Aislamiento de enzimas
•
•
•
Las células vivas no son indispensables para tener actividad enzimática (in vitro?) Enzimas están dentro de la célula pero algunos microorganismos la secretan al medio (enzimas extracelulares) extracelulares) Para Para estudiar in vitro a una enzima, la célula debe ser “rota”.
•
Deben tomarse criterios para seleccionar los tejidos u organismos para extraer enzimas.
Criterio de selección de tejidos •
•
Buscar un recurso rico en enzimas. En que reino, clasificación está presente la enzima. Es más fácil trabajar con enzimas de microorganismos y de animales.
Plantas: fenoles + aire -> quinonas (inactivan a la enzima)
Técnicas de solubilización •
•
•
•
Muchas enzimas no son estables a T° ambiente -> 0-4°C. La homogenización con hielo. Enzimas pueden estar presentes en el citoplasma, organela, membranas. En organela hay que extraer la organela antes de romper membranas (medio de aislamiento isotónico)
Selección del medio de aislamiento •
•
•
•
En tejidos animales y microorganismos -> agua destilada Buffer con carga iónica adecuada. Buscar pH adecuado (actividad máxima de enzimas) En plantas el uso de buffer es primordial debido a las vacuolas.
Si una enzima tiene grupos sulfidrilos para iniciar su actividad (en plantas también) se necesitan agentes reductores: -β mercaptoetanol - Metabisulfito de sodio - Ditiotreitol - Glutationa reducida - Etc… Mantienen fenoles en forma reducida. También se usa Tritón X 100 (disocia complejo proteína quinona). Frecuentemente usados entre 10-50 mM •
•
•
•
•
•
Hay agentes fijadores de fenoles PVP. Rompimiento de célula -> proteasas -> usar PMSF (fenil metil sulfonil fluoruro). Metales pueden desnaturalizar las proteína -> usar EDTA (etileno diamina tetra acetato). A veces Mg, Mn, Zn, etc. se necesitan en el medio para la actividad enzimática. Si se desea destruir membrana y pared celular y mantener organelas mantener condiciones isotónicas (manitol o sucrosa)
Técnicas de aislamiento de enzimas •
Morteros – moderada homogenización. Con
arena purificada o bolas de cristal Licuadoras – Para tejido de plantas. No recomendable para organelas. Ultrasonido – para microorganismos Homogenizador Vir-Tis – suave, para tejidos animales. Homogenizador Potter Elvejm – suave para tejido animal •
•
•
•
•
Extrusión – células en suspensión sometidas a
alta presión y atomizadas. En bacterias.
•
Enzimas líticas – Para romper pared y
•
membrana celular (ej. Celulasas, pectinasas, xylanasas, etc..), no muy usadas. Congelar y descongelar - Daña la membrana. Para microorganismos y células ecucariotas. Polvo de acetona – Rompe membrana celular.
•
Métodos de purificación de enzimas •
•
•
Proceso muy costoso y lento. Hay que remover otras substancias Proceso de muchos pasos que incluye: - Concentración - Solubilidad - Carga - Tamaño - Hidrofobicidad
Objetivos: Recuperar mucha enzima, altamente pura, métodos reproducibles, usar químicos poco costosos y acortar el tiempo de purificación.
•
•
•
Buscar concentrar la proteína en la mezcla más que purificarla. Luego se la purifica. El primer paso de la purificación es el fraccionamiento de la proteína (solubilidad en sales y compuestos orgánicos) Solubilidad .- Interacciones polares de la proteína con el solvente acuoso, interacciones iónicas con sales y fuerzas electrostáticas repulsivas entre moléculas cargadas.
Precipitación y fraccionamiento Adición de sales
-
Sulfato de amonio, sulfato sódico. Ocurre deshidratación del ambiente protéico. Remueve impurezas presentes en la enzima. Se mantiene a un pH constante mientras se mezcla y se añade sal (0-30%, 30-60%, 6090%).
- Se guarda a bajas temperaturas para que precipite la enzima. - Se centrifuga, precipitado es la enzima que debe ser almacenada en el medio apropiado Adición de solventes orgánicos •
Generalmente acetona a -20°C a diferentes concentraciones 10, 20, 30%, etc…
•
El precipitado se lo guarda en el medio apropiado
Adición de polímeros no iónicos •
•
Polietileno Glicol (PEG) de bajo peso molecular El precipitado puede ser cargado a una columna de intercambio iónico
Fraccionamiento por calor •
•
Método poco usado Cuando las proteínas son estables a 55 o 60°C.
Separación por cromatografía •
•
•
Separación de la proteína de una fase móvil a una fase estacionaria. Cromatografía de intercambio iónico, de adsorción, filtración en gel y de afinidad. Método: la muestra con la proteína es puesta en una columna, se eluye con buffer, la columna tiene un ligando específico para la proteína, el efluente se colecta en diferentes fracciones.
Cromatografía de intercambio iónico
Liga proteínas cargadas por atracciones electrostáticas (enlaces iónicos) con un intercambiador iónico (intercambiador aniónico y catiónico) Para desligar, aumentar concentración iónica de buffer o cambiar pH. Intercambiador aniónico: DEAE ceulosa Intercambiador catiónico: CM celulosa También se usa Sephadex o Sepharosa •
•
•
•
Cromatografía de adsorción •
•
•
Ligar la proteína por adsorción física de una matriz insoluble por ligaduras débiles como H+ y van der Waals. Se eluye la enzima con buffer cambiando el pH o concentración iónica. Gel de fosfato de calcio, gel de alúmina y gel de hidroxilapatita.
Cromatografía de filtración en gel •
•
•
Basado en el tamaño y forma de las proteínas El gel es empaquetado en la columna de cromatografía. Gel con partículas esféricas y porosas. Grandes moléculas se eluyen fuera de la columna. Ej. Sephadex, agarosa, poliacrilamida.
Cromatografía de afinidad
La enzima se liga con un análogo del sustrato, activador. Usan matrices de afinidad como celulosa, agarosa, etc. Proteína – anticuerpo Matriz Green A específica para enzimas.
•
•
•
•
Electroforesis •
•
•
No se usa para purificar, sino para análisis de pureza de la proteína. Generalmente se usa PAGE en donde proteínas se separan por carga y tamaño.
https://www.youtube.com/watch?v=oIFoRQG_cis
Ultrafiltración •
•
•
Para concentrar la muestra, remueve sustancias de bajo peso molecular. A través de una membrana pasa el solvente y compuestos de bajo peso molecular. Membranas con poros grandes y pequeños
Diálisis •
•
Para remover sales, contaminantes de bajo peso molecular. Membrana: película delgada de sustancias altamente polimerizada, inerte y sin carga. (tamiz molecular) ej: Membranas animales, celofano, etc
Cristalización •
•
Después de purificar la enzima, se la debe cristalizar (muy difícil) Sulfato de amonio y sulfato sódico hacen turbia la mezcla -> bajar T° -> después de 24h aparecen cristales.
Criterio de pureza de una enzima Hay muchas técnicas para determinar impurezas, es mejor usarlas en su conjunto. - Detección de contaminantes no protéicos Ej. Ácidos nucléicos. Por espectrofotómetro OD 280 OD 260 - Detección de contaminantes protéicos: Cambio de actividad protéica Cromatografía Electroforesis Centrifugación •
Tabla de purificación por etapas de fraccionamiento •
Mostrar pasos de purificación de la enzima
Caracterización de enzimas •
•
Parte importante del estudio de la enzima Se busca: -pH optimo -T° óptima - Energía activación - Cinética - Propiedades físicas
