Cuaderno de Practicas Toxicologia

TOXICOLOGÍA AMBIENTAL Y SALUD PÚBLICA (CIENCIAS AMBIENTALES)

CUADERNO DE PRÁCTICAS CURSO 2016-17 ÚNICA FECHA DE ENTREGA: HASTA EL 15 DE ENERO DE 2017 (NO SE ADMITE LA ENTREGA POSTERIOR A ESTA FECHA, TAMPOCO EN SEPTIEMBRE)

El cuaderno debe enviarse a través del curso virtual utilizando la herramienta “Entrega de trabajos”. Se debe entregar en formato PDF PDF (puede emplear el programa gratuito PrimoPDF para la conversión de Word a PDF). Es obligatorio contestar todas las preguntas y hacerlo en castellano. castellano.

Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública (Grado en CC Ambientales) 2014-2015

PRÁCTICA 1 ETIQUETAS Y FICHAS DE DATOS DE SEGURIDAD Una de las normas de seguridad más importantes a la hora de trabajar en el laboratorio es conocer la información relativa a los productos químicos que se manipulan. Los proveedores de estos productos deben incluir de forma obligatoria una ficha de datos de seguridad (FDS) que complementa la información que se aporta en la etiqueta con los riesgos que supone el compuesto para la salud y la seguridad de las personas que los manipulen, así como para el medio ambiente. 1.1 En el Anexo II del Reglamento (CE) Nº 1907/2006 (REACH) (L396/267) corresponde a la “Guía para la elaboración de fichas de datos de seguridad”. Utilizando esta guía, conteste a las siguientes cuestiones. 1. Si el preparado se clasifica como peligroso deben indicarse la concentración o rango de concentración en el preparado de: a) sustancias peligrosas para el medio ambiente que se encuentren en concentraciones superiores o iguales al nivel mínimo definido en el cuadro del artículo 1, apartado 3, de la directiva 1999/45/CE b) sustancias peligrosas para el medio ambiente que se encuentren en concentraciones superiores o iguales al nivel mínimo definido en el cuadro del artículo 3, apartado 3, de la directiva 67/548/CEE c) sustancias peligrosas para el medio ambiente que se encuentren en concentraciones superiores o iguales al nivel mínimo definido en el cuadro del artículo 3, apartado 5, de la directiva 1999/45/CE d) sustancias peligrosas para el medio ambiente que se encuentren en concentraciones superiores o iguales al nivel mínimo definido en el cuadro del artículo 3, apartado 3, de la directiva 1999/45/CE 2. En la sección referente a la capacidad toxicológica: a) basta con indicar si es tóxico o no b) deben incluirse los ensayos teóricos realizados a partir de modelos de simulación c) no es necesario incluir los datos sobre efectos crónicos si estos se producen en un periodo posterior a los cinco años de la exposición d) es preciso incluir los efectos a largo plazo si se conocen 3. En el apartado sobre el transporte de la sustancia: a) sólo se incluirá la información relativa al transporte fuera de las instalaciones del transportista b) en la información correspondiente se pueden incluir el número ONU, el grupo de clasificación y el nombre propio del transporte c) las normas que regulan el transporte marítimo son las que marca ICAO/IATA

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d) se aplicará la Directiva 94/55/CE del 21 de noviembre de 1994 relativa al transporte de sustancias peligrosas por ferrocarril 4. En relación al uso de la sustancia o del preparado: a) solo deben incluirse aquellos que puedan ser de interes en la industria b) la ficha de datos de seguridad incluirá información sobre los usos identificados pertinentes para el destinatario c) no deben incluirse, ya que los usos de una sustancia son variables en el tiempo y precisaría de una actualización constante d) el término empleado deberá ser distinto al que se ha utilizado en el registro 5. Respecto al almacenamiento: a) se indicará si es preciso algún tipo de diseño especial para realizar un almacenaje seguro b) se indicará la cantidad mínima que se puede almacenar c) no es preciso incluir las medidas básicas de almacenamiento que se incluyen en la Directiva 98/24/CE. d) las recomendaciones deberán ajustarse solo a las normativas europeas, obviando todo lo referente a las normativas nacionales y/o regionales 6. Entre las propiedades físico-químicas que se deben incluir encontramos: a) la temperatura, la presión de vapor y el olor de la sustancia b) la presión de vapor, la viscosidad y la velocidad de evaporación del compuesto c) sus propiedades ópticas del producto en agua d) coeficiente agua/octanol, humedad y densidad de vapor de la sustancia 7. En este tipo de documentos, el concepto de control de la exposición: a) cubre todas las medidas específicas de control de riesgos a tomarse durante el uso para reducir al mínimo la exposición de los trabajadores y el medio ambiente b) se refiere a todo aquello que debe hacer un trabajador para asegurarse que alcanza la dosis máxima de exposición c) permite evaluar el daño producido al realizar una exposición controlada sobre los trabajadores antes de usar la sustancia de manera constante d) implica la necesidad de realizar test previos de exposición de los trabajadores y analizar su respuesta ante dicha exposición a la sustancia 8. En el apartado de primeros auxilios, a) debe indicarse si se requiere consejo de un médico b) deben incluirse solo las medidas de carácter general, no las especificas c) las explicaciones deben ser técnicas y precisas para que se lleven a cabo de manera correcta d) no deben diferenciarse en distintos apartados los que deben realizarse según las diferentes vías de exposición


9. En el apartado de la información ecológica: a) se indicará a que especies puede afectar b) se recogeran los datos disponibles sobre la toxicidad acuática en insectos, moluscos y anfibios c) se describirá el posible comportamiento de la sustancia en el medio ambiente d) solo debe indicarse el tipo de degradación química que sufre el compuesto 10. Uno de los datos que debe incluirse son: a) las sustancias que deben emplearse para realizar una reacción de oxidación b) las posibles utilidades del compuesto en los laboratorios académicos c) las condiciones que producen una reacción peligrosa d) las medidas de seguridad que pueden no implementarse por el tipo de compuesto que se trata El CLP o Reglamento CLP es el Reglamento (CE) Nº 1272/2008 (modificado en el Reglamento (CE) Nº 790/2009) sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas, y por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y 1999/45/CE y se modifica el Reglamento (CE) Nº 1907/2006 (REACH). Entró en vigor el 20 de enero de 2009 y es de aplicación en toda la Unión Europea. En su Título III se establecen las normas generales para la comunicación del peligro de una sustancia o una mezcla mediante el etiquetado de su envase. 1.2 Utilizando las Partes 3 y 4 del Anexo I de este Reglamento ( página 81 del 1272/2008), relativas a los peligros para la salud y para el medio ambiente, indique a qué tipo de peligro se refiere cada uno de los siguientes textos que se indican a continuación: 1. Evaluar la solidez de las pruebas implica contabilizar el número de tumores observados en los estudios con personas y animales y determinar su grado de significación estadística. a. Carcinogenicidad b. Lesiones oculares graves o irritación ocular c. Mutagenicidad en células germinales), d. Corrosión o irritación cutáneas 2. Las sustancias cuya toxicidad aguda sea claramente inferior a 1 mg/l contribuyen a la toxicidad de la mezcla incluso en bajas concentraciones, por lo cual se les asigna un mayor peso en el método sumatorio de los componentes clasificados. a. Peligroso para el medio ambiente acuático b. Toxicidad específica en determinados órganos (stot) — exposición única c. Peligroso para la capa de ozono d. Toxicidad para la reproducción 3. Los criterios de clasificación se basan en la viscosidad cinemática. La fórmula siguiente expresa la relación entre la viscosidad dinámica y la cinemática: Viscosidad dinámica (mPa.s)/densidad (g/cm 3)=viscosidad cinemática (mm 2/s) a. Toxicidad específica en determinados órganos (stot) — exposiciones repetidas b. Toxicidad para la reproducción c. Peligro por aspiración


d. Sensibilización respiratoria o cutánea 4. ¿Por qué se plantean criterios diferentes para la exposición a la sustancia y la exposición a mezclas? Razone su respuesta. 1.3 La lista de indicaciones de peligro, información suplementaria sobre los peligros y elementos suplementarios que deben figurar en las etiquetas y la lista de consejos de prudencia aparecen en los anexos III y IV ( página 146 del 1272/2008). En la tabla se muestran las indicaciones de peligros y los consejos de prudencia referentes a un producto, complétela con las frases asociadas a cada número. Consejo

Tipo de peligro

H202 H205 H223 H242 H271 H300 H302 H311 H315 H332 H341 EUH 059 1.4 A la hora de avisar de los peligros de un compuesto químico existen una serie de pictogramas que se emplean para que el usuario conozca el tipo de peligro. Utilizando el documento “Globally harmonized system of classification and labelling of chemicals (GHS) ” de las Naciones Unidas indique el significado de cada uno de los pictogramas que se indican a continuación:

Pictograma

Significado



PRÁCTICA 2 MÉTODOS DE ENSAYO La clasificación de las sustancias se hace sobre la base de ensayos bien realizados y suficientemente validados, considerándose de preferencia los descritos en el Reglamento (CE) Nº 440/2008 (y las modificaciones al mismo incluidas en el Reglamento (UE) Nº 260/2014). 2.1 En la Parte C de este Reglamento ( página 787) se explican distintos métodos de evaluación de la toxicidad. Respecto al ensayo de toxicidad para quironómidos en sistemas sedimentoagua con sedimento enriquecido, señale la opción correcta: 1. Los parámetros que se evalúan son: a) la aparición de malformaciones mandibulares. b) el consumo de oxígeno de las larvas y la cantidad de glucógeno que aparece tras la exposición. c) el tiempo de desarrollo del huevo hasta la fase larvaria y el peso de la larva. d) la emergencia de adultos y el tiempo hasta que se produce. 2. La preparación del sistema de sedimentos implica: a) añadir primero el agua y, una vez estabilizada, añadir el sedimento de forma que se impregne bien de la solución b) colocar los sedimentos enriquecidos en los recipientes y añadir agua para conseguir una relación de volumen de 1:4 c) el empleo de agua salada ya que estos organismos viven en zonas marinas d) el uso de recipientes descubiertos para simular la evaporación que se produce en la naturaleza 3. Respecto a la sustancia problema: a) se emplean concentraciones superiores a 100 mg/L b) no debe ser una sustancia biodegradable. c) debe conocerse la hidrosolubilidad de la misma. d) debe ser inmiscible en agua para una fácil absorción por parte del animal. 4. La tasa de aparición de adultos se determina por la ecuación: a) ER=(fixi)/ne b) ER=1/(díai-(li/2)) c) ER=(ne/na) d) ER=ln ne/na2 5. Entre las condiciones para que el ensayo sea válido no se encuentra: a) al final del ensayo deben medirse en cada recipiente el pH y la concentración de oxígeno disuelto; la concentración de oxígeno debe ser al menos el 20 % del valor de saturación en el aire a la temperatura aplicada, y el pH del agua sobrenadante debe estar en el rango de 5 a 7 en todos los recipientes de ensayo, b) la aparición de adultos de C. riparius y C. yoshimatsui en los recipientes de control debe producirse cuando hayan transcurrido entre 12 y 23 días desde su introducción en los recipientes; en el caso de C. tentans es necesario un plazo de entre 20 y 65 días, c) la aparición de adultos en los controles no ha de ser inferior al 70 % al final del ensayo d) la temperatura del agua no debe variar en más de ± 1,0 °C; la temperatura del agua podría controlarse mediante un espacio isotérmico y, en tal caso, debería confirmarse la temperatura


ambiente de ese espacio a intervalos apropiados. 6. El ensayo se realiza para: a) determinar el efecto de la exposición de larvas de un género de ortópteros de acuerdo con las directrices de la OCDE. b) valorar el desarrollo embrionario en huevos de insectos y el potencial teratogénico del producto analizado. c) evaluar los efectos de exposición prolongada de sustancias sobre larvas del díptero de agua dulce Chironomus sp. d) estudiar el efecto sobre larvas de peces del genero Danio de manera crónica y aguda 7. Entre los componentes del sedimento artificial a emplear encontramos: a) 30% de gel de sílice b) 1% de arcilla c) 50% de caolín d) 4-5% de turba 8. Se entiende por ensayo límite: a) aquel que se hace sin control b) el que incluye al menos tres concentraciones y un control c) un ensayo que utiliza una cantidad subóptima de sustancia a ensayar d) aquel que implica una concentración de ensayo y un control 9. Entre las especies que se pueden emplear en este ensayo encontramos: a) Chironomus yoshimatsui b) Chironomus luridus c) Chironomus pallidivitatus d) Chironomus kefferi 10. A la hora de realizar el ensayo: a) deben emplearse larvas que tengan, al menos, una semana tras la eclosión del huevo b) se recomienda un periodo de equilibrado de, al menos, dos semanas antes de realizar el ensayo c) la fase de los animales puede conocerse midiendo la anchura de la cápsula cefálica d) los organismos deben colocarse de manera inmediata una vez preparados los recipientes de ensayo 2.2 Indique aquella información de la que aparece en la tabla que debe incluirse en el informe del ensayo de inmovilización aguda de Daphnia sp. Señale los números correspondientes con una X en la tabla. 1. Método de ensayo utilizado (por ejemplo, semiestático o dinámico, con indicación de volumen y carga expresada en número de individuos por litro). 2. Explicación de las eventuales desviaciones respecto al método de ensayo y de la medida en que afecten a los resultados de ensayo. 3. Minimizar los resultados «no detectado al límite de detección» mediante la aplicación de un método de ensayo preliminar y el diseño experimental, puesto que estos resulta dos son inutilizables para los cálculos de las constantes de velocidad. 4. Incidencia y descripción de los efectos sobre el comportamiento, en su caso.


5. Mortalidad de los peces de control y de los peces de cada recinto de ensayo y todos los comportamientos anormales observados. 6. Concentraciones de las eventuales sustancias auxiliares. 7. Mortalidad en los controles. 8. Registro completo de los descendientes vivos de cada parental. 9. Incidencia y descripción de las anomalías morfológicas, en su caso. 10. Condiciones de alojamiento, incluido el tipo, tamaño y material de las jaulas. 11. Información detallada de la alimentación, con indicación de la cantidad (en mg c/individuo/día) y el programa (tipo de alimento, con indicación en su caso del nombre específico (especie) del alga y, si se conocen, la cepa y las condiciones de cultivo). 12. Diseño del ensayo (número de recipientes en paralelo, número de parentales por recipiente en paralelo). 13. Métodos de preparación de las soluciones madre y problema, incluido el eventual uso de dispersantes; concentraciones utilizadas. 14. Coeficiente de variación de la fecundidad de los controles (basada en el número total de descendientes vivos por parental vivo al final del ensayo). 15. Identificación química, incluida la pureza, de la sustancia. 16. Resultados y fecha del ensayo efectuado con la sustancia de referencia, si se conocen, 17. Calidad del agua en los recipientes de ensayo (pH, temperatura y concentración de oxígeno disuelto además de TOC y COD y dureza cuando proceda). 18. Procedencia y especie de Daphnia, proveedor original (si se conoce) y condiciones de cultivo utilizadas (con inclusión de la procedencia, el tipo y la cantidad del pienso, así como la frecuencia de la alimentación) 19. El número y porcentaje de dáfnidos inmovilizados. 20. Contenido lipídico de los peces (si se determina con motivo del ensayo). Nº Resp. Nº Resp. Nº Resp. Nº Resp. 1

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PRÁCTICA 3 BASES DE DATOS Como fuente de información toxicológica además de las etiquetas y las FDS (MSDS, Material Safety Data Sheet en inglés) existen bases de datos disponibles en Internet. La información que incluyen es abundante siendo necesario organizarla para poder hacer un buen uso de ella. Cada base de datos presenta una gran variedad de datos, incluyendo información relativa a estudios realizados, concentraciones analizadas, efectos que se producen u organismos que se han empleado en los ensayos de toxicidad. Uno de los objetivos de los créditos prácticos de la asignatura es conseguir que el alumno se familiarice con las bases de datos y conozca dónde conseguir la información que puede requerir en un futuro. 3.1 Se proporcionan varias bases de datos en las que se indica el tipo de información que se puede obtener. Debe entrar en ellas para familiarizarse con su manejo y conocer su utilidad de cara a una futura utilización profesional. NOTA: Recuerde que las bases de datos son de uso profesional y, por tanto, se realizan en inglés por ser el idioma técnico empleado en esta área . Al buscar un nombre de un producto se debe utilizar el nombre químico del compuesto en inglés. En algunas de ellas la búsqueda se realiza por el identificador numérico CAS (Chemical Abstract Service Registry Number ) que debe buscar previamente. ► Entrada a las bases de datos de EEUU:

http://toxnet.nlm.nih.gov/

En el botón “ALL DATABASES” se puede seleccionar la base de datos que se quiere

consultar. Entre ellas se pueden encontrar: ChemIDplus. Sinónimos químicos, estructuras, información regulatoria y enlaces a otras bases de datos con información sobre productos químicos.


HSDB (Hazardous Substances Databank ). Información sobre la toxicidad y los efectos biomédicos de productos químicos. Se centra en la toxicología de las sustancias potencialmente peligrosas. Posee información de la exposición en humanos, la higiene industrial, los procesos de emergencia en el manejo, el destino ambiental, las necesidades reguladoras y áreas relacionadas. Todos los datos se refieren y derivan de un conjunto de libros, documentos gubernamentales, informes técnicos y literatura seleccionada. Esta base de datos es revisada por el SRP (Scientific Review Panel), un comité de expertos en las principales áreas que se incluyen en la base de datos. Esta herramienta se organiza en fichas individuales para cada producto y contiene más de 5000 productos. TOXLINE. Numerosas referencias a la literatura sobre los efectos biomédicos, farmacológicos, fisiológicos y toxicológicos de las drogas y otras sustancias químicas. CCRIS (NCI Chemical Carcinogenesis Research Information System ). Contiene resultados sobre carcinogénesis, promoción de tumores, inhibición de tumores y mutagénesis obtenida del rastreo en revistas, los informes técnicos del Instituto Nacional de Cáncer americano, revisiones y monografías de la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer publicadas desde 1976. Los resultados de los test se han revisado por expertos en carcinogénesis. DART (Developmental and ReproductiveToxicology ). Referencias antiguas y actuales de agentes biológicos, químicos y físicos que pueden causar defectos congénitos. Las fichas incluyen citas bibliográficas, resúmenes (cuando se encuentran disponibles), MeSH (títulos de materias médicas), palabras clave ETIC (solo en las referencias más antiguas), nombres químicos y números de registro CAS (Sociedad Americana de Química). Esta base de datos la realiza la EPA (Agencia de Protección Medioambiental de EEUU), el NIEHS (Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Medioambiental de EEUU) y el NCTR (Centro Nacional para la Investigación Toxicológica de EEUU). ETIC la fundó la ATSDR (Agencia para el Registro de Sustancias Tóxicas y Enfermedades de EEUU), la EPA y el NIEHS. GENETOX (EPA GENetic TOXicology ). Revisa y evalúa la literatura existente y los sistemas de ensayos disponibles en el campo de la toxicología genética. IRIS (Integrated Risk Information System ). Evaluación del riesgo para la salud humana, centrándose en la identificación del riesgo y el cálculo de la dosis-respuesta. ITER. Información sobre el riesgo químico para distintas autoridades a nivel mundial, entre las que se incluyen la Agencia de Protección Medioambiental de los EE.UU., la Agencia para las Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades, Helath Canada, el Instituto Nacional Alemán de Salud Pública y Medio Ambiente, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer, así como otros organismos independientes. LactMed. Información sobre sustancias químicas a las que podrían estar expuestas las madres en periodo de lactancia. Entre los datos que incluye se encuentran niveles de exposición maternos y de los infantes, posibles efectos en recién nacidos y sustancias alternativas a considerar.


Multi-Database. Búsqueda integrada en cualquiera o todas las bases de datos siguientes: Hazardous Substances Data Bank (HSDB), Integrated Risk Information System (IRIS), International Toxicity Estimates for Risk (ITER), Chemical Carcinogenesis Research Information (CCRIS) y Genetic Toxicology (GENE-TOX).

TRI. Estimación de los vertidos anuales de las sustancias químicas al medioambiente. Haz-Map. Datos sobre salud ocupacional, tanto para profesionales como para consumidores interesados en conocer los efectos de la exposición a sustancias químicas en el lugar de trabajo. Household Products. Enlaza con los efectos sobre la salud de más de 8.000 marcas comerciales a través de Material Safety Data Sheets (MSDS) y permite a científicos y consumidores investigar productos en base a sus ingredientes químicos. TOXMAP. Representación geográfica de los datos de TRI con enlaces a otros recursos dentro de TOXNET. ►

La UE ha centralizado la información en la European Chemical Agency (ECHA): http://echa.europa.eu/information-on-chemicals

3.2 Utilizando la base de datos HSDB responda a las siguientes preguntas sobre el enalapril maleate (CAS 76095-16-4). 1. Respecto a su carcinogenicidad, ¿qué se conoce?

2. ¿Qué test se han empleado en el análisis de su genotoxicidad?


3. ¿Cuál es la LD50 mínima que se ha observado en ratones?

4. ¿Qué presión de vapor presenta este producto?

5. ¿Qué empresas fabrican este producto?

6. ¿Cuál es el metabolito principal de este compuesto y qué enzimas son responsables de formarlo?

7. ¿Cuál es su modo de acción?

8. ¿Cuál es su vida media en personas sanas?

9. ¿Qué coeficiente de partición octanol/agua tiene?

10. ¿Qué punto de fusión?

11. ¿Es soluble en agua?

12. ¿Qué otros nombres recibe este producto?

3.3 La EU – Pesticides database recoge información de interés sobre estos compuestos. Se va a utilizar para buscar información sobre los pesticidas y su situación actual en relación a la normativa europea. a) Iniciando la búsqueda por sustancias activas (“ Active substance detail ”), conteste a las preguntas siguientes relativas al Methiocarb (CAS 2032-65-7). 1. ¿Cuál es su estatus actual y en qué fecha expira el mismo?

2. ¿Cuál es el Acceptable operator exposure levels (AOEL) para este compuesto?

3. ¿Qué clasificación recibe en relación a los consejos y peligros que tiene?


Existen otras bases de datos que se pueden emplear. Una de ellas es la PPDB: Pesticide Properties DataBase, de la Universidad de Hertfordshire. Empleando esta base de datos responda a las siguientes preguntas. 4. ¿Cuál es el nombre asignado por la IUPAC?

5. ¿Qué solubilidad presenta en solventes orgánicos?

6. ¿Qué factor de bioconcentración presenta?

7. ¿Dentro de que grupo de pesticidas se incluye y frente a qué tipo de plagas se emplea?

8. ¿Qué vapor de presión tiene?


PRÁCTICA 4 PBT PROFILER En ocasiones nos encontramos con una falta de datos experimentales acerca de algunas sustancias químicas de interés, lo que nos impide valorar los riesgos medioambientales y para la salud de las mismas. Hay multitud de herramientas orientadas a tratar de predecir dichos riesgos en base a las propiedades físico-químicas de las sustancias y a similitudes con otras sustancias de propiedades conocidas. Una de ellas es el PBT Profiler, aplicación desarrollada por el Centro de Ciencias Medioambientales para la Oficina para la Prevención de la Contaminación y los Tóxicos de la Agencia de Protección Medioambiental de los EE.UU.

4.1 Con la ayuda de esta herramienta, rellene los datos que se solicitan a continuación de dos compuestos con números CAS 102-76-1 y 579-10-2. Nombre 102-76-1: Nombre 579-10-2: 102-76-1

579-10-2

Vida media en agua Vida media en suelo Vida media en sedimento Vida media en aire Porcentaje de acumulación en agua Porcentaje de acumulación en suelo Porcentaje de acumulación en sedimento Porcentaje de acumulación en aire Según los resultados, ¿cuál de ellos resulta más bioacumulable?, ¿por qué?

4.2 Responda las siguientes preguntas con la información que se proporciona en esta herramienta relativa al 2-Propenoic acid, 3-(4-methoxyphenyl)-, 2-ethylhexyl ester. 1. ¿Cuál es el número CAS de este producto?


2. ¿En qué medio se encuentra de forma mayoritaria?

3. ¿Qué índice de bioconcentración presenta?

4. ¿Qué coeficiente de partición octanol/agua tiene?

5. ¿Se considera que este producto es persistente?, ¿por qué?


PRÁCTICA 5 ENSAYO TOXICOLÓGICO A la hora de valorar la ecotoxicidad de un compuesto el primer paso es realizar un ensayo de supervivencia exponiendo grupos de animales prueba o de referencia a concentraciones crecientes del compuesto potencialmente tóxico durante un tiempo definido. El análisis de la curva dosis-respuesta, en relación a la mortalidad o la supervivencia del organismo estudiado, permite cuantificar y expresar de forma precisa la toxicidad. En este tipo de estudios se pueden obtener distintos parámetros de interés como la LC10 o la LC50. Con los datos que se indican:

Condiciones experimentales: ORGANISMO: Chironomus tepperi Skuse, 1889 , larvas acuáticas de cuarto estadio. CONCENTRACIÓN: mg/L en medio de cultivo. TIEMPO DE EXPOSICIÓN : 48 horas. MUESTRA: 3 experimentos de 30 individuos/concentración cada uno. C OMPUESTO A

Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3

0 30 29 30

0.001 30 29 30

Concentración ( μg/L) 0.01 0.1 30 28 29 29 29 28

1 27 28 27

10 26 28 26

100 16 16 18

0.001 30 29 29

Concentración (mg/L) 0.01 0.1 30 27 28 28 29 27

1 27 28 25

10 25 25 22

100 2 0 2

10 23 17 26

100 0 0 0

C OMPUESTO B


0 30 30 30

C OMPUESTO C


0 30 30 30

0.001 27 24 28

Concentración (ng/L) 0.01 0.1 27 21 24 19 28 27

1 23 18 26

5.1 Obtenga la LC50 para cada uno de los compuestos mostrados por medio de interpolación gráfica . Para la representación gráfica puede utilizar el programa Graph. 5.2 Calcule la LC50 para cada uno de los productos mostrados utilizando el análisis Probit. a.- Manualmente (siguiendo las instrucciones del documento que se encuentra en el curso virtual). b.- Utilizando un programa informático (se indica al final de la explicación).

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Prácticas de Toxicología Ambiental y Salud Pública – 2009-10

La utilización del análisis Probit fue propuesta por Chester Ittner Bliss en 1934. Entomólogo de la Estación Experimental Agrícola de Connecticut, su objetivo era encontrar un pesticida eficaz para controlar los insectos que se alimentaban de hojas de parra. Representando la respuesta de los insectos a varias concentraciones de pesticidas podía visualizar que cada pesticida afectaba a los insectos a distintas concentraciones, o lo que es lo mismo, que unos eran más efectivos que otros. Sin embargo, carecía de un método estadístico adecuado que le permitiera comparar esas diferencias. La aproximación más coherente era realizar un estudio de regresión de la respuesta frente a la concentración o dosis y realizar la comparación entre los distintos pesticidas. La relación de la dosis-respuesta es sigmoidea y en esa época la regresión solo se empleaba en datos lineales. Por lo tanto, lo que hizo fue transformar la curva dosis-respuesta sigmoidea en una línea recta. Bliss propuso la transformación del porcentaje de muertos en una unidad de probabilidad o “probit” (relacionada con la establecida actualmente, pero que él consideró arbitrariamente que era igual a 0 para 0.0001 y 10 para 0.9999). Para ayudar a otros investigadores incluyó una tabla para convertir el porcentaje de muertos a los valores probit, los cuales podían ser representados frente al logaritmo de la dosis y, de esta forma, obtener una línea más o menos recta. En 1952 un profesor de la Universidad de Edimburgo, David Finney, desarrolló la idea de Bliss en un libro (Probit Analysis, 1952). Actualmente es el método estadístico preferido para estudiar las relaciones dosis-respuesta. El análisis Probit es un tipo específico de regresión utilizado para estudiar variables de respuesta binomiales, es decir, con solo dos salidas (por ejemplo, vivo-muerto). La curva dosis-respuesta sigmoidea se transforma en una línea recta que se puede analizar por regresión a través del método de mínimos cuadrados o de máxima probabilidad. Una vez que se ha hecho la regresión, el investigador puede usar el resultado para comparar la cantidad de producto que se requiere para generar la misma respuesta con cada uno de los distintos productos empleados. Aunque hay muchos valores empleados para comparar la toxicidad de los productos químicos, los más empleados hoy en día son la LC 50 o la LD50. Para realizar este análisis se pueden emplear tres aproximaciones diferentes: 





Por medio del uso de tablas para estimar los probit, ajustando la relación de manera manual. Calculando manualmente los valores de probits, el coeficiente de regresión y los intervalos de confianza. Por medio de un paquete estadístico como SPSS, StatPlus, etc.

En esta práctica se debe obtener la LC 50 por medio de tablas y a través de un programa informático. El programa estadístico que se puede emplear es PROBIT (de la U.S. Environmental Protection Agency ), que se ha incluido en un archivo comprimido (Probit.zip) en la sección de documentos del curso virtual. Este programa solo se puede emplear en ordenadores que tengan un sistema operativo de 32 bits. Para comprobar su sistema operativo compruebe en “panel de control” y “sistema” el sistema operativo de su ordenador. Si tiene un ordenador con sistema operativo de 64 bits puede emplear la versión de prueba del programa StatPlus (http://www.analystsoft.com/en/products/statplus/) u otros paquetes estadísticos a los que se tenga acceso. Importante: la versión de prueba solo se activa durante un mes por lo que solo tendrá 30 días para realizar esta parte de la práctica desde el momento que active el programa. Si emplea un ordenador Apple debe utilizar la versión de prueba del programa StatPlus que incluye el análisis probit. También puede emplear el programa de acceso libre de análisis estadístico R, que se ha aprendido a utilizar 19


en la asignatura de Estadística Aplicada al Medio Ambiente de segundo curso del Grado de CCAA. En el curso virtual se encuentra un documento con un ejemplo de cómo emplear este programa obtenido de Internet. El alumno puede encontrar documentos similares en red que explican el uso de R para el análisis Probit. ¿Qué puede decir de la toxicidad relativa de cada compuesto respecto a los otros dos si los pesos moleculares de estos compuestos son 350.2 g/mol (A), 211.3 g/mol (B) y 127.8 g/mol (C)? 5.3. Obtenga la representación normal para cada producto. Esta representación se realiza calculando la mortalidad relativa específica para cada concentración. Para ello basta con restar a cada valor de la mortalidad la inmediatamente anterior y representar el diagrama correspondiente. 5.4 A la hora de evaluar la toxicidad se emplean parámetros muy variados, entre los cuales se encuentran los de tipo molecular como pueden ser la expresión de un gen o la cantidad de una proteína. A continuación se proporcionan los datos obtenidos en un estudio de expresión génica con los productos A, B y C. Haga la representación gráfica de los datos y comente los resultados obtenidos razonando sus respuestas. En esta práctica el estudiante debe emplear los conocimientos adquiridos a lo largo del grado, especialmente lo aprendido en materias como Biología, Matemáticas, Estadística o Técnicas Instrumentales. Datos obtenidos (“Rep.” indica réplica) : 1ª Parte: Gen 1

Experimento 1 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 17.80 17.86 17.89 23.86 22.53 25.66 29.48 22.24 25.26 28.23 24.48 27.33 26.06 27.20 24.98 32.35 34.35 33.45 51.56 52.54 53.54 22.58 22.68 22.79 10.15 10.50 10.12 5.20 5.47 5.63



Experimento 1 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Control 73.15 73.98 75.03 Comp A 0.1 mg/L 72.36 73.54 72.89 Comp A 1 mg/L 73.25 72.68 72.02 Comp A 10 mg/L 23.50 22.50 22.78 Comp B 0.1 mg/L 78.56 75.58 76.21 Comp B 1 mg/L 68.54 67.25 68.16 Comp B 10 mg/L 42.25 42.32 43.12 Comp C 0.1 mg/L 72.15 73.12 71.98 Comp C 1 mg/L 98.56 94.65 96.54 Comp C 10 mg/L 108.53 106.55 107.15

Experimento 2 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 72.15 75.15 72.89 78.82 77.15 76.25 73.58 73.46 74.01 25.54 26.20 26.00 75.12 76.91 77.01 67.12 67.91 66.52 41.15 42.51 41.76 72.83 72.03 71.72 97.89 98.45 96.91 10.9.25 108.91 110.02


Control Comp A 0.1 mg/L Comp A 1 mg/L Comp A 10 mg/L Comp B 0.1 mg/L Comp B 1 mg/L Comp B 10 mg/L Comp C 0.1 mg/L Comp C 1 mg/L Comp C 10 mg/L Gen 2

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Gen 3

Experimento 1 Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3 Control 168.18 166.80 169.72 Comp A 0.1 mg/L 169.70 167.98 167.42 Comp A 1 mg/L 225.53 226.71 224.88 Comp A 10 mg/L 402.89 404.82 401.22 Comp B 0.1 mg/L 75.18 75.16 75.65 Comp B 1 mg/L 214.07 214.59 215.73 Comp B 10 mg/L 385.47 385.01 386.10 Comp C 0.1 mg/L 164.61 164.98 165.90 Comp C 1 mg/L 166.35 167.73 167.84 Comp C 10 mg/L 168.95 167.06 166.98



2ª Parte: Se ha estudiado también el efecto que tiene la presencia de un producto D en mezcla con cada uno de estos compuestos sobre la expresión del gen 1. Las gráficas de los resultados obtenidos se muestran a continuación. Comente los resultados de las gráficas en relación a las interacciones que pueden darse y el efecto que tiene la presencia del compuesto D en la expresión del gen. Compuesto A + Compuesto D (0.1 mg/L) 3

Compuesto B + Compuesto D (0.1 mg/L) 25

o d a t a r t o n l 2 a o t c e p s e r o1 t n e m e r c n I

o d a20 t a r t o n l a15 o t c e p s e r 10 o t n e m e r 5 c n I

0 0.1 D

0.1+0.1

0.1+1

0.1+10

Compuesto C + Compuest o D (0.1 mg/L) 8

o d a t a r t

o6 n l a o t c e4 p s e r o t n2 e m e r c n I

0

0.1 D

0.1+0.1

0.1+1

0.1+10

En el eje de ordenadas se muestra las veces que se modifica la expresión relativa del gen en relación a los niveles de mRNA que presenta en situación no tratada. En situación control ese nivel se considera 1. En el eje de abscisas se muestran las concentraciones empleadas (0.1 mg/L del compuesto D y las concentraciones empleadas con cada compuesto 0.1, 1 y 10 de μg/L, mg/L y ng/L respectivamente para los compuestos A, B y C).

0 0.1 D

0.1+0.1

0.1+1

0.1+10

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5.5 A continuación se muestran distintas gráficas obtenidas con un producto X. Gráfica 1

Gráfica 2

18

175

16 ) a n14 í e t o12 r p r 10 g / K ( 8 d a 6 d i v i t 4 c A 2

150

125

100 ) L / g µ (

75

50

0 CAT

SOD 0h

6h

GPx 12h

24h

TXN

25

48h

0

CAT: catalasa SOD: superóxido dismutasa GPx: glutation peroxidasa TXN: tiortedoxina

0h -25

0.01 mg/L

0.1 mg/L

24h

36h

48h

60h

72h

84h

96h

Tiempo

Gráfica 3 C

12h

Gráfica 4 1 mg/L

60

% Puestas viables 100%

s 50 a i r a r 40 t i b r a30 s e d a20 d i n U10

75%

50%

25%

0%

0 Proteína I

Proteína II

Proteína III

1. ¿Qué conclusiones puede sacar de la gráfica 1 respecto al efecto que tiene este producto en ratones? Razone su respuesta.

2. La gráfica 2 corresponde a un estudio de la degradación del producto en agua. Se quiere utilizar este producto en un ensayo de toxicidad acuática pero no existe posibilidad de realizar un ensayo de flujo. Indique cómo realizaría un ensayo de toxicidad de una semana de duración para evaluar el daño sobre el desarrollo en una especie con larvas acuáticas. Razone su respuesta.

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3. La gráfica 3 corresponde al análisis de tres proteínas en adultos de una especie de molusco de agua dulce, ¿cuál de las tres proteínas sería un mejor biomarcador teniendo en cuenta que los niveles del producto estudiado en los cursos de agua oscila entre 1 nM y 1 µM (MW = 228.29)?

4. En la gráfica 4 se muestra un ensayo realizado sobre una especie de insectos y con este producto. En el ensayo se tratan el mismo número de larvas durante el mismo tiempo con las concentraciones indicadas, ¿qué conclusión obtiene de los datos? Razone su respuesta.

5.6 Empleando como referencia lo aprendido en los ejercicios previos y las bases de datos utilizadas, elabore el informe final de un ensayo de toxicidad para evaluar el daño crónico en un test semiestático. El compuesto a evaluar es metformin hydrochloride (N,N-Dimethylimidodicarbonimidic Diamide Hydrochloride) y el ensayo se realiza con una de las especies siguientes: Dendrobaena veneta o Lymnaea stagnalis (el estudiante debe seleccionar una de ellas). En el mismo debe incluir los materiales y métodos que emplea en el ensayo (información sobre la especie y su ciclo vital, número de individuos usados por concentración, fase del ciclo empleada, composición del medio a emplear, propiedades físico-químicas del producto estudiado), las condiciones del ensayo (concentraciones a emplear y forma de selección de las mismas, parámetros a evaluar en el ensayo, periodos de toma de datos, criterio de evaluación, metodología de análisis de datos, análisis estadísticos empleados, cómo mostrar los datos) y la información de los resultados que debe mostrarse al lector (realizar en un máximo de dos caras de A4). Para un mejor desarrollo del ejercicio pueden crearse datos ficticios.

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PRÁCTICA 6 BIBLIOGRAFÍA A la hora de realizar un estudio toxicológico es importante tanto la aproximación práctica como la teórica. En esta práctica se leerá un documento relacionado con aspectos toxicológicos de interés. En el curso virtual se han incluido dos documentos de literatura científica de los cuales debe seleccionarse uno para contestar las preguntas correspondientes que se encuentran a continuación. Las respuestas deben ser razonadas y no ser la traducción del texto.

Mixture toxicity revisited from a toxicogenomic perspective. Altenburger R, Scholz S, SchmittJansen M, Busch W, Escher BI. Environ Sci Technol . 2012 46(5):2508-22. doi: 10.1021/es2038036. 1.- Haga un resumen del artículo. 2.- Explique la figura 1 del artículo. 3.- ¿Qué recomendaciones hacen los autores para la utilización de las aproximaciones toxicogenómicas en la evaluación de mezclas? Test 1. En las evaluaciones cualitativas, a) se producen valoraciones nominales de las concentraciones obtenidas en los experimentos al final del proceso de análisis. b) los diferentes test empleados y la arbitrariedad de los valores de corte invitan a considerar los resultados dependientes del método empleado. c) la respuesta a los tóxicos responden a situaciones de monotonía estadística con análisis en formas U. d) es sorprendente que no se hayan realizado análisis de regresión para el modelado de las curvas dosis-respuesta. 2. La capacidad de predicción de los modelos actuales sobre mezclas de tóxicos con componentes efectivos a largo plazo: a) favorece el establecimiento de sólidas bases de desarrollo experimental. b) permite desarrollar una hipótesis de trabajo. c) aún no es adecuada. d) no tiene interés por su falta de fiabilidad ante los resultados experimentales estudiados en el artículo. 3. La comprensión de cómo las interacciones moleculares se traducen en efectos apicales ayudarán a: a) ahorrar en el proceso de determinación de las interacciones entre los tóxicos al favorecer la industria química. b) desarrollar nuevos métodos de análisis que requieran un mayor número de animales. c) eliminar los estudios dosis-respuesta de los datos requeridos para la evaluación de riesgo. d) la extrapolación de las respuestas de las mezclas a otras escalas y entre especies. 4. ¿Cuántos estudios de los analizados emplearon mezclas binarias? a) 2 b) 18 c) 13 d) 41 5. La mayor parte de los estudios mostraron: a) respuestas dependientes de tiempo. b) diferencias cualitativas. c) diferencias cuantitativas dosis-respuesta. d) alteraciones cuantitativas en la expresión de genes. 24


6. ¿Cuál es una de las grandes ventajas de las técnicas de secuenciación masiva o de los microarrays? a) utilizan cantidades de DNA genómico pequeñas para la transcriptómica. b) al ser con radiactividad, son altamente sensibles. c) no precisan de aparataje especial para llevarse a cabo. d) no necesitan de forma obligatoria la secuenciación del genoma. 7. El modelo de adición de respuesta: a) se utiliza para mezclas de compuestos que ejercen su acción a través de distintas dianas. b) se emplea en el análisis de datos de RNA-seq. c) es un modelo desarrollado para normalizar los datos obtenidos en metabolómica. d) permite potenciar la técnica de análisis de datos de microarrays por medio de sistemas informáticos. 8. ¿Cuál de las siguientes técnicas se usa en metabolómica? a) tomografía por emisión de positrones. b) RAMAN multifaceta nuclear c) tomografía axial computerizada. d) resonancia magnética nuclear. 9. El experimento de simulación consiste en: a) añadir uno de los compuestos de forma exponencial hasta producir un efecto subletal. b) utilizar un programa informático con los datos previos conocidos para anticipar las posibles rutas afectadas por los tóxicos de la mezcla. c) considerar que la mezcla más simple es la de un compuesto consigo mismo. d) determinar la concentración nominal mínima que produce un efecto letal del 50%. 10. Si el estudio se plantea para comprender la cadena de efectos biológicos después de la interacción del producto con un sistema vivo, debería seleccionar un planteamiento enfocado a: a) identificar el principal responsable del efecto biológico. b) determinar la hibridación entre muestra control y muestra problema. c) cuantificar la intensidad de la señal obtenida en un parámetro. d) descifrar las señales distintas respecto a la referencia.

Exposure-driven risk assessment: applying exposure-based waiving of toxicity tests under REACH . Rowbotham AL, Gibson RM. Food Chem Toxicol. 2011, 49(8):1661-73. doi:

10.1016/j.fct.2011.03.050. 1.- Haga un resumen del artículo 2.- Explique la figura 3 del artículo. 3.- Resuma las conclusiones a las que llegan los autores. Test 1. ¿Qué provoca la aplicación de REACH? a) el aumento de test in vivo reducirá la necesidad de desarrollar test in vitro. b) aunque busca reducir el empleo de test con vertebrados, inicialmente se producirá un aumento de test con animales. c) el incremento en las importaciones de productos químicos por encima de una tonelada. d) el aumento de la producción de productos químicos sin evaluar. 2. Los requerimientos que tiene REACH para cada sustancia dependen de: a) la actividad de la sustancia en los estudios que se han realizado previamente en vertebrados. b) la estructura molecular del producto.

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c) el tonelaje importado o producido anualmente. d) el origen de la sustancia. 3. El valor umbral que empleaba la Administración de Alimentos y Medicamentos de EEUU en su umbral de regulación: a) era menor que aquel utilizado por recomendación de la Organización Mundial de la Salud en los países en vías de desarrollo durante la década de los 60-70. b) se basaba en los datos obtenidos por la JEFCA en sus test de toxicidad realizados con ratones desnudos para evaluar el nivel de carcinogenicidad del producto. c) supuso un hito en el desarrollo de los conceptos de toxicología para la evaluación de riesgos en el medio ambiente con especial cuidado en todo lo relacionado con la región de los Grandes Lagos. d) se obtenía por la transformación de la potencia carcinogénica de cada producto en un nivel de exposición correspondiente a la posibilidad de uno por cada millón de desarrollar cáncer. 4. La base de datos de potencia carcinogénica se basa en: a) los datos obtenidos con estudios dietéticos en animales con setecientos treinta carcinógenos. b) el análisis de los datos obtenidos por inhalación en ratones con tres mil doscientos productos sospechosos de ser carcinógenos. c) la comparación relativa de los datos obtenidos en estudios con ratones frente a una molécula carcinógena reconocida. d) los test de Ames realizados con muestras procedentes de animales de laboratorio obtenidas tras tratarlos con carcinógenos. 5. Las siglas TTC corresponden a: a) peso de la evidencia. b) umbral de preocupación tóxica. c) informe de seguridad química. d) límites de exposición química. 6. Bernauer et al (2008) aplicaron en su estudio factores de seguridad para obtener los valores umbral en cada parámetro. Indique cuál de los siguientes no se incluyó entre ellos. a) uso de una muestra de pequeño tamaño. b) empleo de pocos productos. c) diferencias interespecíficas. d) variabilidad interindividual. 7. El uso de un producto químico en un escenario ocupacional muy específico es: a) un elemento cuantitativo de carácter modular para la valoración de un tóxico. b) determinante de la necesidad de nuevos test de toxicidad bajo la normativa REACH. c) una situación especial que requiere la realización de test in vivo como paso para la realización de test in vitro. d) causa eximente cualitativa basada en exposición. 8. Las siglas ALDBR se corresponden con: a) la tasa de ingestión de producto por día. b) la inhalación aceptable media en la vida de un organismo. c) la frecuencia respiratoria diaria durante una vida media. d) la vida media de un producto inhalado en el organismo. 9. EBW significa que: a) la aplicación de REACH precisa de nuevas tecnologías que permitan la evaluación de nuevos parámetros in vivo no considerados hasta ahora. b) todas las sustancias sin excepción deben desarrollar test de toxicidad experimentales para evaluar los riesgos que poseen para el medio ambiente.

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c) REACH permite no tener que llevar a cabo test de toxicidad para una sustancia basándose en escenarios desarrollados para la evaluación de toxicidad. d) se pueden utilizar los productos indicados sin necesidad de aplicar test in vitro pero si es necesario aplicar test in vivo. 10. ¿Cuál de los siguientes criterios no es aplicable para poder eximir de realizar un test de toxicidad reproductiva? a) no hay exposición humana o no es significativa. b) los datos de estructura-actividad muestran alta actividad hidrosoluble. c) la sustancia tiene baja actividad toxicológica. d) los datos toxicocinéticos indican que no se produce absorción sistémica por vías relevantes de exposición.

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Cuaderno de Practicas Toxicologia

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