UNIVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR FACULTAD DE CIENCIAS JURÍDICAS Y SOCIALES CARRERAS DE INVESTIGACIÓN CRIMINAL Y FORENSE –CRIMFOR –
TOXICOLOGIA FORENSE Instructivo de Laboratorio
Última revisión: noviembre de 2013
Tabla de Contenido Práctica 1: Intoxicación por Salicilatos ....................................... ..................................................... .......................... ............ ¡Error! Marcador no definido. Práctica 2: Análisis d e Alcohol etílico en sangre por microdifusión ..................... ¡Error! Marcador no definido. Práctica 3: Detección de alcohol en el aliento mediante el uso del alcoholímetro a lcoholímetro portátil ¡Error! Marcador no definido. Práctica 4: Práctica 3: Análisis de Plaguicidas Organofosforados......................... Organofosforados......................... ¡Error! Marcador no definido. Práctica 5: Test Cualitativo de Marihuana........................... ......................................... ............................ ................... ..... ¡Error! Marcador no definido. Práctica 6: Análisis de Drogas – Test Spot para Casos Generales ................ ......................... ......... ¡Error! Marcador no definido. Práctica 7: Análisis cualitativo y cuantitativo de materiales que contienen cocaína ¡Error! definido.
Marcador
no
Práctica 8: Identificación de drogas d rogas en general con kits específicos .................... .................... ¡Error! Marcador no definido.
i
PRÁCTICA 1: INTOXICACION POR SALICILATOS EFINICIÓN DEL PROBLEMA 1. DEFINICIÓN El ácido acetil salicílico (AAS) continúa siendo el analgésico antiinflamatorio y antipirético más usado a pesar de la aparición de nuevos fármacos siendo por dicho motivo por lo que se impone como modelo de intoxicación. La accesibilidad, el bajo precio y sobre todo la efectividad de los salicilatos hace que no sólo se utilicen en patologías tanto leves como severas con fines terapéuticos, sino que a la vez se extienda su administración incontrolada que puede provocar efectos fatales. Dosis claramente tóxicas son 300 μg/mL, y toxicidad severa se observará a concentraciones plasmáticas de 400 μg/mL. La dosis letal en adultos oscila entre 10 y 30 g y, en niños, se estima en 4 g.
2. OBJETIVOS 1. 2. 3.
Determinar la presencia de salicilatos en una muestra de orina. Determinar la concentración de salicilatos en una muestra a través de espectrofotometría. Analizar la presencia de salicilatos en una muestra sanguínea.
4. MATERIALES Y EQUIPO EQUIPO 1 Cepillo para tubo de ensayo • 1 Pipeta con bulbo • 8 Cubetas para espectrofotómetro • 1 Par de lentes de seguridad • 1 Caja de paños de limpieza • 2 Pipetas Mohr, una de 1.0 ml y una de 0.1 ml • 1 Gradilla para tubos de ensayo • 1 Espectrofotómetro para operación en el rango visible del espectro electromagnético • 1 Esponja • Tubos de ensayo de 10 cm REACTIVOS Y MUESTRAS BIOLOGICAS •
• • • •
•
3 muestras de orina (dos con diferente concentración de salicilatos y una en blanco) Muestras de sangre con contenido de salicilatos Cloruro Férrico al 10% Nitrato férrico al 1% Ácido nítrico 0.07 M Solución de nitrato férrico diluida: 5 partes de nitrato férrico 1% y 4 partes de ácido nítrico 0.07 M. Ácido nítrico 0.039 M: 5 partes de ácido nítrico 0.07 M y 4 partes de agua destilada. Acido Sulfurico concentrado Solución de ácido salicílico en stock, 100 mg / dl (100 mg/100 ml) que se prepara asi:
transferir 1.16 g de salicilato de sodio a un frasco de 1 litro, diluir a 1 litro con agua destilada. Añadir unas pocas gotas de cloroformo como preservante, almacenar la solución en un refrigerador. Descartar la 1
solución luego de 6 meses. Esta solución es equivalente a 100 mg / dl de ácido salicílico. El uso de esta solución de ácido salicílico como estándar no es recomendado. •Solución ácido salicílico como estándar, 5.0 mg / dl: transferir 5 ml de ácido salicílico en stock a 95 ml de
agua. •Solución de ácido salicílico de concentración desconocida.
5. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD Debe consultar las hojas de seguridad de cada uno de los reactivos a manipular y debe utilizar guantes de nitrilo, mascarilla y bata durante la práctica.
6. ANTECEDENTES Existen diferentes tipos de salicilatos, los cuales son empleados en una gran variedad de productos farmacéuticos. Así tenemos el ácido acetilsalicílico, utilizado utilizado en casi todas las tabletas para uso analgésico; analgésico; su nombre comercial más famoso es ASPIRINA®. El ácido salicílico se usa en ungüentos dermatológicos o como salicilato de sodio para uso interno. interno. El salicilato de metilo en preparados dermatológicos empleados con propósitos analgésicos, para aliviar dolores musculares. La dosis letal de cualquier salicilato se estima que es de 0.2 – 0.5 g/kg. Una Aspirina ® de adultos contiene 500 mg de ácido acetil salicílico. Métodos de Análisis La espectroscopia se refiere a la medición de la cantidad de luz absorbida por una solución, siendo la cantidad de luz absorbida proporcional a la concentración de los compuestos en la solución. Cada compuesto tiene asociadas unas cuantas longitudes de onda selectas que serán absorbidas, antes que el resto de longitudes en el espectro. Por tanto, mediante la selección cuidadosa de longitudes de onda, es muchas veces posible medir la concentración de un compuesto en la presencia de otros diversos. Los salicilatos reaccionan con las sales férricas (es decir, de hierro) para producir un color violeta, el cual es proporcional a la concentración del salicilato. Para la detección de salicilatos se debe utilizar una longitud de 540 nm para medir la absorción de luz. Dada la simplicidad del procedimiento para al salicilato, el supuesto de envenenamiento con salicilatos puede ser verificado en minutos, especialmente debido a que el envenenamiento severo produce un color violeta fuerte y fácilmente observable al aplicar el reactivo adecuado. Existen diversos tipos de espectrofotómetros en el mercado, uno de los cuales se presenta en la Figura No. 1. El sendero para la luz y los principales componentes se presentan en la Figura No. 2. El presente experimento consiste de dos partes. En la primera sección se obtiene el color púrpura del salicilato para varias soluciones de concentración conocida, preparando una curva de calibración, para luego determinar la concentración de la muestra desconocida. La segunda parte consiste en la determinación de salicilatos en una muestra de sangre.
2
Figura No. 1.- Ejemplo de Espectrofotómetro UV-VIS
7. PRE -LABORATORIO Conteste las siguientes preguntas: 1. 2. 3.
8.
¿debe haber normalmente salicilato presente en la sangre humana? explicar. ¿por qué se debe realizar el análisis en duplicado? indicar otra situación en que el análisis a nálisis anterior puede resultar útil.
PROCEDIMIENTO
PARTE A: DETERMINACION CUALITATIVA DE SALICILATOS ESTA ES UNA PRUEBA CUALITATIVA PARA DETERMINAR LA PRESENCIA DE SALICILATOS EN UNA DETERMINADA MUESTRA POR LO QUE LOS RESULTADOS SE REPORTAN COMO POSITIVO (presencia) O NEGATIVO (ausencia). 1. 2. 3. 4.
5.
Homogenizar la muestra biológica Colocar 1 mL de la muestra de orina a analizar en 3 tubos de ensayo (las primeras primeras dos muestra contienen diferente concentración de salicilatos salicilatos y la tercera no –referencia o blanco-). A cada muestra agregar 1 mL de Cloruro Férrico al 10% Proceder a calentar cada tubo de ensayo ensayo en baño de María con el objetivo de eliminar cuerpos cetonicos que puedan puedan estar presentes. Si los salicilatos están presentes presentes aparecerá un color morado violeta persistente. Agregar unas gotas de ácido sulfúrico concentrado, si desaparece el color se confirma la prueba. Si no desaparece el color color es indicativo de ácido acetilsalicílico, salicilato de sodio, fenilo y metilo, o de derivados fenólicos.
PARTE B. ESPECTROFOTOMETRÍA BÁSICA
1.
colocar siete cubetas para espectrofotómetro en una gradilla pequeña para tubos de ensayo. 3
2.
3. 4. 5. 6. 7. 8.
9. 10. 11.
12. 13.
pipetear las cantidades de material indicadas en la tabla no 1 en las seis cubetas, mezclar bien. calcular la concentración de salicilato en mg/dl para cada muestra conocida de salicilato y registrar el valor en la hoja de datos provista al final de la descripción de la práctica. (ayuda: la cubeta 2 tiene una concentración de salicilato de 0.25 ml/dl). nota: algunos cambios menores pueden ser requeridos en el procedimiento, dependiendo del espectrofotómetro utilizado. en caso de duda, consultar el manual de uso. encender el instrumento. puede ser necesario que se permita el calentamiento del mismo por 15 a 20 minutos para estabilizar la muestra y el detector. Ajustar la longitud de onda a 540 nm. Verificar que la lectura a realizar en el espectrofotómetro será de la de transmitancia. Ajustar el 0% T. Asegurarse que el compartimento para la muestra está completamente cerrado. Insertar la cubeta conteniendo el blanco hasta el fondo en el compartimento para muestras. Alinear la marca guía de la cubeta con la marca del instrumento (realizar una marca en el lado de la cubeta si se utilizan tubos de ensayo ordinarios). Ajustar la lectura a 100% T. Remover la cubeta del compartimento. Nota: en caso de que la lectura esté fuera de rango, diluir la muestra. Insertar cada estándar conocido de ácido salicílico en el compartimento de muestra, y obtener la lectura de transmitancia para cada muestra. Registrar cada lectura en la hoja de datos. Graficar el porcentaje de transmitancia (% T) en el eje vertical en una hoja de papel milimetrado, y la concentración © en mg/dl en el eje horizontal para las cubetas 1 a 6. Ajustar una recta por Mínimos Cuadrados Ordinarios. Esta línea es conocida como curva de calibración. Pipetear 1.0 ml de la solución desconocida en una cubeta, mezclar con 1.0 ml de nitrato férrico diluido. Determinar la absorbancia. Utilizando la curva de calibración y la lectura de absorbancia anterior, determinar la concentración de salicilato en la muestra desconocida.
PARTE B. SALICILATOS EN SUERO SANGUÍNEO (A VANZADO) E SCENA DEL CRIMEN Un oficial de policía observa un automóvil que se mueve erráticamente en una autopista, y, de hecho, observa que este cruza a otro carril, forzando que un auto salga del camino. El oficial detiene al conductor del vehículo, y este manifiesta que tiene un fuerte dolor de cabeza y ha tomado algunas aspirinas. El conductor tuvo dificultad para remover la tapa de una botella de agua mientras conducía y esto ha causado el manejo errático. errático. No se encuentra ningún ningún empaque para aspirinas, y el conductor indica que ya lo ha desechado. La persona niega estar bajo la influencia de alcohol u otras drogas. Es llevado a un hospital, donde voluntariamente provee una muestra de sangre para un test de alcohol y drogas. Ahora le es entregada una pequeña muestra de suero sanguíneo para examinar la presencia y/o concentración de aspirina en la misma. Realizar el siguiente procedimiento en duplicado. (Deberá efectuar el procedimiento dos veces, tanto a la muestra desconocida como al estándar de 5.0 mg/dl). 1. 2. 3. 4.
Etiquetar dos cubetas para la muestra desconocida y dos para el estándar de 5.0 ml/dl. En cada caso, una de las cubetas será etiquetada como “Test” y la otra como “Blanco”.
Pipetear 2.0 ml de agua destilada en cada cubeta. Pipetear 0.2 ml de suero en las cubetas para la muestra desconocida. 4
5. 6. 7. 8.
Pipetear 0.2 ml de estándar de 5.0 mg/dl en las cubetas para estándar. En las cubetas de etiquetadas como Blanco, pipetear 2.0 ml de ácido nítrico 0.039 M. En las cubetas etiquetadas como Test, pipetear 2.0 2 .0 ml de la solución diluida de nitrato de hierro. Agitar todas las cubetas para mezclar su contenido. La Tabla 2 enumera cada cubeta y sus contenidos. 9. Dejar reposar los mismos por 5 minutos. 10. Seguir las instrucciones en la Parte A de este experimento para obtener una lectura para cada cubeta. Registrar la absorbancia leída en la hoja de cálculos. Tabla No. 1.1.- Preparación de Estándares de Ácido Salicílico Estándar 5.0 mg/dl
Agua Destilada Destilada
Nitrato Diluido
de
Hierro
Ácido Nítrico 0.039 M
Cubeta 1: Blanco
0.0
1.0
0.0
1.0
Cubeta 2
0.1
0.9
1.0
0.0
Cubeta 3
0.3
0.7
1.0
0.0
Cubeta 4
0.5
0.5
1.0
0.0
Cubeta 5
0.7
0.3
1.0
0.0
Cubeta 6
1.0
0.0
1.0
0.0
9. LIMPIEZA Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Deseche los residuos en el recipiente destinado para el efecto (INORGANICOS EN UN RECIPIENTE Y BIOLOGICOS EN OTRO).
10.
DATOS Y OBSERVACIONES
PARTE A: Indique como POSITIVO si encontró presencia de salicilatos en la muestra y NEGATIVO si no hubo presencia.
PARTE B. ESPECTROFOTOMETRÍA BÁSICA Cubeta
Concentración de Salicilato (mg/dl)
Absorbancia
1 2 3 4 5 6 11. 12. Absorbancia de muestra desconocida: _____________±________ _____________±________ 13. Concentración de muestra desconocida: ______________±_______ (mg/dl) 14.
PARTE C. SALICILATOS EN SUERO SANGUÍNEO (A VANZADO ) 5
Estándar de 5.0 mg/ml Estándar (Blanco) Estándar 5.0 mg/ml Desconocida (Blanco) Desconocida
15.
Absorbancia (primera corrida)
Absorbancia (segunda corrida)
ANÁLISIS Y CONCLUSIONES
CÁLCULOS a.
Usar la siguiente relación para determinar la concentración de salicilato en la muestra desconocida:
b.
16.
Calcular cada muestra desconocida de forma separada, y promediar el resultado. Si los resultados individuales no se acercan en por lo menos 2 a 3 mg/dl, repetir el análisis una tercera y cuarta vez. Calcular y comparar los resultados con los obtenidos anteriormente. Promediar los resultados que se acercan en 2 a 3 mg/dl entre sí.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1]. Gisbert Calabuig J.A, Gisbert Grifo MS. Intoxicaciones por medicamentos. En: Gisbert Calabuig JA, editor. Medicina Legal y toxicología. 5ª edición. Barcelona: Masson, S.A; 1998.p.793-805. [2]. English M, Marsh V, Amukoye E, et al. Intoxicación crónica por salicilatos y malaria grave. The Lancet (ed. Española) 1996; 29(5):46-8.
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PRÁCTICA 2: ANÁLISIS DE ALCOHOL ETÍLICO EN SANGRE POR MICRO DIFUSIÓN EFINICIÓN DEL PROBLEMA 1. DEFINICIÓN Una de las formas más má s utilizadas para determinar si una persona ha ingerido alcohol y que cantidad es la del análisis de contenido de alcohol en sangre (BAC). Cuando se consume alcohol, este se libera en el flujo sanguíneo. Dado a los altos índices de accidentes y delitos asociados al consumo de alcohol, el etanol es una sustancia buscada en la mayoría de las pruebas de alcohol en sangre. Según reportes médicos el 10% del etanol sale sale del cuerpo a través del sudor, la respiración y la orina. El resto debe ser metabolizado fuera del cuerpo a través del hígado. El tiempo que tarda el alcohol en dejar el flujo sanguíneo es directamente dependiente de la velocidad a la que el cuerpo puede metabolizar el alcohol. Por lo tanto una prueba de alcohol en sangre puede aportar evidencia de el responsable de algún delito.
2. OBJETIVOS Aplicar la técnica de micro difusión para determinar la presencia de alcohol en sangre.
3. MATERIALES Y EQUIPO Celdas de Conway 1 Destapador de viales 12 Micropipetas Perillas para micropipetas Masking tape Papel kraft para poner en las mesas Guantes Dicromato de potasio Agua destilada Nitrato de plata Ácido sulfúrico concentrado Reactivo de dicromato de potasio: Disolver 1 g de dicromato de potasio en 500 ml de agua. Agregar 0.1 g de nitrato de plata a la solución. Cuidadosamente agregar 500 ml de ácido sulfúrico concentrado. concentrado. Esta mezcla es estable por al menos un año si se protege de la luz y la humedad. Para su uso, es conveniente dispensarlo en frasco gotero de una onza.
4. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD Previamente debe revisar los aspectos importantes de precaución en las hojas de seguridad de los reactivos a utilizar. Prepare los reactivos en la campana de extracción de gases. Utilice bata, guantes guantes de nitrilo y lentes de seguridad.
5. ANTECEDENTES
7
Las determinaciones analíticas de alcohol etílico se basan en su volatilidad y su potencial de reducción. Ambas propiedades se utilizan en este procedimiento, en el que se utilizan celdas de Conway con reactivo de dicromato de potasio. potasio. Si el etanol (o alguna alguna otra sustancia volátil, reductora) reductora) está presente, se difundirá en el interior de las celdas y reaccionará con el reactivo de dicromato de potasio, cambiando su coloración. Este método es utilizado como un tamizaje en el que se logra identificar las posibles muestras positivas para etanol. Una vez obtenido un resultado positivo –es decir cambio en la coloración del reactivo de dicromato de potasio-, debe confirmarse por medio de una metodología cuantitativa, siendo de elección, la cromatografía de gases con detector de llama. No debe olvidarse que las muestras para alcoholemia deben ser preservadas con fluoruro de sodio y el envase deberá ser lo más adecuado en cuanto a volumen de la muestra.
6. PRE -LABORATORIO Contestar las siguientes preguntas: ¿En qué tipo de envase envase se deben colocar las muestras de sangre? ¿Con un ensayo de este tipo es posible llevar a un sospechoso a prisión?
7. PROCEDIMIENTO 1. 2. 3.
Cubra el fondo del anillo externo de la celda de Conway con sangre u orina, colocándola directamente desde el envase. Agregue unas cuantas gotas de dicromato de potasio al centro de la celda de Conway. Coloque la cubierta a la celda de Conway y deje estar a temperatura ambiente.
INTERPRETACIÓN: El reactivo cambiará de color entre 15 minutos y una hora si el etanol u otra sustancia reductora volátil esta presente. El cambio de color que se presenta presenta va de amarillo a verde o azul. Un cambio visible se ha observado en menos de una hora, cuando se ha colocado 1 ml de sangre conteniendo 200 ug de metanol, etanol o isopropanol, reaccionando con 0.3 ml del reactivo de dicromato de potasio. El reactivo en dos horas se torna azul. Este método NO es específico para etanol.
8. LIMPIEZA Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Debe desechar los reactivos inorgánicos por separado de los organicos, habrá un recipiente rotulado para el efecto.
9. DATOS Y OBSERVACIONES Reporte los resultados obtenidos con las muestras analizadas.
10.
ANÁLISIS Y CONCLUSIONES
Concluya sobre la metodología de análisis y su uso en investigación forense.
8
11.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1]. Conway, Edward J. (1962) Microdifusion Mic rodifusion Analysis And Volumetric Error. Crosby Lockwood & Son LT. London. [2]. Walllace Hayes A. (2001). Principles and Methods of Toxicology. 4th edición. Ed:Taylor & Francis. USA.
PRÁCTICA 3: DETECCIÓN DE ALCOHOL EN EL ALIENTO MEDIANTE EL USO DEL ALCOHOLÍMETRO PORTÁTIL EFINICIÓN DEL PROBLEMA 1. DEFINICIÓN Cada año, miles de motoristas deben ser examinados para determinar si se encontraban operando un vehículo o no bajo la influencia del alcohol. El método más exacto implica el uso de cromatografía gaslíquido para la medición del alcohol directamente en la sangre. Sin embargo, siempre existe el problema de una posible violación de los derechos de la persona para la obtención.
2. OBJETIVOS Realizar mediciones para detectar algohol en sangre a través de un alcoholímetro portátil.
3. MATERIALES Y EQUIPO EQUIPO 1 Medidor de ampolla • 1 Bulbo atomizador • 1 Breathalyzer o equipo similar • 1 Tubo para burbujeo • 1 Par de lentes de seguridad • 1 Boquilla REACTIVOS • 2 Ampollas de prueba del Breathalyzer o equipo similar • Líquido de enjuague con contenido de alcohol •
4. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD Debe utilizar guantes, bata y lentes de seguridad durante la practica.
5. ANTECEDENTES Una forma más popular para llevar a cabo el análisis consiste en la captura del aliento de la persona para determinar su contenido de alcohol. Dos de los procedimientos más frecuentemente administrados son mediante la utilización del alcoholímetro portátil. Básicamente, ambos hacen uso del hecho de que el ratio de alcohol en la sangre al alcohol en el aire en los alveolos es de aproximadamente 2100:1. El alcoholímetro portátil está diseñado para capturar el aliento alveolar alveolar y medir el contenido de alcohol mediante la reacción 9
con una solución de dicromato de potasio, que resulta en una solución azul, la cual es posteriormente analizada mediante un espectrofotómetro de rango visible.
PARTE A. EL ALCOHOLÍMETRO ALCOHOLÍMETRO PORTÁTIL (E L BREATHALYZER) La Figura No. 1 presenta el alcoholímetro portátil Breathalyzer Modelo 900-A. La Figura No. 2 muestra un diagrama esquemático de los componentes más importantes del instrumento.
Figura No. 1.1 .- Breathalyzer Modelo 900-A
Figura No. 2.2 .- Diagrama Esquemático del Breathalyzer
La operación de este alcoholímetro portátil puede ser descrita en tres pasos. 1.
2.
Una muestra de aliento alveolar es recolectada. Se pide al sujeto que sople en el tubo del aparato. El aliento eleva un pistón hasta la parte superior de su recorrido, por sobre dos orificios de venteo. Cuando la persona deja de soplar, el pistón pistón regresa a su posición predeterminada, predeterminada, atrapando una porción del aliento, y cubre los agujeros de venteo. La cantidad de aliento capturado es de 56.5 ml. La muestra de aliento capturado es pasado a una ampolla de test que consiste de dicromato de potasio, agua y ácido sulfúrico. Después de que la muestra de aliento ha sido burbujeada en la ampolla de test, se permite que transcurran 90 segundos para completar la oxidación de cualquier alcohol que haya estado presente en la muestra. La siguiente ecuación describe la reacción química que toma lugar en la ampolla:
10
El dicromato de potasio que no ha reaccionado (color naranja) y el sulfato de cromo (de color verde) se mezclan y forman una solución de color azul. 3.
Se mide la cantidad de dicromato de potasio requerida para oxidar el alcohol presente en la muestra. Esto es llevado a cabo utilizando un circuito eléctrico balanceado con dos celdas fotoeléctricas –una montada detrás de la ampolla de prueba y la otra detrás de una ampolla estándar. Una fuente de luz es localizada en un rack movible entre las dos ampollas. Antes de que el aliento del sujeto ingrese la ampolla de prueba, la fuente de luz es posicionada entre las dos ampollas de forma que la misma cantidad de luz pase a través de las mismas. Cuando esta posición es alcanzada, el instrumento presenta una lectura de cero. Después de que el aliento del individuo reacciona con el contenido de la ampolla de prueba, la fuente de luz se mueve hasta que el medidor del instrumento regrese a una medida de cero. La distancia que ha recorrido el bulbo de luz es indicada en otro lector, que es calibrado en unidades de forma tal que indique directamente el porcentaje de alcohol en la sangre.
ESCENA DEL CRIMEN Un hombre que conduce un vehículo motor de forma descuidada es detenido por un oficial que sospecha que esta persona maneja bajo la influencia del alcohol. Después de que el conductor falla las pruebas de balance y coordinación, es administrado un test con el alcoholímetro portátil anteriormente descrito, el cual también falla. Algunas semanas después, el conductor se declara como no culpable en la corte. Su defensa se basa en que el alcoholímetro ha devuelto una lectura anormalmente elevada debido a que anterior a la prueba había utilizado un enjuague bucal que contenía alcohol. El oficial que ha efectuado el arresto contesta que han transcurrido 90 minutos entre el momento del arresto y el momento en que se ha administrado el test. Durante este tiempo, no se ha observado observado nada que ingrese en la boca del sospechoso. sospechoso. El oficial indica que este tiempo es más que suficiente para que cualquier residuo de enjuague bucal presente en la boca se disipe. Para determinar quién dice la verdad, se le solicitará que enjuague su boca con un líquido con alcohol. No lo ingiera. A intervalos de 5, 10, 15 y 20 minutos, realizará pruebas a su aliento utilizando el alcoholímetro portátil.
6. PRE -LABORATORIO Conteste las siguientes preguntas: 1. 2.
Es el alcoholímetro un equipo confiable? Cuál es el margen de error? Que requisitos debe llenar un equipo portátil para que sus mediciones sean a ceptadas?
7. PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO 1.
Encender el switch del Breathalyzer a la posición de “on” y esperar a que el termómetro muestre
una lectura de 50 ± 3°C. Esta temperatura indica que la cámara de la muestra y los tubos conductores para el aliento se encuentran a una temperatura mayor a la del cuerpo. Esto previene que se condense humedad del aliento.
11
2.
3. 4.
5.
6.
7.
8. 9.
Medir dos ampollas selladas con el medidor provisto en el a parato. Cuando la ampolla se encuentra en el medidor, el fondo del menisco debe encontrarse al nivel del tope del medidor, o ligeramente sobre el mismo. Remover la ampolla del medidor. Colocar una ampolla sellada en el compartimento izquierdo del instrumento. Romper el sello de la otra ampolla, colocarla en el compartimento derecho del instrumento. Conectar el tubo que inyecta el gas en la ampolla a la toma de gas externa del instrumento, de caucho. Insertar el tubo en la ampolla. Con el selector en la posición de “toma”, bombear aire en el tubo de muestra con un bulbo
atomizador por un espacio de 10 segundos. Durante este tiempo, la luz verde se encenderá, indicando que la cámara se encuentra llena. Encender el selector a la posici ón de “analizar”. Este aire pasará de la cámara y será inyectado a la ampolla de prueba. La luz verde se apagará cuando el pistón deje la parte superior de su recorrido. Al fondo del mismo, un contacto eléctrico se llevará a cabo y una luz roja se encenderá. Esto debería tomar unos 25 a 35 segundos, aunque el tiempo no resulta una variable crítica. Noventa segundos después de que la luz roja desaparezca, una lámpara verde que indica “lectura”
se encenderá. En este momento, encender la fuente de luz, y mover el nodo de balance al lado derecho del panel hasta que el puntero del medidor nulo se encuentre en la línea del centro. Establecer el medidor de escala en la posición de cero. En el Breathalyzer modelo 900, el nodo del puntero debe ser jalado hacia el operador para ser liberado. Insertar la boquilla en el tubo plástico de muestra. Esta es una medida precautoria para mantener la saliva u otros líquidos fuera del instrumento; sin esta medida, el pistón podría tornarse pegajoso y dar una medida baja.
10. Tornar el selector a la posición de “tomar”, y soplar en la boquilla. No es necesario que se respire profundamente, pero el sujeto debe vaciar sus pulmones tanto como sea posible al dar la muestra. 11. Repetir el paso 6. 12. Después de una pausa de 90 segundos a partir del momento en que la luz roja se encienda, ajustar el nodo de balance mientras que la luz fuente se encuentre encendida hasta que la aguja del medidor nulo se encuentre centrada. El puntero mostrará el porcentaje de alcohol en la sangre. Registrar la lectura. 13. Repetir los pasos 4 al 11, de manera que se sople en el Breathalyzer aproximadamente 5, 10, 15 y 20 minutos después de enjuagar la boca con alcohol. La misma ampolla de prueba puede ser utilizada para cada prueba. 14. Registrar en qué momento el alcohol ya no es detectable en el aliento.
PARTE B. EL INTOXILYZER Existen diversos modelos del Intoxilyzer. Todos de basan en la absorción de la radiación infrarroja del alcohol en el aliento del sospechoso. Figura 3 El Intoxilyzer mide el contenido de etanol en el aliento de una persona, basado en espectroscopia de absorción infrarroja. En el presente, filtros de interferencia aíslan tres longitudes de onda, a 3.39, 3.48 y 3.80 para medir el etanol y corregir por presencia de acetona y agua. Originalmente era considerado, que aunque docenas de compuestos orgánicos han sido detectados en el aliento humano, la cantidad total de los mismos era insignificante en comparación con la presencia del etanol después de que una persona ha consumido una bebida alcohólica. Sin embargo, posteriormente se encontró que si una persona es diabética, puede encontrarse presente un exceso de acetona lo que produce 12
una lectura de a 3.48 que en presencia presencia solamente de etanol. etanol. El Intoxilyzer mide la frecuencia de tensión asimétrica a 3.39 del grupo metilo, así como a la frecuencia de tensión asimétrica de 3.48 micrómetros. Un ratio de la intensidad de las dos frecuencias es utilizado para determinar si se está midiendo únicamente etanol. Este ratio es ajustado a cerca de 1.0. El agua tiene una fuerte banda simétrica de tensión del grupo a 2.74 adjacente a las bandas , que se traslapa levemente con las frecuencias del grupo metilo. Inicialmente se supuso que este fenómeno no creaba interferencia puesto que el aliento de una persona se encuentra saturado de agua, y se asumió que el hombro de absorción sería constante. Sin embargo, se ha encontrado que este no es siempre el caso, por lo que un tercer filtro fue adicionado para su corrección, a 3.80 La Figura 3 muestra el espectro de transmisión infrarroja de etanol, acetona y agua a gua como se muestra en la patente del instrumento.
ESCENA DEL CRIMEN Alrededor de las 11:30 p.m., una camionetilla, desplazándose a gran velocidad en un camino de doble vía, pasa una patrulla estacionada. El policía inicia a seguir el vehículo y nota que el automóvil parece cruzar lo que juzga debería ser la división al centro del camino (no se encuentra marcada la línea) en diversas ocasiones. El conductor detiene su carro y se baja. El viento es bastante fuerte, lo que pudo dificultar el descenso del piloto, pero el oficial decide aplicar una prueba de estado de ebriedad a la persona de cualquier forma. El conductor falla la prueba y es llevado a la estación. La prueba que se ha efectuado es una de coordinación, grabada en video, y a continuación le será aplicada una prueba con el Intoxilyzer. Su trabajo es aplicar dicha prueba.
PROCEDIMIENTO Nota: el procedimiento de esta sección es específico para el modelo Intoxilyzer 5000. Puesto que no se puede permitir que un estudiante consuma alcohol previo a efectuar la prueba, se le pedirá que utilice un enjuague con contenido de alcohol, para posteriormente efectuar la prueba. El modelo 5000 detectará que no se trata de alcohol presente en los pulmones en base a su desaparición rápida, y así lo indicará. Sin embargo, este procedimiento permitirá demostrar la operación básica del aparato. Esta es una prueba típica de blanco (aliento-aire blanco). Como se verá, esta prueba es bastante sencilla de llevar a cabo. Lectura 1. “Listo para Iniciar” 2.
“Insertar Tarjeta”
3. 4.
“Blanco de Aire” “Tiempo ##HR ##MIN” “Fecha MM/DD/YY” “Blanco de Aire .000” “>…” “Por favor, soplar
5. 6. 7. 8.
en la boquilla hasta
Significado Insertar una nueva boquilla al final del tubo para soplar. Para inicial la prueba, oprimir el botón de inicio en cualquier c ualquier momento. Insertar una tarjeta de evidencia en la ranura para tarjeta (parpadeante) localizada en el panel frontal del instrumento. Asegurarse de insertar la carta con la cara superior hacia arriba y con e l borde que lee “in”, de acuerdo a las instrucciones impresas en la tarjeta.
Solicitar al sujeto que sople en la boquilla hasta que el tono se detenga; el sujeto tiene tres minutos para proveer una muestra de aliento adecuada. 13
que se detenga el tono; por favor 9.
soplar” “Por favor soplar .###” Seguido de “Por favor soplar 0.###”
De manera que una muestra de aliento adecuada sea provista, el sujeto debe soplar por un mínimo de 4 segundos. Mientras que el sujeto sopla en la boquilla, el instrumento hace sonar un tono continuo y despliega un mensaje en su parte izquierda: “Por favor soplar .###” El número de tres (u opcionalmen te dos) dígitos es la concentración medida de alcohol del sujeto medida como porcentaje peso/volumen. El tono continuo indica que el sujeto está soplando con suficiente presión. Cuando el cero aparece antes del valor BAC (0.###), el sujeto ha provisto una muestra de aliento adecuada. No instruya al individuo, sin embargo, a que deje de soplar al aparecer el 0. Si se muestra S5 como “apagado” durante la prueba, el instrumento no mostrará el valor de la
concentración de alcohol en la sangre hasta que el sujeto termine de soplar, habiendo provisto una muestra adecuada de aliento. El instrumento no mostrará tampoco el 0 indicando que dicha muestra es adecuada. Si el sujeto deja de soplar antes de probar una muestra suficiente, se mostrará la señal de “Por favor soplar” y se escuchará un tono cada 5 segundos. Si esto
ocurre, pedir al sujeto que sople en la boquilla hasta que el tono se detenga. En el evento de que el sujeto falle en proporcionar una muestra adecuada dentro de un espacio de 3 minutos, se mostrará e l mensaje de “Muestra Deficiente”, acompañado por un tono bajo -alto que suena intermitentemente por cinco segundos. A continuación, el instrumento desplegará “Prueba Sujeto .###” (el BAC más alto alcanzable de las muestras de aliento) y completará la
secuencia. En la tarjeta de evidencia, el instrumento indica el BAC más alto alcanzable imprimiendo un asterisco (*) antes del mensaje “Prueba Sujeto .###”. El asterisco es una referencia al mensaje impreso al final de la tarjeta de evidencia: “Muestra deficien te- valor impreso es el más alto obtenido”.
10. “Prueba
a sujeto .###” 11. “Blanco de Aire .###” 12. “Prueba Completada” 13. “Listo para Iniciar”
Remover tarjeta de evidencia después de que esta es liberada por el instrumento.
8. LIMPIEZA Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Disponga de las boquillas del alcoholímetro en un recipiente para desinfectar y tratar en autoclave.
9. DATOS Y OBSERVACIONES Reporte los resultados obtenidos en función de los valores indicados en el alcoholímetro.
10.
ANÁLISIS Y CONCLUSIONES
Analice los resultados y concluya.
11.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 14
[1]. Borkenstein, R. F., Smith, H. W. The Breathalyzer and its Applications. Medicine, Science and the Law. 2 (1962) pp. 13 a 22.Apellido, Nombre (Año). [2]. Draeger Hispania. Manual de análisis de alcohol en el aire respirado. 2000. Madrid.
15
PRÁCTICA 4: PRÁCTICA 3: ANÁLISIS DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS 1. DEFINICIÓN EFINICIÓN DEL PROBLEMA La frecuencia con que se lee en los periódicos sobre casos graves de intoxicación o sobre muerte de personas o familias enteras por causa de ingestión de una “sustancia desconocida” ilustra la necesidad de
orientar a la población en general y en particular a los usuarios de los insecticidas, ya que el descuido en el almacenamiento, manejo y aplicación de plaguicidas resulta altamente peligroso. Todo plaguicida tiene cierto grado de toxicidad toxicidad para los humanos. Los efectos químicos que pueden matar otras formas de vida son desde perjudiciales para la salud hasta letales. Los insecticidas ingresan ingresan al organismo por vía digestiva, respiratoria o dérmica.
2. OBJETIVOS Observar la presencia de insecticidas en diferentes muestras de alimentos.
3. MATERIALES Y EQUIPO 4 Beakers de 25 ml 4 Beakers de 100 ml Papel Filtro Embudos pequeños Estufa de plato Micropipetas o capilares sin heparina Cromatoplacas de Silica gel Pipetas de 5 ml Perillas succionadoras para pipetas Frascos para correr las placas Asperjador o en su defecto frasco spray o gotero Guantes Masking Tape N-Hexano Acetona 25 ml de solución débilmente clorhídrica de cloruro de paladio al 0.5% (revelador) Muestra de maíz
4. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD Antes de la práctica consulte las Hojas de Seguridad de cada uno de los reactivos a manipular, utilice la campana de extracción de gases. Utilice guantes de nitrilo, bata y lentes de seguridad durante toda la práctica.
5. ANTECEDENTES
16
Los insecticidas pertenecen a un grupo de sustancias denominadas plaguicidas, los cuales son sustancias o mezclas de sustancias destinadas para prevenir o controlar toda especie indeseable de plantas y animales (plagas). El término plaguicida abarca además, cualquier sustancia que se emplea para combatir plagas durante la producción, almacenamiento, transporte, comercialización o elaboración de alimento para el hombre y los animales o se administre a estos últimos para combatir insectos o arácnidos que se encuentren dentro o sobre su cuerpo. Entre los plaguicidas más importantes se encuentran encuentran los insecticidas organofosforados. organofosforados. Su mecanismo de acción consiste en ejercer su acción tóxica al combinarse con colinesterasas, inhibiendo a la acetilcolinesterasa eritrocítaria y de los tejidos nerviosos. Algunos insecticidas Organofosforados:
Paratión (Tamarón) Etilparatión (Folidol) Metilparatión Malatión
6. PRE -LABORATORIO Contestar las siguientes preguntas: 1) 2) 3) 4)
Cuáles son los plaguicidas que más casos de intoxicación provocan en Guatemala? El plaguicida identificado en la práctica de hoy, ¿a qué grupo de plaguicidas pertenece? Investigue cuáles son los signos y síntomas más característicos de este tipo de de intoxicaciones. No olvide incluir referencias. El análisis de cromatografía en capa fina desarrollado en la práctica ¿es un análisis cualitativo o cuantitativo? ¿Por qué?
7. PROCEDIMIENTO Extracción de plaguicidas organofosforados: 1. 2. 3.
Macerar 20 g de muestra, previamente disgregados o molidos, con n-Hexano durante 24 horas. Filtrar la solución y evaporar el solvente a sequedad. Disolver el residuo en n-Hexano y sembrar en una cromatoplaca cubiertas con sílicagel.
Investigación de organofosforados (CCF) a.
Método: Baumler y Ripptein Eluentes n-Hexano:acetona (4:2) Revelador solución débilmente clorhídrica de cloruro de paladio al 0.5%
b.
Procedimiento: Activar las cromatoplacas a 105°C por 5 – 10 min. 17
Sembrar con una pipeta pipeta Pasteur en la cromatoplaca, la solución a investigar investigar y la solución patrón. patrón. Dejar secar. Eluir con el solvente (n-hexano:acetona) Asperjar la placa con el revelador
8. LIMPIEZA Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Deseche los residuos inorgánicos en el recipiente que se le i ndique.
9. DATOS Y OBSERVACIONES Reporte los resultados obtenidos.
10.
ANÁLISIS Y CONCLUSIONES
Comparando los valores de Rf obtenidos con respecto a los de los patrones, puede identificarse el insecticida presente. Sin embargo, es necesario aclarar que esto es un test test presuntivo, por lo que debe realizarse una prueba confirmativa.
11.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1]. M. Calonge, Y. Pérez Pertejo, C. Ordóñez, RM. Reguera, R. Balaña Fouce, D. Ordóñez. Determinación de residuos de siete insecticidas organofosforados en rutas mediante cromatografía de gases con detector de nitrógenofósforo y confirmación por espectrometría de masas Revista de Toxicología, vol. 19, núm. 2, cuatrimestral, 2002, pp. 55 -60. [2]. Lu FC (1995) A review of the acceptable daily intakes of pesticides assessed by the World Health Organization. Regul. Toxicol. Pharmacol. 21: 351-364.
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PRÁCTICA 5: TEST CUALITATIVO DE MARIHUANA EFINICIÓN DEL PROBLEMA 1. DEFINICIÓN La marihuana y el hachís, junto a otras sustancias relacionadas, pertenece a la clase de sustancias denominadas cannabis. En años recientes, el consumo de marihuana por jóvenes en Norte América ha alcanzado proporciones epidémicas. El interés público en los efectos de largo y corto plazo de la droga se ha vuelto intenso. En 1964, el principal componente activo, el Tetrahidrocannabinol (THC) ha sido aislado y se ha determinado su estructura. La fórmula estructural del componente es:
2. OBJETIVOS Evaluar la presencia de marihuana y sus derivados derivados en muestras especificas especificas mediante test de DuquenoisNegm.
3. MATERIALES Y EQUIPO EQUIPO 16 botellas de rosca, tapas de rosca, 2 onzas; 1 cepillo para tubo de ensayo; 6 tapones de corcho para los tubos de ensayo; 1 probeta graduada de 10 ml; 1 par de lentes de seguridad; 1 microscopio estereoscópico; 1 mortero y pistilo, pequeño; 1 gradilla para tubos de ensayo; 6 varillas de agitación de vidrio 6 tubos de ensayo de 15 cm. REACTIVOS Cloroformo Ácido Clorhídrico concentrado (HCl) Café, diversas marcas Orégano Hierba gatera Tabaco de cigarros, cigarrillos y de pipa. Reactivo de Duquenois (debe ser preparado) 19
Hojas o flores de marihuana. Preparación del Reactivo de Duquenois: Mezclar 50 ml de etanol absoluto, 1 gramo de Vanilina y 12 gotas de acetaldehído (fresco). Almacenar en un refrigerador por un máximo de 3 a 4 días.
4. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD Previo a la práctica debe revisar las hojas de seguridad seguridad de cada uno de los productos a utilizar. Debe utilizar bata, guantes de nitrilo y lentes de seguridad durante toda la práctica.
5. ANTECEDENTES Uno de los tests cualitativos más ampliamente utilizados para la identificación de la marihuana es el test de Duquenois-Negm, desarrollado en 1938. Éste test presenta un color púrpura como indicativo de la presencia de marihuana. La prueba carece de especificidad, sin embargo, puesto que otras sustancias pueden también producir el color púrpura al ser analizadas con el mismo test. La modificación de Levine del test de Duquenois-Negm le hace bastante más específico. En el procedimiento modificado, solamente el color púrpura debido a la presencia de marihuana es extraído con cloroformo. La marihuana es una de las pocas sustancias que presenta esta extracción de color, y en esta forma, la versión modificada del test Duquenois ha sido utilizada oficialmente desde 1941. ESCENA DEL CRIMEN El conductor de un vehículo está involucrado en un accidente de tráfico resulta lesionado y es trasladado a un hospital. Sus posesiones personales han sido removidas de su ropa, dentro de las cuales se ha encontrado una pipa. EL oficial en la escena del accidente ha detectado lo que él pensó era el olor del humo de marihuana en el carro de la persona accidentada. La pipa le ha sido enviada a su laboratorio de criminalística, donde se ha obtenido una muestra del interior de la pipa y el test de Duquenois-Levine será ahora aplicado. En el área encontrará el material extraído de la pipa etiquetado como Muestra A. LA Muestra B es tabaco de pipa. La Muestra C esta constituida de hojas molidas pertenecientes a una pipa, del que se conoce que no es marihuana. Deberá realizar el test Duquenois modificado en las tres muestras. Esto le permitirá comparar el resultado entre el tabaco, una hierba desconocida y el material sospechoso. Efectúe cuidadosamente las pruebas, puesto que los resultados serán tomados como evidencia en una situación real.
6. PRE -LABORATORIO Contestar las siguientes preguntas: Cuales métodos existen para el análisis forense de drogas? Describa e indique las ventajas y desventajas.
7. PROCEDIMIENTO PARTE A. MARIHUANA , HIERBAS Y TABACO 1. 2.
Obtener una muestra muestra del material que se sospecha es marihuana. Obtener una muestra de tabaco y de la planta que se conoce que no es marihuana.
20
3.
Moler las hojas y colocar cada muestra por separado en un tubo de ensayo de 15 cm. Se debe colocar aproximadamente 1 cm de muestra de material en cada tubo de ensayo. 4. Añadir 2 ml del reactivo de Duquenois a cada tubo de ensayo, mezclar para extraer el residuo. 5. Añadir 2 ml de ácido hidroclórico, mezclar, y dejar reposar por 10 minutos. 6. Observar y registrar el cambio de color de la solución en cada tubo de ensayo en el lugar adecuado en la hoja de datos originales. 7. Añadir 2 ml de cloroformo a cada tubo de ensayo, agitar para mezclar el contenido. 8. Colocar los tubos de ensayo en la gradilla, y permitirlos reposar hasta que los líquidos se separen. Anotar el color de la capa de cloroformo. Un color púrpura es un resultado positivo para el test en presencia de marihuana. 9. Registrar todas las observaciones en la hoja de datos originales. 10. Lavar la cristalería, regresarla a su lugar de almacenamiento. 11. Completar la hoja de cálculos y responder a las preguntas. Entregar estos resultados al instructor de laboratorio.
PARTE B. POSIBLE INTERFERENCIA DE CAFÉ Ha sido reportado que algunas clases de café devuelven un resultado positivo con el test modificado de Duquenois de marihuana. Específicamente, las marcas Eight o’CLock , Bokar , y Red Circle han sido reportadas en este caso. 1. 2. 3.
Obtener pequeñas muestras de diferentes tipos de café, apropiadamente etiquetados e identificados. Realizar el test de Duquenois en casa muestra, reportar los resultados. En caso de obtener algún resultado positivo, repetir el test para dicha muestra.
PARTE C. IDENTIFICACIÓN CON MICROSCOPIO La identificación de la marihuana depende en buena medida de la identificación de sus características botánicas. LA marihuana se caracteriza por la presencia de pelos cistolíticos en uno de los lados de la hoja. Estos pelos son pequeños en longitud y tienen apariencia de garra de oso o de espinas. Confirmación adicional de la presencia de la marihuana se obtiene a través de la identificación de pelos no-glandulares de mayor tamaño en el lado opuesto del fragmento de la hoja. En este experimento, 10 mezclas de vegetación desconocida han sido preparadas en el laboratorio. Colocar cada una de ellas en el microscopio estereoscópico y examinar cada espécimen por la presencia o ausencia de marihuana. Las muestras contienen marihuana, orégano, hierba gatuna, o alguna mezcla de ellas. Registrar los resultados.
8. LIMPIEZA Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Deseche los materiales utilizados en el recipiente indicado para el efecto, no deseche nada en la basura, excepto papel.
9. DATOS Y OBSERVACIONES Elabore una tabla indicando los resultados de las pruebas (positivas o negativas)
10.
ANÁLISIS Y CONCLUSIONES 21
Indique la confiabilidad del método utilizado y su uso en análisis forense.
11.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1]. Hughes, R.; Warner, V. A study of “false positives” in the chemical identification of marihuana –drug enforcement administration laboratory notes. Microgram, Vol. IX, No. 7, July, 1976. [2]. Pitt, C.G.; Hemdron, R.W.; Hsia, R.S. The specificity of the duquenois color test for Marijuana and Hashish. J. Forensic Sci., 1972, 17(4), 693-700.
22
PRÁCTICA 6: ANÁLISIS DE DROGAS – TEST SPOT PARA CASOS GENERALES 1.
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Cuando se trae al laboratorio una muestra que se sospecha es una droga, una serie de pruebas spot son realizadas en primera instancia para identificar la posible presencia de drogas y, en caso afirmativo, de qué clase general es dicha sustancia. Diversas drogas formadoras de hábito pueden ser obtenidas en dosis suficientemente pequeñas para no ser dañinas, y sin embargo encontrarse en concentración suficiente para dar positivo en el test adecuado 2.
OBJETIVOS
Utilizar diferentes tipos de pruebas “spot” para la identificar la presencia de drogas.
3.
MATERIALES Y EQUIPO
Equipo 1 Beaker de 50 ml 1 Beaker de 250 ml 8 Frascos con gotero 1 par de Lentes de seguridad 1 Mortero y pistilo, pequeño 4 Placas con hendiduras, 3 por 4 1 Gradilla para frascos con gotero 6 Varillas de agitación de vidrio de 10 cm 3 Espátulas Guantes desechables
Reactivos Hidróxido de potasio en etanol: 5 g de KOH disueltos en 100 ml de EtOH Cloroformo Acetato de cobalto: 0.1 g de Co(OAc)_2 ∙4H_2 O en 100 ml de metanol metanol seco, más 0.2 ml de ácido acético
glacial. Tiocianato de cobalto: 2 g/100 ml de H_2 O p-Dimetilaminobenzaldehído: 2 g en 50 ml de etanol al 95% y 50 ml de ácido hidroclórico concentrado. Muestra estándar de las drogas a testear. Isopropilamina: 5 ml más 95 ml de metanol seco. Reactivo de Marquis: 8-10 gotas de formaldehido al 40% agregados a 10 ml de H_2 SO_4; reactivo decae con el tiempo. Reactivo de Mecke: 0.25 g de H_2 SeO_3 en 25 ml de H_2 SO_4. Cloruro de estaño: 5 g de SnCl_2 en 10 ml de HCl, diluir a 100 ml con agua. 4.
CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD
23
Consulte las hojas de seguridad seguridad para el manejo adecuado y disposición correcta de los reactivos, utilice bata, guantes de nitrilo y bata durante toda la práctica.
5.
ANTECEDENTES
Si una droga se encuentra presente y se desea una identificación definitiva, entonces se puede llevar a cabo un proceso de separación de capa fina, seguido de la obtención del espectro infrarrojo. Los tests spot más comúnmente efectuados son: Reactivo de Marquis: usualmente se torna violeta en la presencia de alcaloides de opio, tales como heroína, morfina y codeína. Las anfetaminas o estimulantes, tales como dextroanfetamina y metanfetamina, tornan el reactivo de Marquis en un color café-rojizo. Tiocianato de cobalto: para los alcaloides de coca, en particular la cocaína; se forma un precipitado azul escamoso. p-Dimetilaminobenzaldehído (p-DMAB): forma un color azul en presencia de LSD. Test de Duquenois: forma un color púrpura en presencia de marihuana (ver práctica anterior). Test de Dille-Koppanyi: utiliza acetato de cobalto e isopropilamina para testear presencia de barbitúricos. Un color rojo-violeta es formado por el ácido barbitúrico y sus derivados. Estos son sedantes. Ejemplos de ellos son el fenobarbital, secobarbital, amobarbital y el pentobarbital. Reactivo de Mecke: ácido selenioso en ácido sulfúrico; se trata de un test alternativo para los alcaloides de opio que devuelve una secuencia de cambios de color para cada alcaloide, tal como un color verde para la codeína. ESCENA DEL CRIMEN Tras la queja de un vecino, dos oficiales de policía llegan a una casa para calmar un disturbio. Lo que observan en el lugar les produce la sospecha de que se han utilizado drogas. Obtienen diversas muestras de un tazón de ponche en una mesa del cuarto y la traen al laboratorio. Su trabajo es entonces determinar si las muestras contienen drogas, y en caso positivo, de qué tipo. Primeramente se correrá el procedimiento sobre un conjunto de muestras conocidas, para posteriormente testear las muestras desconocidas a ser provistas por el instructor. 6.
PRE-LABORATORIO
Haga un diagrama de flujo de proceso para la identificación y análisis de drogas de acuerdo a las instrucciones en el procedimiento 7.
PROCEDIMIENTO
Las muestras que se le proporcionarán pueden ser preparadas de alguna de estas drogas, o bien pueden ser muestras reales. Su muestra desconocida puede contener cualquiera de las drogas listadas en la Tabla No. 1.
24
Primeramente, deberá realizar cada uno de los tests indicados, posteriormente realizará los exámenes sobre una o más muestras desconocidas. 1.
Obtener una o más placas con hendiduras, acomodarlas de manera que sea posible realizar las pruebas detalladas en la Figura No. 1. Se necesitará un total de 30 espacios en un arreglo de 6 x 5. 2. Obtener muestras conocidas del instructor de sustancias tales como: a. Alcaloides de opio – codeína b. LSD (si está disponible) c. Anfetaminas – dexedrina d. Alcaloides de coca – cocaína e. Barbitúricos – nembutol 3. Tratar cada una de las muestras como sigue: colocar unos pocos cristales o gotas de la muestra en cada una de las hendiduras de la placa (hendiduras 1 a 5 para los alcaloides de opio; 6 a 10 para los alcaloides de coca; 11 a 15 para LSD; etc.), como se muestra en la figura 1. 4. Añadir unas pocas gotas del reactivo de Marquis en la primera hendidura (1, 6, 11, 16, 21 y 26). Mezclar y observar los resultados. Registrar estos resultados en la hoja de datos originales. Un color violeta es considerado un resultado positivo para alcaloides naturales de opio. 5. En la segunda posición (2, 7, 12, 17, 22, 27), añadir 3 gotas de Tiocianato de cobalto, esperar unos pocos minutos. Si se forma un precipitado azul, añadir 3 gotas de cloruro de estaño y agitar. Este es un test para drogas del tipo de la cocaína. Registrar los resultados. La cocaína formará un precipitado no soluble en cloruro de estaño, mientras que la novocaína será soluble. 6. En la tercera posición (3, 8, 13, 18, 23, 28), añadir 15 a 20 gotas de agua si la muestra se encuentra en estado sólido. Añadir 10 gotas de la solución de p-DMAB. La formación de un color azul después de 10 a 20 minutos es un resultado positivo para la presencia de LSD. Registrar los resultados. 7. En la cuarta posición (4, 9, 14, 19, 24, 29) añadir 20 gotas de solución de acetato de cobalto y mezclar. Añadir después 10 gotas de solución de isopropilamina y mezclar. Un color rojo es característico de los barbitúricos. 8. En la quinta posición (5, 10, 15, 20, 25, 30) añadir 10 gotas del reactivo de Mecke. Este reactivo produce diferentes colores con cada droga, y usualmente el color cambia dos, tres o incluso cuatro veces durante la prueba. Observar cuidadosamente y registrar los cambios. Referirse a la Tabla No. 1. 9. Repetir todas las pruebas anteriores en la muestra de droga desconocida. Tomar una decisión, y registrarla en la hoja de datos. 10. Limpiar el equipo y almacenarlo en el lugar apropiado.
25
Figura No. 1.1.- Arreglo en la placa con hendiduras para las pruebas en general Reactivo de Marquis
p-DMAB
Reactivo de Mecke
Alcaloides Alcaloides de Opio
1
2
3
4
5
Alcaloides Alcaloides de Coca
6
7
8
9
1
LSD
1
1
1
1
1
Barbitúricos
1
1
1
1
2
Anfetaminas
2
2
2
2
2
.Tabla No. 1.No. 1.- Pruebas de Color para Drogas Selectas Droga Morfina Codeína Dihidrocodeína Narcotina Papaverina Heroína Cocaína
Reactivo de Marquis Violeta Rojo-violeta a azulvioleta Amarillo a naranja a café a violeta Violeta que se difumina Rosa a azul Violeta
Metadona LSD Nembutol Fenobarbital Seconal de Sodio D-anfetamina-SO4 Ácido acetilsalicílico
8.
Isopropilamina Acetato de Cobalto
Ácido Selenioso
p-DMAB
Verde a azul verdoso Amarillo a verde
Verde a azul Precipitado azul insoluble en SnCl2 Precipitado azul soluble en SnCl2
Novocaína Demerol
Tiocianato de Cobalto
Amarillo a verde oscuro Ningún color
Precipitado Precipitado azul
Rosa Azul Rojo-violeta Rojo-violeta Rojo-violeta
Rojo-naranja a café Rojo, transcurridos 15 minutos
LIMPIEZA Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS
Descarte los desechos en el recipiente indicado para el efecto. 9.
DATOS Y OBSERVACIONES
En una tabla reporte los resultados de las pruebas realizadas a las muestras que se le proporciono indicando si el resultado fue: POSITIVO, NEGATIVO o si existieron FAL SOS POSITIVOS O FALSOS NEGATIVOS. 10.
ANÁLISIS Y CONCLUSIONES
26
Concluya sobre la confiabilidad de los tests en el análisis forense y la posibilidad de procesar como resultado de la aplicación FALSOS POSITIVOS O FALSOS NEGATIVOS. 11.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1].
Drugs Working Group of the European Network of Forensic Science Institutes (ENFSI) and UNODC (2009), Guidelines for representative drug sampling, disponible en: www.unodc.org/unodc/en/scientists/guidelines-on-representative-drug-sampling.html).. www.unodc.org/unodc/en/scientists/guidelines-on-representative-drug-sampling.html)
[2].
Jackson, B.P. and Snowdon, D.W. (1968), Powdered Vegetable Drugs, J&A Churchill Ltd., London
27
PRÁCTICA 7: ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE MATERIALES QUE CONTIENEN COCAÍNA EFINICIÓN DEL PROBLEMA 1. DEFINICIÓN Cuando se trata de identificar una droga que ha sido confiscada y se presume que normalmente esta contenida en un material sospechoso, el análisis debe enfocarse en la determinación de al menos dos parámetros no correlacionados, de los cuales uno de ellos debería proporcionar información acerca de la estructura química de la sustancia analizada. En cualquier caso, al seleccionar los parámetros deberá tomarse la droga en cuestión y los recursos con los que cuenta el laboratorio para el análisis.
2. OBJETIVOS Utilizar un método de análisis cualitativo para muestras confiscadas con materiales sospechosos. Utilizar un método cuantitativo para la identificación de cocaína en muestras compuestas de materiales sospechosos.
3. MATERIALES Y EQUIPO Portaobjetos Varilla de agitación Ácido Clorhídrico Para el ensayo de Scott: a)
Reactivo 1: Disolver 1,0 g de tiocianato de cobalto en 50 ml de ácido acético al 10% (vol / vol), y añadir 50 ml de glicerina. b) Reactivo 2: Ácido clorhídrico (concentrado) c) Reactivo 3: Cloroformo
4. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD
Precaución 1
Precaución 2…
5. ANTECEDENTES Muestreo de sustancias sospechosas El objetivo es conseguir que un análisis quimico sea preciso., y ya que los métodos cualitativos o cuantitavios que usan los laboratorios forenses disponen de porciones de material muy pequeños, es importante que las porciones sean representativas representativas de la masa de la que han sido extraidas. El muestreo debe realizarse con
28
arreglo a los principios principios que determinan las farmacopeas. Tambien puede considerarse considerarse un método de muestreo descrito en: Guidelines on Representative Representative Drug Sampling (http://www.unodc.org/ unodc/en/scientists/publications_manuals.html). Si la sustancia incautada exhibe caracteristicas externas evidentes, es preferable utilizar el metodo de muestreo basado en el modelo de Bayes en lugar delmodelo hipoegeometrico. Ensayos presuntivos de determinación de cocaína Los ensayos presuntivos son son procedimientos rápidos diseñados diseñados para indicar la la presencia o ausencia de determinadas clases de drogas en la muestra y eliminar rápidamente las muestras negativas. Buenas técnicas técnicas de ensayo ensayo presuntivas aumentan aumentan la probabilidad de obtener un resultado “verdadero” y reducen al mínimo la probabilidad de obtener un falso positivo. positivo. Sin embargo, los ensayos presuntivos no se consideran suficientes para la identificación de drogas y resulta necesario confirmar los resultados r esultados mediante otros ensayos de laboratorio. Ensayo del color los ensayos del color los resultados resultados positivos únicamente son indicios de la posible presencia presencia de cocaína. Las reacciones del color se deben a compuestos que tienen una estructura química concreta. Sin embargo el color obtenido en un determinado ensayo puede variar en función de las condiciones en que se realiza, la cantidad de sustancia empleada y la presencia de material extraño en la muestra. Los ensayos del color utilizados para determinar la cocaína son especialmente propensos a dar falsos positivos.
6. PRE -LABORATORIO Consulte las referencias descritas en la sección de antecedentes y proponga dos métodos de muestreo de sustancias sopechosas.
7. PROCEDIMIENTO PARTE A: Ensayo de Scott Método 1.
2.
3.
Colocar una pequeña cantidad (no más de 1 mg) del material sospechoso en un tubo de ensayo. Añadir cinco gotas del reactivo 1 y agitar el tubo de ensayo durante diez segundos. La cocaína y sustancias conexas producen un precipitado azul y una solución azul. Añadir una gota del reactivo 2 y agitar la mezcla durante algunos segundos. La solución azul debería volverse rosa. Si el color azul no varía, añádase otra gota. Si el color sigue sin alterarse, repetir el ensayo con una muestra más pequeña de material sospechoso. Añadir cinco gotas del reactivo 3 y agitar. Si hay cocaína presente, la capa inferior de cloroformo se volverá de un intenso color azul, mientras que la capa superior adquirirá una tonalidad rosa.
OBSERVACIONES: OBSERVACIONES: Es importante utilizar una muestra inferior a 1 mg. Tomar en cuenta que la relación entre la cantidad utilizada de los reactivos 1 y 2 sí lo es. Si agrega una cantidad excesiva de ácido clorhídrico al 29
reactivo 1 después de aparecer el color azul con la cocaína, la solución resultante será de color azul en lugar de rosa. PARTE B: 5.3.1.2 Ensayo del olor La actividad biológica de la cocaína no posee un olor característico, sin embargo cuando se mezcla con algunos reactivos específicos existe una transferencia de la función benzoica de la cocaína desde la metilecgonina al metanol y que se logra en presencia de hidróxido sódico o potásico metanólico seco. La evaporación del exceso de metanol deja un residuo que contiene benzoato metílico el cual resulta fácilmente identificable por su olor. Reactivo Disolver 1 g de potasio o de hidróxido sódico en 20 ml de metanol para obtener hidróxido sódico o potásico metanólico. Método 1. 2.
Humedecer completamente el material seco objeto del ensayo con el reactivo. Dejar que se evapore el exceso de alcohol, comparar el olor característico de la muestra con el del patrón de cocaína.
PARTE C: Ensayo de microcristales Ensayo con cloruro de platino: Disolver un 1 g de cloruro de platino en 20 ml de agua destilada. 1. 2. 3.
Colocar dos gotas de la solución muestra (unos 2 ó 3 mg de muestra / 5 gotas de ácido clorhídrico al 10%) en un portaobjetos de microscopio limpio. Colocar dos gotas del reactivo cerca de las gotas de muestra muestra y utilizar una varilla de agitación para crear un pequeño canal que conecte ambas soluciones. Observar la reacción y los cristales resultantes, sin colocar un cubreobjetos, a una ampliación de entre 100 y 200 aumentos en un microscopio.
Observaciones: La cocaína forma agujas finas, largas y en forma de V con ramificaciones.
8. LIMPIEZA Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS 30
Disponga los residuos en los recipientes rotulados para el efecto.
9. DATOS Y OBSERVACIONES Registre los datos y observaciones realizadas durante la práctica.
10.
ANÁLISIS Y CONCLUSIONES
Indique la confiabilidad de los métodos empleados para la identificación de cocaína. Son útiles para el análisis e investigación forense?
11.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1]. Manual para el uso de los laboratorios Nacionales de análisis de estupefacientes: Métodos recomendados para la identificación y el análisis de cocaína en materiales incautados. Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito. Disponible en: http://www.unodc.org/documents/scientific/Cocaine_S.pdf [2]. Rapid Testing Methods of Drugs of Abuse (ST/NAR/13/REV.1), United Nations, New York (1995). [3]. Tsumura, Y., T. Mitome y S. Kimoto, False positives and false negatives with a cocaine-specific field test and modification of test protocol to reduce false decision. Forensic Science International, 155 (2005), 158-164. [4]. 11. Grant, F. W., C. Martin y R. W. Quackenbush, A simple sensitive specific field test for cocaine based on the recognition of the odour of methyl benzoate as a test product. Bulletin on Narcotics, 27 (1975), 33-35.
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PRÁCTICA 8: IDENTIFICACIÓN DE DE DROGAS EN GENERAL CON KITS ESPECÍFICOS EFINICIÓN DEL PROBLEMA 1. DEFINICIÓN Existen kit comerciales específicos para poder identificar la naturaleza de varios tipos de drogas. Este tipo de pruebas aunque presuntivas permiten hacer una optimización de recursos de análisis y el uso correcto de los indicios físicos encontrados ya que en muchos casos estas muestras tienden a ser recolectadas en cantidades limitadas. Por lo tanto es necesario realizar una prueba presuntiva antes de enviar las muestras al laboratorio forense para su identificac ión final.
2. OBJETIVOS
Reconocer los kits comerciales usados para realizar pruebas presuntivas de drogas en general. Evaluar los resultados de las pruebas (positivas, negativas, falsos positivos o falsos negativos) previo a decidir a qué tipo de análisis final serán sometidos los indicios físicos.
3. MATERIALES Y EQUIPO
Muestras de material sospechoso Kit varios de análisis rapido de drogas
4. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD Disponga del material utilizado en el lugar que le indique el instructor, deseche los guantes en los recipientes destinados para ello, ello, deje limpio su lugar de trabajo. Antes de salir lávese las manos con abundante agua y jabón.
5. ANTECEDENTES Disponga del material utilizado en el lugar que le indique el instructor, deseche los guantes en los recipientes destinados para ello, ello, deje limpio su lugar de trabajo. Antes de salir lávese las manos con abundante agua y jabón.
6. PRE -LABORATORIO Contestar las siguientes preguntas: 1. 2. 3.
Cuál es la composición química de los kits comerciales utilizados para identificación de drogas? Qué ventajas tiene el uso de los kits comerciales? Que desventajas? Que aporte tiene este tipo de kit comerciales a la investigación y análisis de indicios físicos?
7. PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5.
Seleccione la muestra que va a analizar El instructor le proporcionara los kits comerciales para proceder a la identificación de los fluidos Revise el instructivo de aplicación según indique cada kit y repítalo en el orden indicado Anote los resultados Repita el procedimiento con una muestra que contenga una muestra de origen desconocido y compárelo con las muestras que tienen los otros equipos de trabajo.
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8. LIMPIEZA Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Disponga del material utilizado en el lugar que le indique el instructor, deseche los guantes en los recipientes destinados para ello, ello, deje limpio su lugar de trabajo. Antes de salir lávese las manos con abundante agua y jabón.
9. DATOS Y OBSERVACIONES Anote lo que observo durante la práctica de aplicación de los los kits comerciales. En forma de tabla presente presente los resultados obtenidos, incluyendo los resultados de la muestra desconocida.
10.
ANÁLISIS Y CONCLUSIONES
Después de comparar las muestras con el resto de los equipos de trabajo anote sus conclusiones.
11.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1]. Manuales de uso de productos de investigación forense, visitar: http://www.sirchie.com/Assets/Manuals/pdf/TB300_TB03-246ENG.pdf
www.sirchie.com,
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