diperoleh konsentrasi sesuai kebutuhan, misalnya 75 ppm, 100 ppm, 150 ppm dan 200 ppm.

METODE 1. Preparasi Media Media Nutrient Agar 100 mL dibuat dengan cara mencampurkan 3 gram serat agar dan serbuk Nutrient Broth 0.8 gram, ditambah air suling 100 mL, dipanaskan sambil diaduk hingga campuran larut dan homogen. Selanjutnya media yang masih cair tersebut segera diambil dengan pipet ukur dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, masing-masing sebanyak 10 mL dan 15 mL. Tabung yang berisi media tersebut ditutup dengan kapas bebas lemak, kemudian disterilkan menggunakan otoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Segera setelah dikeluarkan dari otoklaf, media 10 mL yang masih cair dimiringkan hingga padat. Media tersebut digunakan sebagai media peremajaan mikroba uji. Sedangkan media 15 mL tanpa dimiringkan digunakan sebagai media pertumbuhan mikroba uji. Media uji bioautografi dibuat dua lapis, masing-masing sebanyak lebih kurang 20 mL untuk lapisan dasar (base layer) dan 15 mL untuk lapisan atas sebagai media perbenihan yang diinokulasi dengan mikroba uji (Isnaeni, 2005). 2. Penyiapan Bakteri Uji Koloni bakteri E. coli dari kultur persediaan diambil dengan sengkelit sebanyak satu Öse, kemudian digesekkan pada permukaan agar miring dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Suspensi bakteri disiapkan dengan cara menambahkan larutan salin steril pada biakan agar miring, kemudian

4. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Pada tahap awal KLT, dilakukan pemilihan fasa gerak yang sesuai. Analisis KLT kloramfenikol dilakukan dengan cara menotolkan larutan baku kloramfenikol sebanyak 6 L dengan pipet mikro pada tiga lempeng KLT ukuran 1.5cm x 10cm, kemudian dielusi dengan tiga macam fasa gerak: air-metanol-kloroform (1:10:90, v/v) (Choma, 2003), kloroform-methanolasam asetat glasial (79:14:7, v/v) (Arlikaningrum, 2006) dan kloroform-metanol (85:15, v/v) (Sohaskey dan Barbour, 1999). Orientasi fasa gerak juga dilakukan dengan mengatur perbandingan komponen ketiga fasa gerak tersebut. Lempeng hasil elusi setelah dikeringkan di udara dan diamati dengan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dihitung masing-masing harga Rf setiap noda, kemudian dibandingkan satu sama lain untuk memilih harga Rf yang memasuki rentang 0.3 - 0.7 (Dirjen POM, 1995). 5. PELAKSANAAN UJI BIOAUTOGRAFI Larutan baku kerja kloramfenikol ditotolkan pada lempeng KLT, dielusi dengan larutan pengembang terpilih. Bioautogram dibuat dengan cara meletakkan hasil KLT (yang telah dikeringkan dengan aliran udara panas dalam cawan petri steril untuk menghilangkan sisa fasa gerak) di atas permukaan media perbenihan Nutrient Agar yang mengandung bakteri uji Escherichia coli (1.4 L/15 mL media), kemudian disimpan di dalam lemari es selama dua 17


jam agar proses difusi kloramfenikol dalam noda pada lempeng KLT ke dalam media uji menjadi sempurna. Cawan petri dikeluarkan dari lemari es, lempeng KLT diangkat dari permukaan agar, biakan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Zona yang terbentuk pada posisi noda diamati dan diukur diameternya (Isnaeni, 1998). 6. PENENTUAN KONSENTRASI ANALIT Pada penentuan konsentrasi analit, dilakukan penotolan larutan baku kerja dengan lima macam konsentrasi pada rentang 75 ppm - 200 ppm pada lempeng KLT ukuran 1.5 cm x 10 cm sebanyak 6 L dengan pipet mikro tanpa dielusi, kemudian dikeringkan. Noda diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 nm. Apabila noda telah tampak, dilakukan bioautografi dengan tahapan seperti butir 5. Berdasarkan hasil orientasi konsentrasi tersebut dilakukan uji bioautografi. Konsentrasi dan jumlah penotolan tersebut juga digunakan sebagai referensi penentuan parameter validasi. 7. PENENTUAN LINEARITAS Penentuan linearitas dilakukan dengan konsentrasi larutan kloramfenikol 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, 175 ppm dan 200 ppm pada lempeng KLT ukuran 9.5 cm x 10 cm. Setelah didapatkan zona hambat hasil uji bioautografi, ditentukan koefisien korelasi (r) dan koevisien korelasi fungsi (Vx0) antara diameter zona hambat dengan logaritma konsentrasi. 8. PENENTUAN AKURASI Dilakukan penimbangan kloramfenikol, kemudian diencerkan dengan aseton hingga didapatkan konsentrasi 125 ppm; 150 ppm; dan 175 ppm (kadar sebenarnya). Masing-masing konsentrasi direplikasi tiga kali mulai dari penimbangan, kemudian ditotolkan pada lempeng KLT ukuran 10 cm x 1,5 cm sebanyak 6 L dan dielusi dengan fasa gerak terpilih secara bersamaan dalam satu bejana. Hasil elusi kemudian diuji bioautografi kontak hingga diperoleh zona hambat. Diameter zona hambat diukur dan diplotkan pada kurva linearitas, sehingga didapatkan sebuah konsentrasi (kadar yang diperoleh), kemudian dihitung harga persen perolehan kembali (recovery).

18

9. PENENTUAN PRESISI Dilakukan penimbangan kloramfenikol, kemudian diencerkan hingga didapatkan konsentrasi 125 ppm; 150 ppm; dan 175 ppm. Masing-masing konsentrasi direplikasi tiga kali, kemudian ditotolkan pada lempeng KLT ukuran 10 cm x 1,5 cm sebanyak 6 L dan dielusi bersamaan dengan fasa gerak terpilih. Hasil elusi kemudian diuji dengan bioautografi kontak hingga diperoleh zona hambat, diameter zona hambat diukur dan dihitung harga SD untuk perhitungan harga KV. 10. PENENTUAN LIMIT DETEKSI Penentuan limit deteksi dilakukan dengan larutan kloramfenikol konsentrasi 100 ppm – 200 ppm dan penotolan sebanyak 6 L, kemudian dilakukan pengenceran bertingkat dan ditotolkan pada lempeng KLT ukuran 9.5 cm x 10 cm sebanyak 6 L. Lempeng dielusi, selanjutnya dilakukan uji bioautografi, zona hambat yang didapat diukur diameternya. HASIL-HASIL 1. KETENTUAN PARAMETER VALIDASI Linearitas metode bioautografi dikatakan valid apabila harga koefesien korelasi (r) lebih besar dari r Tabel atau harga koefisien variasi fungsi (Vx0) tidak lebih dari 5%. Akurasi dinyatakan memenuhi harga persyaratan validasi, jika persen perolehan kembali 80%120%. Harga parameter presisi dapat diterima sebagai metode yang valid apabila harga KV tidak lebih dari 5%. Limit deteksi ditentukan melalui harga Kadar Hambat Minimum (KHM) kloramfenikol, konsentrasi kloramfenikol terkecil yang masih menunjukkan aktivitas menghambat pertumbuhan E. coli. 2. PENENTUAN FASA GERAK Hasil KLT koramfenikol untuk penentuan fasa gerak tersaji pada Gambar 1 dan Tabel 1. Dari kelima harga Rf fasa gerak yang dianalisis, fasa gerak yang memenuhi nilai Rf 0.3-0.7 adalah kloroform : metanol: asam asetat glasial (83:10:7, v/v) dan kloroform : metanol (80:20, v/v). Selanjutnya dipilih fasa gerak kloroform : metanol (80 : 20) dengan harga Rf 0,57 untuk uji bioautografi.


(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Gambar 1. Hasil elusi kloramfenikol dengan fasa gerak air : metanol : kloroform (1 : 10 : 90, v/v) (a), kloroform : metanol : asam asetat glasial (79 : 14 : 7, v/v) (b), kloroform : metanol : asam asetat glasial (83 : 10 : 7, v/v) (c), kloroform : metanol (85 : 15,v/v) (d), dan kloroform : metanol (80 : 20,v/v) (e). Tabel 1. Harga Rf

3. PENENTUAN KONSENTRASI KLORAMFENIKOL Penentuan konsentrasi tanpa dilakukan elusi pada rentang konsentrasi 75 ppm – 200 ppm sebanyak 6 L tersaji pada Gambar 2. Data dalam Gambar 2 menunjukkan bahwa pada konsentrasi 75 ppm tidak dihasilkan zona hambat.

Gambar 2. Penentuan konsentrasi kloramfenikol tanpa elusi menggunakan fasa gerak kloroform : metanol (80:20,v/v) pada konsentrasi 75 ppm – 200 ppm.

Penentuan konsentrasi dengan elusi menggunakan fasa gerak kloroform : metanol (80:20, v/v)

dilakukan pada konsentrasi 75 ppm – 200 ppm. Pada konsentrasi tersebut diperoleh zona hambat seperti pada Gambar 3. Hasil penentuan konsentrasi secara sistematis tersaji pada Tabel 2. Pada konsentrasi 75 ppm – 200 ppm bioautogram dengan fasa gerak kloroform: metanol (80:20, v/v) dan jumlah penotolan 6 L menunjukkan zona hambat yang nyata.

Gambar 3. Penentuan konsentrasi kloramfenikol dengan elusi menggunakan fasa gerak kloroform : metanol (80 : 20, v/v) pada konsentrasi 75 ppm – 200 ppm.

19


Tabel 2. Tabel Penentuan Konsentrasi kloramfenikol setelah bioautografi

Tabel 3. Hasil uji bioautografi parameter linearitas

Dari data di atas dibuat kurva linearitas yang tersaji pada Gambar 5, dengan persamaan garis regresi Y = 2.8X - 4.3 dan koefisien korelasi (r) = 0.9. Harga koefisien variasi fungsi (Vx0) = 1.8%.

Data di atas kemudian digunakan sebagai acuan untuk penentuan parameter linearitas, akurasi, dan presisi, serta penentuan harga KHM kloramfenikol sebagai parameter limit deteksi. 4. PENENTUAN PARAMETER VALIDASI 4.1. Penentuan Linearitas Penentuan parameter validasi linearitas dilakukan seperti prosedur 7. Hasil uji bioautografi parameter linearitas dapat dilihat pada Gambar 4 dan Tabel 3. Hasil penentuan linearitas menunjukkan bahwa diameter zona hambat meningkat proporsional dengan peningkatan konsentrasi kloramfenikol.

Gambar 5. Kurva hubungan antara logaritmik konsentrasi kloramfenikol dan diameter zona hambatan

4.2. Akurasi Penentuan akurasi dilakukan pada konsentrasi 125 ppm, 150 ppm, dan 175 ppm. Hasil bioautografi parameter akurasi dapat dilihat pada Gambar 6. Hasil analisis persen recoveri terdapat pada Tabel 4. Akurasi dinyatakan dengan persen perolehan kembali, diperoleh dengan memplotkan diameter zona (mm) hambat uji bioautografi pada kurva linearitas y = 2.8x - 4.3. Dari hasil analisis akurasi diperoleh harga persen perolehan kembali 98.8% ± 0.5.

Gambar 4. Hasil uji bioautografi parameter linearitas

(a)

(b)

(c)

Gambar 6. Hasil uji bioautografi parameter akurasi pada konsentrasi 125 ppm (a), 150 ppm (b), dan 175 ppm (c)

20


Tabel 4. Hasil uji bioautografi parameter akurasi

4.3. Presisi

4.4. Limit Deteksi

Hasil uji bioautografi kloramfenikol parameter presisi pada konsentrasi 125 ppm, 150 ppm, dan 175 ppm tersaji pada Gambar 7 dan Tabel 5.

Hasil pengamatan untuk parameter limit deteksi dapat diamati pada Gambar 8 dan Tabel 6.

(a)

(b)

(c)

Gambar 7. Hasil uji bioautografi parameter presisi pada konsentrasi 125 ppm (a), 150 ppm (b), dan 175 ppm (c) Tabel 5. Hasil uji bioautografi parameter presisi

Dari Tabel 5 dapat diamati terjadi variasi replikasi diameter zona hambat, terutama pada konsentrasi 125 ppm dan 175 ppm. Hasil pengolahan data diameter zona hambat diperoleh harga KV sebesar 2.8% ± 2.3.

Gambar 8 menunjukkan bahwa hasil uji bioautografi untuk menentukan harga KHM kloramfenikol, yang sekaligus digunakan sebagai harga parameter limit deteksi. Gambar 8 (a) uji bioautografi dilakukan pada konsentrasi 30 ppm -

21


(a)

(b)

(c)

Gambar 8. Penentuan limit deteksi menggunakan konsentrasi 0.5 ppm hingga 80 ppm

Tabel 6. Hasil uji bioautografi parameter limit deteksi

80 ppm, dihasilkan zona hambat pada semua konsentrasi. Gambar 8 (b) dilakukan pada konsentrasi 10 ppm – 40 ppm, juga diperoleh zona hambat pada semua konsentrasi. Gambar 8 (c) dilakukan pada konsentrasi 0.5 ppm – 10 ppm, hasilnya tidak dihasilkan zona hambat pada semua konsentrasi. Dari hasil uji bioautografi tersebut ditetapkan konsentrasi 10 ppm sebagai KHM kloramfenikol. Dari data di atas dapat ditentukan limit deteksi uji bioautografi kloramfenikol pada konsentrasi 10 ppm dengan jumlah penotolan 6 L, atau setara dengan 0.006 g kloramfenikol. PEMBAHASAN Validasi metode bioautografi untuk penetapan kadar kloramfenikol diharapkan dapat menjamin metode tersebut ketika diaplikasikan untuk analisis analit dalam matrik yang komplek. Aplikasi metode bioautografi untuk determinasi kloramfenikol dapat dilakukan pada sampel produk pertaniaan, peternakan, dan makanan. Dengan alasan tersebut, maka kajian ini diharapkan dapat membantu industri produk pertanian dan peternakan menjamin mutu produk melalui metode yang sederhana dan murah.

dibanding metode bioautografi yang lain. Selama proses difusi, noda kloramfenikol pada lempeng KLT ke dalam media yang mengandung mikroba uji, petri disimpan di dalam lemari es selama dua jam untuk mencegah mikroba uji berkembang sebelum proses difusi sempurna. Penentuan fasa gerak yang tersaji pada Gambar 1 menggunakan lima sistem fasa gerak menunjukkan bahwa fasa gerak air : metanol : kloroform (1:10:90, v/v) menghasilkan kromatogram dengan jarak tempuh noda dan harga Rf yang paling kecil, yaitu sebesar 0.1. Sistem tersebut mengandung kloroform dengan proporsi yang lebih besar, sehingga sistem relatif lebih semi menuju ke polar. Sebaliknya, sistem fasa gerak yang memiliki jarak tempuh noda dan harga Rf paling besar adalah kloroform : metanol : asam asetat glasial (79:14:7, v/v). Harga Rf yang dihasilkan 0.7. Sistem ini relatif bersifat kurang polar dibandingkan sistem pertama. Gambar 2 juga menampilkan replikasi jarak tempuh noda pada kromatogram yang bervariasi dalam satu sistem fasa gerak. Fenomena ini terjadi karena adanya perbedaan kejenuhan dalam bejana kromatografi. Kondisi dalam bejana kromatografi selama elusi sangat komplek, karena melibatkan tiga faktor yaitu lempeng KLT sebagai fasa diam, sistem fasa gerak, dan uap (Sherma, 2003).

Ditetapkan fasa gerak terpilih adalah kloroform: metanol (80:20, v/v) dengan alasan komponennya lebih sederhana, hanya tersusun dari dua komponen pelarut. Selain itu, komposisi perbandingan kloroform lebih sedikit, sehingga lebih ekonomis jika diaplikasikan dalam industri. Faktor lain yang sangat berpengaPemilihan metode bioautografi kontak ruh, fasa gerak kloroform : metanol : asam asetat dikembangkan, karena relatif lebih sederhana 22


glasial (83:10:7, v/v) menyebabkan zona hambat kloramfenikol tidak dapat diamati. Fenomena ini dapat dijelaskan bahwa asam asetat glasial dapat menghambat pertumbuhan mikroba uji. Hasil kajian ini menunjukkan bahwa dengan metode bioautografi dapat diamati pengaruh aktivitas pelarut terhadap mikroba uji, dan fenomena ini tidak dapat diamati dengan metode fisika-kimia. Hasil penentuan konsentrasi digunakan sebagai acuan untuk menentukan konsentrasi linearitas dan parameter yang lain. Penentuan konsentrasi tanpa elusi ditunjukkan pada Gambar 2 (a). Konsentrasi 75 ppm tidak menunjukkan zona hambat karena permukaan media agar yang tidak rata, sehingga noda kloramfenikol pada lempeng KLT tidak dapat menempel dan berdifusi pada media. Hasil pengamatan linearitas menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi kloramfenikol, diameter zona hambat yang dihasilkan semakin besar. Namun hal tersebut tidak berarti bahwa diameter zona hambat dapat menggambarkan konsentrasi kloramfenikol secara linear. Untuk penentuan linearitas, digunakan hubungan antara logaritma konsentrasi kloramfenikol dengan diameter zona hambat kloramfenikol. Persamaan garis regresi yang dihasilkan adalah Y = 2.8X – 4.3 dan koefisien korelasi (r) = 0.9. Koefisien korelasi (r) disyaratkan harus lebih besar dari r Tabel. Harga r Tabel untuk derajat bebas 4 pada 0.05 adalah 0.8, maka harga r hitung memenuhi persyaratan. Harga koefi sien variasi fungsi (Vx 0 ) = 1.8%. Harga tersebut memenuhi syarat, yaitu lebih kecil dari 5% (Indrayanto, 1994). Kurva linearitas yang terbentuk dari logaritma konsentrasi dan diameter zona hambat (Gambar 4) menunjukkan garis linear. Dengan demikian, dapat disimpulkan adanya korelasi linear antara logaritma konsentrasi dengan zona hambat kloramfenikol pada konsentrasi 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, 175 ppm, dan 200 ppm. Persen perolehan kembali yang didapat sebagai harga parameter akurasi sebesar 98.8% ± 0.5. Harga tersebut memenuhi rentang yang dipersyaratkan untuk bioanalisis, yaitu 80% - 120% (Hartman et al., 1994). Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa metode bioautografi akurat dan dapat menggambarkan kadar sebenarnya.

Penentuan parameter presisi menunjukkan variasi replikasi diameter zona hambat. Variasi ini dapat disebabkan aseton yang digunakan sebagai pelarut kloramfenikol mudah menguap, sehingga terjadi variasi konsentrasi ketika ditotolkan. Harga koefisien variasi (KV) konsentrasi 125 ppm, 150 ppm, dan 175 ppm berturut-turut adalah 3.7%, 0.2%, dan 4.7%, sedang harga KV rata-rata 2.8% ± 2.3. Baik harga KV masing-masing konsentrasi maupun KV rata-rata memenuhi persyaratan, yaitu tidak melebihi 5% (Skoog, 1980). Pada penentuan limit deteksi, konsentrasi 10 ppm pada Gambar 8 (b) masih menghasilkan zona hambat, tetapi pada Gambar 8 (c) konsentrasi 10 ppm tidak menunjukkan zona hambat. Maka, konsentrasi 10 ppm ditentukan sebagai harga KHM kloramfenikol. Nilai KHM merupakan konsentrasi terkecil kloramfenikol dapat menghambat pertumbuhan mikroba uji. Fenomena ini memberikan acuan dalam menentukan batas konsentrasi kloramfenikol yang masih dapat diamati menggunakan metode KLT. Harga KHM tersebut juga digunakan sebagai harga limit deteksi uji bioautografi kloramfenikol, yaitu konsentrasi 10 ppm dengan jumlah penotolan 6 L, atau setara dengan 0.006 g kloramfenikol. Dosis tengah untuk uji aktivitas kloramfenikol dengan bakteri E. coli sesuai Farmakope Indonesia Edisi IV adalah 2.5 g. Dibandingkan harga dosis tengah tersebut, harga KHM atau limit deteksi yang diperoleh lebih kecil dan merupakan batas pengamatan, sekaligus menujukkan kloramfenikol masih peka terhadap mikroba uji. Untuk memudahkan pengukuran diameter zona hambat pada uji bioautografi, diperlukan jumlah inokulum mikroba uji yang proporsionl dengan volume media dan potensi antibiotika, sehingga zona hambat dapat diamati dengan jelas. DAFTAR PUSTAKA Anonim (2009). http://www. springer link.com/content/p573u390x 883183k/, Accessed tanggal 22/05/2009. Anonim (2004). Residu Antibiotik pada Hati dan Ginjal Ayam Petelur Apkir. http://www.

23


republika.co.id /suplemen/cetak_detail.asp? mid =1&id=180684&katid=105&kat_id1=151 &kat_id2= 192. Accessed tanggal 24/10/2007.

ence report on bioanalytical method validation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 12, p. 1337-1343.

Arlikaningrun, R.D. (2006). Perbandingan Stabilitas Larutan Kloramfenikol dalam Dapar Borat dan Sitrat. Disertasi, Universitas Airlangga, Surabaya.

Isnaeni (1998). Mutasintesis Antibiotika Mutan Streptomyces griseus ATCC 10137. Disertasi, ITB, Bandung.

Choma, I. (2005). The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct Bioautography for Antimicrobial Analysis. http://www. lcgceurope.adv 100.com/lcgceu rope/article/aarticleDetail. jsp? id=177453. Accessed tanggal 24/10/2007.

Isnaeni (2005). Bioautogarafi antibiotika hasil fermentasi mutan Streptomyces griseus ATCC 10137. Majalah Farmasi Airlangga, No. 16, Vol. 5.

Dharmananda S. (2003). Traces of Chloramphenicol in Chinese Bee Products:

Ganiswarna, V.H.S. (1995). Farmakologi dan Terapi. Edisi ke-4, Jakarta: Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, hal. 571, 657-660.

Origin, Development, And Resolution. (2008). http://www.itmonline.org/arts/bees.htm. Accessed tanggal 13/2/2008.

Sherma, J. and Fried, B. (2003). Handbook of ThinLayer Chromatography, Ed. 3 rd, New York: Marcel Dekker, Inc., pp. 1-6, 437-438.

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan Departemen Kesehatan Republik Indonesia (1995). Farmakope Indonesia. Edisi ke-4, Jakarta: Departemen Kesehatan, hal. 891-1017.

Skoog, D.A. (1980). Principles of Instrumental Analisis. Ed. 3th, New York: Socunders College Publishing, pp. 560.

Efendi, E. (2007). Budidaya Perairan. http://www. unila.ac.id/~fp-ikan/index.php?option =com_ content7 task=view&id=73&Itemid= 115. Accessed tanggal 24/10/2007.

Sohaskey, C.D and Barbour, A.G. (1999). Esterases in serum-containing growth media counteract ChloramphenicolAcetyltrans ferase activity in vitro. Antimicrobial Agent and Chemotherapy, No. 3, Vol. 43, p. 655-660.

Harmita (2004). Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, No. 3, Vol. 1, p. 117-135.

Touchstone, J.C and Dobbins, M.F. (1983). Practice of Thin Layer Chromatography. Ed. 2nd, New York: John Wiley & Sons, Inc, p. 1-15, 361-365.

Indrayanto, G. (1994). Metode validasi pada analisis dengan kromatografi. Medika-Jurnal kedokteran dan Farmasi, hal. 49-51.

The United States Pharmacopeial Convention (1999). The United States Pharmacopeia. Ed. 31th, Vol. 2rd, Philadelphia: The United States Pharmacopeial Convention, Inc., pp. 1704.

Hartman, C., Massart, D.L., McDowell, R.D. (1994). An analysis of the Washington Confer-

24

Jurnal Metode Analisis Kloramfenikol Salep

Recommend Documents