Jurnal Bioteknologi Farmasi

prosiding seminar seminar nasional nasional pengolahan produk dan bioteknologi kelautan kelautan dan perikanan perikanan 2010

KARAKTERISASI ENZIM ENZ IM KOLAGENASE KOL AGENASE ORGAN DALAM IKAN PATIN PATIN (Pangasius pangasius) Roni Nugraha*), Lily Viruly *), Nurlaila Ervina Herliany*), Suwarjoyowirayatno Suwarjoyowirayatno*), Mutia Hikmawati *), Untung Trimo. L*), dan Deni D eni Syaputra*) ABSTRAK Kolagenase merupakan salah satu enzim proteolitik penyebab proses kemunduran mutu ikan. Kolagenase memutus ikatan peptida jaringan ikat daging dan mengakibatkan tekstur ikan menjadi lembek. Penelitian ini bertujuan mengekstrak enzim kolagenase dari organ dalam ikan patin. Aktivitas tertinggi enzim kolagenase ditemukan pada pankreas. Kolagenase dimurnikan dengan amonium sulfat dan dialisis kemudian diukur berat molekulnya dengan metode SDSPAGE. Kolagenase hasil pemurnian amonium sulfat memiliki aktivitas sebesar 1,6 U/mL, meningkat 15 kali dibandingkan ekstrak kasar kolagenase. Hasil elektroforesis menunjukkan kolagenase dengan aktivitas tertinggi memiliki berat molekul 89,93 kDa. Kolagenase memiliki aktivitas optimal pada pH 7 dan suhu 50°C. Kata kunci: Pangasius pangasius, pangasius , kolagenase, p ankreas, enzim proteolitik

PENDAHULUAN Indonesia memili ki potensi perikanan yang sangat besar, baik perikanan laut maupun perikanan darat. Salah satu komoditas perikanan darat yang diminati adalah ikan patin. Ikan patin memiliki k andungan protein tinggi yaitu lebih dari 65% (Setijaningsih et al., al., 2006). Kandungan gizi ikan patin akan menjadi tidak bernilai apabila tidak ditangani dengan baik setelah penangkapan ataupun pemanenan. Hal ini disebabkan ikan merupakan bahan pangan yang sangat rentan terhadap kerusakan (highly (highly perishable food ). ). Proses kerusakan atau kemunduran mutu ikan disebabkan oleh aktivitas enzim dan mikroorganisme. Kemunduran mutu ikan diawali adanya proses autolisis oleh enzim dan tidak berhubungan dengan aktivitas mikroorganisme (Gram & Huss, 1996). Selama proses kemunduran mutu, asam amino meni ngkat sebagai akibat kerja enzim proteolisis. Pemecahan ini menyebabkan kerusakan jaringan daging ikan dan ditandai dengan melemasnya daging ikan (Shigemuraet (Shigemura et al., al., 2003). Selain itu, proteolisis juga menghasilkan molekulmolekul yang menjadi sumber makanan bagi mikroorganisme untuk tumbuh. Enzim-enzim pencernaan p encernaan seperti katepsin, kimotripsin, tripsin, karboksipeptidase, kolagenase, dan kalpain merupakan enzim-enzim proteolitik yang berperan dalam proses kemunduran mutu ikan (Huss, 1995). Hasil penelitian Hernandez-Herrero et al. (2003) al. (2003) menunjukkan bahwa selama proses dekomposisi protein ik an, aktivitas aktiv itas kolagenase meningkat secara cepat dan bersama protease lainnya bertanggung jawab jawab dalam proses pemecahan jaringan kolagen ikan cod . Kolagenase merupakan enzim yang berperan dalam proses hidrolisis kolagen, protein yang berperan dalam menyatukan myocommata. Pemutusan kolagen menyebabkan fenomena gaping , yaitu pemutusan jaringan ikat otot dengan myocommata (Fletcher et al ., ., 1997). Aktivitas kolagenase ditemukan di berbagai organ pencernaan antara lain pankreas, pankreas, pilorik kaeka, usus, dan mesenterium (Yoshinaka (Yoshinaka et al ., ., 1978a). Aktivitas optimum kolagenase berada pada kisaran kisaran pH 7-9. Kim et al. al. (2002) membagi kolagenase menjadi dua jenis, yaitu metallokolagenase dan serin kolagenase. Metallokolagenase merupakan protease ekstraseluler yang terlibat dalam p roses katabolisme jaringan ikat (Delbarre-Ladrat et al., al., 2006) dan memiliki berat m olekul antara 30-150 kDa (Park et al ., ., 2002) sedangkan serin kolagenase kolagenase terlibat dalam produksi hormon dan farmakologi peptida aktif. Penelitian ini bertujuan m engkarakterisasi engkarakterisasi kolagenase yang diekstrak dari organ dalam pencernaan ikan patin. Pemanfaatan Pemanfa atan organ-organ tubuh ikan yang berpotensi sebagai limbah industri filet seperti jeroan term asuk pankreas, menjadi hal yang penting untuk direncanakan dalam rangka mewujudkan konsepzero konsepzero waste dan waste dan added value. value. BAHAN DAN METODE Bahan Bahan yang digunakan pada peneliti an ini antara lain organ dalam ikan patin (usus dan pankreas) yang dibersihkan dengan akuades dan disimpan dalam freezer , kolagen yang diambil dari kulit ikan patin, kantung *)

Departemen Teknologi Teknologi Hasil Hasi l Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB; E-mail: roni_nugr [email protected]

19

prosiding seminar nasional pengolahan produk dan bioteknologi kelautan dan perikanan 2010

dialisis dengan MWCO 12 kDa, amonium sulfat, L-leusin sebagai standar uji aktivitas kolagenase, bovine serum albumin sebagai standar dalam penentuan kadar protein, reagen untuk elektroforesis dan marker berat molekul. Metode Penelitian diawali dengan preparasi organ dalam ikan patin, kemudian dilanjutkan dengan pemurnian kolagenase. Isolasi enzim terdiri dari tiga tahap, yaitu ekstraksi, pengendapan, dan dialisis. Karakterisasi kolagenase dilakukan terhadap ekstrak kasar dan hasil pengendapan terbaik, meliputi p enentuan pH optimum, dengan pH yang diujikan yaitu pH 6-8, suhu optimum, dengan suhu yang diujikan 40-60oC. Substrat untuk uji aktivitas kolagenase adalah kolagen yang dibuat dari kulit ikan patin. Ekstraksi kolagenase organ dalam ikan patin Ekstraksi kolagenase mengacu pada Kim et al . (2002). Secara ringkas, ekstraksi kolagenase dilakukan dengan menghancurkan usus dan pankreas sampai homogen dalam larutan 100 mMbuffer Tris HCl (pH 8.0) yang mengandung 0,25% Triton dan 10 mM CaCl2. Homogenat disentrifugasi pada 7000xg selama 20 menit pada suhu dingin (4oC). Endapan diekstraksi kembali dengan penambahan buffer yang sama sebanyak 3x volume endapan. Supernatan dari sentrifugasi pertama dan kedua dikumpulkan dan dicampur dengan 20 mM buffer Tris HCl (pH 8,0) yang mengandung 0,36 mM CaCl2 kemudian didiamkan selama 48 jam dan menjadi ekstrak kasar kolagenase. Ekstrak kolagenase kasar selanjutnya dimurnikan dengan penambahan amonium sulf at dengan tingkat kejenuhan 70%. Endapan dikumpulkan dan dilarutkan dengan sedikit larutan 20 mM buffer Tris HCl (pH 8) yang mengandung 0,36 mM CaCl2 kemudian didialisis. Dialisis menggunakan kantung berukuran 8.000 MWCO dengan waktu dialisis selama 6 jam. Buffer yang digunakan adalah buffer Tris HCl 2 mM mengandung CaCl2 0,036 mM dengan volume 100 kali v olume sampel (Scopes, 1982). Uji aktivitas kolagenase Aktivitas kolagenase dianalisis menggunakan me tode spektrofotometri mengiku ti prosedur Kim et al . (2002) dengan sedikit perubahan. Sebanyak 0,1 mL larutan kolagenase ditambah dengan 5 mL larutan kolagen dan 1 mL 0,05 mM Tris-HCl pada pH 8,0 yang mengandung 5 mM CaCl2. Reaksi ini dilakukan pada suhu 37oC selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan penambahan 0,2 mL 0,5% TCA dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Selanjutnya larutan disentrifu gasi pada 1.800 rpm selama 20 menit. Supernatan, sebanyak 1 mL dicampur dengan 1,0 mL larutan ninhidrin, diinkubasi pada suhu 100oC selama 20 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Campuran kemudian ditambah dengan 5 mL 50% 1-propanol dan diukur serapannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Larutan buffer Tris-HCl digunakan sebagai blanko d an L-leusin digunakan sebagai standar. Karakterisasi kolagenase organ dalam ikan patin Karakterisasi bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum aktivitas kolagenase sehingga penggunaannya dapat disesuaikan dengan karakter tersebut. Selain itu juga untuk mengetahui dan mengontrol kemurni an pada setiap tahap dalam proses pemurnian. Karakterisasi kolagenase meliputi penentuan suhu optimum, dan pH optimum. Kisaran pH yang akan diujikan, yaitu 6,0-8, 0 dan suhu 40-60 oC. Analisis kadar protein Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford (1976). Bovine serum albumin digunakan sebagai standar. Absorban diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nM. Penentuan berat molekul Berat molekul ditentukan menggunakan gel elektroforesis SDS-PAGE dengan standar protein BM rendah. Pita protein diwarnai dengan Commassie Briliant Blue R-250. Standar protein yang digunakan antara lain fosforilase b (97 kDa), albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), karbonik anhidrase (30 kDa), dan inhibitor tripsin (20,1 kDa) .

20


Zimogram kolagenase Zimogram kolagenase menggunakan metode modifikasi Cottrell et al. (1999) dengan substrat 0,01% kolagen. Pita protein diwarnai dengan Commassie Briliant Blue R-250. Standar protein yang digunakan antara lain fosforilase b (97 kDa), albumin (66 kDa), ov albumin (45 kDa), karbonik anhidrase (30 kDa), inhibitor tripsin (20,1 kDa) dan lactalbumin (14,4 kDa). Panjang migrasi dari tiap pita yang dihasilkan diukur kemudian dibandingkan dengan marker dan ditentukan berat molekulnya. HASIL DAN BAHASAN Ekstraksi Kolagenase Ekstraksi merupakan tahap awal isolasi kolagenase. Pada penelitian ini, ekstraksi dilakukan secara terpisah terhadap dua organ dalam yai tu usus dan pankreas pada fase post rigor. Hasil uji aktivitas ekstrak kasar kolagenase pada kedua organ menunjukkan bahwa aktivitas kolagenase pada pankreas 15 kali lebih tinggi dibandingkan pada usus (Gambar 1). Hasil ini sesuai dengan penelitian yang dila kukan oleh Yoshinaka et al. (1978a) pada ikan Parasilurus asotus. Kolagenase merupakan salah satu protease yang ditemukan dalam organ dalam ikan. Enzim i ni berperan dalam proses pencernaan kolagen yang berhubungan dengan makanan alamiahnya (Yoshinakaet al . 1978b). Hasil penelitian Yoshinaka et al . (1978a) pada 19 jenis ikan menunjukkan bahwa kolagenase terdistribusi pada organ-organ dalam ikan seperti usus, pilorik kaeka, pankreas, dan mesenteri um. Peneliti yang sama juga mendapati bahwa aktivitas kolagenase tertinggi pada organ dalamrainbow trout ditemukan pada jaringan berlemak diantara pilorik kaeka. Oleh karena itu, diduga pankreas, merupakan sumber utama dari enzim kolagenase karena organ pankreas pada rainbow trout tergabung dalam jaringan berlemak diantara kaeka. ) L m / U ( m i z n E s a t i v i t k A

0,016 0,014 0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002

Pankreas

Usus

Gambar 1. Aktivitas kolagenase pada dua organ dalam ikan patin fase post rigor. Pemurnian Kolagenase Enzim kolagenase dimurnikan dengan amonium sulfat dan dilanjutka n dengan dialisis. Hasil pemurnian enzim kolagenase disajikan pada Tabel 1. Kemurnian enzim me ningkat hampir 16 kali setelah dimurnikan dengan ammonium sulfat. Penambahan amonium sulfat dilakukan karena sifatnya mudah larut, mu rah, dan umumnya tidak mempengaruhi struktur protein pada konsentrasi tertentu (Beynon & Bond, 2001). Meningkatnya aktivitas enzim pada endapan hingga penambahan amonium sulfat 70% disebabkan berkurangnya pengotor seperti non protein (karbohidrat), protein non enzim dan lain-lain (Suhartono, 1989). Tabel 1. Perbandingan aktivitas untuk setiap tahap pemurnian Tahap Pemurnian Ekstrak kasar Amoniu m s ulfat

Total Protein

Aktivitas Enzim

Total Aktivitas

AktivitasSpesifik

(mg)

(U/mL)

(U)

(U/mg)

Kelipatan Pemurnian

15,25

0,0152

0,760

0,05

1

2,04

1,6

1,600

0,78

15,7

21


Setelah proses presipitasi dengan amonium sulfat, dilakukan dialisis untuk mengurangi kadar garam (desalting ) yang tersisa. Perbedaan tekanan osmosis dari larutan buffer yang mengandung konsentrasi garam rendah (hipotonik) dengan larutan enzim dalam kantong dialisis yang mengandung garam tinggi (hipertonik) menyebabkan garam terdifusi keluar memb ran kantung dialisis, biasanya bersifat semipermeabel. Dialisis mengeluarkan protein dengan ukuran yang lebih kecil dari ukuran pori-pori kantung dialisis. Dialisis yang dilakukan dengan mengganti buffer beberapa kali akan meningkatkan kemurnian e nzim. Lama waktu difusi dan ukuran kantong dialisis serta konsentrasi buffer menentukan hasil dialisis. Diali sis selama 6 jam menggunakan kantong dialisis dengan 12 kDa MWCO. Penentuan Berat Molekul Berat molekul kolagenase dari pankreas ikan patin ditentukan dengan SDS-PAGE dari protein hasil pemurnian dengan dialisis. Hasil elektroforesis menunjukkan sampel dialisis m asih mengandung beberapa jenis protein (Gambar 2A) dengan didominasi oleh protein berukuran 18,87 kDa. Zimografi terhadap kolagen dilakukan untuk menentukan aktivitas kolagenase dari tiap-tiap pita protein. Zimogram menunjukkan aktiv itas kolagenase paling tinggi terlihat pada pita dengan berat molekul 89,93 kD (Gam bar 2B). Kolagenase pankreas ikan patin memiliki berat molekul 89,93 kDa. Kolagenase pankreas ikan patin memiliki berat molekul yang lebih tinggi dibandingkan kolagenase dari organ dalam ikan filefish (Novoden modestru, 27 kDa) (Kim et al ., 2002), organ dalam ikan makarel (Scomber japonicus; 14,8 kDa) (Park et al. 2002), daging filefish (Novoden modestrus; 42,0 kDa) (Kim & Kim, 1991), dan hepatopankreas udang (Pandalus eous, 22-23 kDa) (Aoki et al., 2003). Berdasarkan berat molekul, diduga kolagenase pankreas ikan patin termasuk dalam golongan metallokolag enase. Berat molekul metallokolagenase bervariasi dari 30 hingga 150 kDa. Kolagenase dari daging ikan Pasific rockfish (Sebastes sp. ) mempunyai berat molekul 47 dan 95 kDa (Brocho & Haard 1995).

A

B

Gambar 2. (A) Elektrogram hasil pemurnian dialisis, (B) Zimogram kolagenase pankreas ikan patin Efek pH dan Temperatur Kolagenase dari pankreas ikan patin berkerja secara efektif pada pH 7 (Gambar 3). Pada spesies yang lain, seperti ikan makarel (Scomber japanicus) (Park et al., 2002) dan ikan tuna (Thunnus thynnus) ( (Byun et al., 2002), kolagenase mempunyai pH optimum 7,5; kolagenase udang (Aoki et al. 2003) dan daging ikan Pasific rockfish (Sebastes sp. ) (Brocho & Haard, 1995), mempunyai pH optimum 7,5-8,5; sedangkan kolagenase dari usus ikan bandeng memiliki pH 7,0-8,0 (Yuniarti et al ., 2009). Temperatur optim um untuk kolagenase pankreas ikan patin berada pada suhu 50°C (Gambar 4). Enzim bekerja secara maksimum pada suhu tertentu. Aktivitasnya akan terus meningkat seiring d engan meningkatnya suhu sehingga dicapai suhu yang optimum, setelah melewati suhu optimum, aktiv itasnya akan kembali menurun (Pelezar & Chan, 1988). Beberapa hasil penelitia n menunjukkan bahwa suhu optimum kolagenase berkisar antara 40-60°C ( Kim & Kim, 1991, Byu n et al., 2002, Kim et al ., 2002; Park et al., 2002).

22


Gambar 3. Aktivitas kolagenase pada berbagai pH

Gambar 4. Aktiv itas kolagenase pada berbagai suhu KESIMPULAN Aktivitas kolagenase tertinggi ditemukan pada pankreas ikan patin dengan aktivitas sebesar 0,015 U/mL. Hasil pemurnian dengan amonium sulfat mampu meningkatkan aktiv itas enzim sebesar 15 kali lebih tinggi dibandingkan ekstrak kasarnya. Kolagenase pankreas ikan patin memiliki berat molekul 89,93 kDa dan bekerja secara optimal pada pH 7 dan suhu 50°C. Penelitian leb ih lanjut perlu dilaksanakan untuk mengetahui efek ion logam dan inhibitor terhadap aktivitas enzim. Selain itu diperlukan pemurnian lebih lanjut untuk meningkatkan aktivitas enzim kolagenase. DAFTAR PUSTAKA Aok i, H., Ahsan , M.N., Matsuo, K., Hagiwara, T., and W atanabe, S. 2003. Purificatio n and char acterizat ion of collagenolytic protease from the hepatopancreas of northern shrimp ( Pandalus eous). J. Agric Food Chem. 51(3): 777-783. Beynon, R.J. and Bond, J.S. 2001. Proteolytic Enzymes: a Practical Approach. Oxford University Press, New York. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytic al Biochemistry. 72: 248-254. Brocho, G.E. and Haard, N.F. 1995. Identification of two matrix metalloproteinase in the skeletal muscle of pacific rockfish (Sebastes sp.). J. Food Biochem. 19: 299-319. Byun, H.G., Park, J.P., Sung, N.I., and Kim, S.K. 2002. Purification and characterization of a serine proteinase from the tuna pyloric caeca. J. Food Biochem. 26(6): 479-494.

23


Cottrell, M.T., Moore, J.A., and Kirchman D.L. 1999. Chitinases from uncultured marine microorganisms. Applie d and Environmental Microbiology. 65(6): 2553-2557. Delbarre-Ladrat, C., Chéret, R., Taylor, R., and Verrez-Bagnis., V. 2006. Trends in postmortem aging in fish: understanding of proteolysis and disorganization of the myofibrillar structure. Critical Reviews In Food Science and Nutrition. 46(5): 409-421. Fletcher, G.C., Hallett, I.C., Jerrett, A.R., and Holland, A.J. 1997. Changes in the fine structure of the myocommata– muscle fibre junction related to gaping in rested and exercised muscle from king salmon ( Oncorhynchus tshawytscha). Lebensm.-Wiss. u.-Technol. 30: 246–252. Gram, L., and Huss, H.H. 1996. Microbiological spoilage of fish and fish products. International Journal of Food Microbiology . 33: 121-137. Hernandez-Herrero, M.M., Duûos, G., Malle, P., and Bouquelet, S. 2003. Collagenase activity and protein hydrolysis as related to spoilage of iced cod (Gadus morhua). Food Research International. 36: 141–147. Huss, H.H. 1995. Quality and quality changes in fresh fish. FAO Fisheries Technical Paper . FAO. 348:195. Kim, S.K., Park, P.J., Kim, J.B., and Shahidi, F. 2002. Purification and characterization of a collagenolytic protease from the filefish, Novoden modestrus. Journal of Biochemistry and Molecular Biology . 35(2): 165-171. Kim, Y.T., and Kim, S.K. 1991. Purification and characteristization of a collagenase from tissue of filefish ( Novodon modestrus). Korean Biochem J. 24: 401-409. Park, P.J., Lee, S.H., Byun, H.G., Kim, SH., Kim S.K. 2002. Purification and characterization of a collagenase from the mackerel, Scomber japonicus. Journal of Biochemistry and Molecular Biology . 35(6): 576-582. Pelezar, M.J.Jr. and Chan, E.C.S. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi . Volume 1. Hadioetomo, R. S., Imas, T., Tjitrosomo, S.S., Angka, S.L., (Penerjemah). Universitas Indonesia Press. Jakarta. Scopes, R.K. 1982. Protein Purification: Principles and Practice. Springer-Verlag, New York. Setijaningsih, L., Gunadi, B., and Umar, C. 2006. Budidaya ikan patin hibrida pada ekosistem pemeliharaan kolam air tenang. Prosiding Seminar Nasional Ikan . 4:39-144. Shigemura, Y., Ando, M., Tsukamasa, Y., Makinodan, Y., and KawaI, T. 2003. Correlation of type V collagen content with post-mortem softening of fish meat during chilled storage. Fisheries Science. 69: 842–848. Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi . IPB, Bogor. Yoshinaka, R., Sato, M., and Ikeda, S. 1978a. Distribution of collagenase in the digestive organs of some teleost. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries . 44(3): 263-267. Yoshinaka, R., Sato, M., and Ikeda, S. 1978b. Participation of collagenase in the digestion of collagen by rainbow trout. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries . 44(3): 639-641. Yuniarti, T., Nurhayati, T., dan Jacoeb, A.M. 2009. Ekstraksi dan karakterisasi kolagenase dari organ dalam bandeng (Channos channos Forskal). Prosiding Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan : 71-77.

TANYA JAWAB Tanya : Berapakah konsentrasi standar kolagen yang digunakan? Jawab : Konsentrasi standar yang digunakan 0,5 mM tanpa regresi linier.

24

Jurnal Bioteknologi Farmasi

Recommend Documents