DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÒN DE CAFEÌNA EN LA COCA COLA UTILIZANDO HPLC
RESUMEN Se analizó la concentración de cafeína en la coca cola usando HPLC (Cromatografía de alta eficiencia), ef iciencia), teniendo como referente diversas concentraciones de cafeína: 5ppm, 10ppm, 20ppm y 30ppm. Después se determinó el área y por último se graficó los resultados y se determinó la concentración de cafeína en el analito de interés; en nuestro caso, la coca cola.
INTRODUCCIÓN
HPLC es un tipo de cromatografía en columna utilizada en bioquímica y química analítica. Comúnmente llamada “cromatografía “cromatografía líquida de alta eficiencia”, en este
método el compuesto que se está analizando (analito) pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. El analito es introducido en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan dependiendo de las interacciones i nteracciones con la fase estacionaria a medida que se adelanta por la columna.
PARTES DEL CROMATÓFORO HPLC
Analito: Es el compuesto, elemento o ión de interés analítico en la muestra; es decir, las especies químicas cuya presencia o concentración se desea conocer. El analito
puede ser identificado y cuantificado, se puede determinar la cantidad y la concentración del mismo. Fase estacionaria: En el método HPLC normalmente la fase estacionaria hace referencia a un cilindro con pequeñas partículas redondeadas sólidas o un líquido fijado en un sólido que presenta determinadas características químicas en su superficie. Fase móvil: Consiste en un fluido(gas, líquido) que arrastra a la muestra a través de la fase estacionaria. En HPLC, la fase móvil es un disolvente no polar como el hexano (fase normal). Ésta fase se mueve a través de la columna de cromatografía (fase estacionaria) de foma que la muestra interacciona con la fase estacionaria y se separa. Tiempo de retención: Es el tiempo característico que tarda un analito particular en pasar a través del sistema, desde la columna de entrada hasta el detector bajo condiciones fijadas. Curva de calibración: Es un método de química analítica empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una seria de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación que en principio es lineal, entre un carácter medible como la absorbancia, y otro variable como la concentración. Para ello, es necesario efectuar diluciones de soluciones conocidas y así poder hacer una relación entre la conocida y la desconocida.
CROMATOGRAFÍA DE FASE NORMAL La cromatografía de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de absorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención. La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés, sino también en factores estéricos de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicas tienden a aumentar el tiempo de retención. CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe 2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C 18H37 o C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de
naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicas. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero también neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contra iones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en general mejoran la separación cromatográfica. PARÁMETROS NECESARIOS EN LA CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO DE HPLC Es necesario a menudo invertir la columna y enjuagar con solvente, teniendo la columna desconectada del detector, para evitar que se obstruya la columna de HPLC o que queden partículas depositadas allí. Configurar la presión para evitar que se dé perdida de resolución. Revisar la bomba antes de hacer el análisis para evitar que queden gases atrapados allí y hallan variaciones no deseadas en el tiempo de retención. Es importante desgasificar adecuadamente las fases móviles para reducir la concentración de oxígeno disuelto y de esta forma evitar picos falsos. Es necesario seleccionar adecuadamente el buffer que se va a utilizar, puesto que el pH juega un papel fundamental en el método de HPLC ya que puede aumentar la hidrofobicidad de algunos compuestos. También es fundamental, seleccionar la columna con la que se desea trabajar, dependiendo de los aminoácidos y el tipo de polaridad de los mismos.
RESULTADOS
ANÁLISIS DE RESULTADOS
CUANTIFICACIÓN DE CAFEÍNA EN LA COCA-COLA TABLA ÁREA VS CONCENTRACIÓN DE CAFEÍNA Cafeína
Área
5ppm
208,30582
10ppm
388,05811
20ppm
709,20807
30ppm
1102,74144
GRAFICA ÁREA VS CONCENTRACIÓN DE CAFEÍNA
Cuantificaciòn de afeìna en Coca-Cola 1200 y = 250.77x R² = 0.9428
1000 ) S * U A m ( a e r À
800 Àrea
600
Linear (Àrea)
400 200 0 5ppm
10ppm
Calculo de cafeína en Coca-Cola Y=250,77X 662,55481ppm/ 250,77ppm = X 2,6420ppm=X
20ppm
30ppm
CONCLUSIONES
Como se evidencia, la técnica de HPLC es una gran herramienta en el análisis de diversos analitos tales como: hidrocarburos, moléculas atmosféricas, componentes alimenticios, sustancias esteroideas; al igual que todo tipo de molécula biológica. Se logró observar la importancia de la columna que se va a utilizar y del tipo de cromatografía que se debe utilizar, como se vio varía dependiendo del analito que se desea determinar; en éste caso, la coca cola. La concentración de cafeína en la coca cola fue de 2.6420 ppm (partes por millón), que equivale en porcentaje a 0.026420mg/litro x 100: 0.2642% de la muestra total.
