Informe Analisi via Grupo Funcional

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

Análisis vía vía grupo funcional funcional para para cuantificación cuantificación de Benzoil metronidazol suspensión.

Desarrollo analítico

Asesora:

Grupo: 1801

Semestre: 2013-1

Integrantes:

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA MÓDULO: LABORATORIO DE DESARROLLO ANALÍTICO NOMBRE DEL PROYECTO: Análisis vía grupo funcional para cuantificación de benzoil metronidazol suspensión.

Fundamentos Grupo funcional es un conjunto de átomos, enlazados de una determinada forma, que presentan una estructura y propiedades físico-químicas determinadas que caracterizan a los compuestos orgánicos que los contienen. Son estructuras submoleculares, caracterizadas por una conectividad y composición elemental específica que confierere actividad a la molécula que los contiene. Reemplazan a los átomos de hidrógeno perdidos por las cadenas hidrocarbonadas saturadas. Los grupos alifáticos, o de cadena abierta, suelen ser representados genéricamente por R (radicalesalquílicos), mientras que los aromáticos, oderivados del benceno, son representados por Ar(radicales arílicos). Los principales grupos funcionales son los siguientes: Grupo hidroxilo ( – OH) Es característico de los alcoholes, compuestos constituidos por la unión de dicho grupo a un hidrocarburo (enlace sencillo). Grupo alcoxi (R – O – R) Grupo funcional del tipo R-O-R', en donde R y R' son grupos que contienen átomos de carbono, estando el átomo de oxígeno en medio de ellos, característico de los éteres (enlace sencillo). (Se usa la R ya que estos grupos de átomos constituyen los llamados radicales) Grupo carbonilo (>C=O) Su presencia en una cadena hidrocarbonada (R) puede dar lugar a dos tipos diferentes de sustancias orgánicas: los aldehídos y las cetonas. -En los aldehídos el grupo C=O está unido por un lado a un carbono terminal de una cadena hidrocarbonada (R) y por el otro, a un átomo de hidrógeno que ocupa una posición extrema en la cadena. (R –C=O –H) (enlace doble). -En las cetonas, por el contrario, el grupo carbonilo se une a dos cadenas hidrocarbonadas, ocupando por tanto una situación intermedia. (R –C=O –R) (enlace doble). 

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El Método analítico es aquel método de investigación que consiste en la desmembración de un todo, descomponiéndolo en sus partes o elementos para observar las causas, la naturaleza y los efectos. El análisis es la observación y examen de un hecho en particular. Es necesario conocer la naturaleza del fenómeno y objeto que se estudia para comprender su esencia. Este método nos permite conocer más del objeto de estudio, con lo cual se puede: explicar, hacer analogías, comprender mejor su comportamiento y establecer nuevas teorías Los métodos que emplea el análisis químico pueden ser: Métodos químicos (se basan en reacciones químicas) o clásicos: análisis volumétrico análisis gravimétrico  

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FECHA ENTREGA 19 sep. 12

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Métodos fisicoquímicos (se basan en interacciones físicas) o instrumentales: métodos espectrométricos métodos electroanalíticos métodos cromatográfico Los métodos químicos han sido utilizados tradicionalmente, ya que no requieren instrumentos muy complejos (tan sólo pipetas, buretas, matraces, balanzas, entre otros). Los métodos fisicoquímicos, sin embargo, requieren un instrumental más sofisticado, tal como equipos de cromatografía, cristalografía, etc. El estudio de los métodos químicos está basado en el equilibrio químico, que puede ser de los siguientes tipos: equilibrio ácido-base; equilibrio redox; equilibrio de solubilidad; equilibrio de complejos.   

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Desarrollo de métodos analíticos Los métodos analíticos se deben validar según la naturaleza del método analítico en: métodos de cuantificación métodos de determinación de impurezas pruebas límite identidad.    

Para estudiar éstos se determinan parámetros como linealidad, rango, especificidad, exactitud, precisión, tolerancia, robustez y los límites de detección y cuantificación según sea el caso. En el caso de que no exista dicho método se propone uno mediante un diseño factorial para determinar las condiciones de trabajo. En el presente trbajo se utilizó métodos espectrométricos estos son métodos instrumentales empleados en química analítica basados en la interacción de la radiación electromagnética, u otras partículas, con un analito para identificarlo o determinar su concentración. Algunos de estos métodos también se emplean en otras áreas de la química para elucidación de estructuras. Emplean técnicas que se dividen en técnicas espectroscópicas y en técnicas no espectroscópicas. Las técnicas espectroscópicas son aquellas en las que el analito sufre procesos de absorción, emisión o luminiscencia. El resto corresponde a técnicas no espectroscópicas.

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Las técnicas espectroscópicas se diferencian también según la forma en la que se encuentra el analito en el momento en el que sufre el proceso espectroscópico, dando lugar a la espectroscopia atómica y a la espectroscopia molecular. Según el rango de energía que presente la radiación electromagnética existen diferentes técnicas, por ejemplo, espectroscopia de infrarrojo, espectroscopia de resonancia magnética nuclear, etcétera. Las técnicas no espectroscópicas aprovechan diferentes propiedades de la radiación electromagnética, como el índice de refracción o la dispersión. Otra técnica importante es la espectrometría de masas, también empleada en química orgánica para la elucidación de estructuras moleculares. Benzoil metronidazol

El metronidazol (DCI) es un antibiótico y antiparasitario del grupo de los nitroimidazoles. Inhibe la síntesis del ácido nucleico y es utilizado para el tratamiento de las infecciones provocadas por protozoarios y bacterias anaeróbicas. El metronidazol es también indicado como preparación gel para el tratamiento de enfermedades dermatológicas como el acné rosácea. Químicamente el benzoato de metronidazol es un ester del metronidazol -Fórmula empírica: C13H13N3O4 -Peso molecular: 275.3 equivaliendo 1,6 g de benzoato de metronidazol a 1 g de metronidazol base. -Es un polvo cristalino blanco o ligeramente amarillo -Prácticamente insoluble en agua, poco soluble en etanol, soluble en acetona, fácilmente soluble en cloruro de metileno y muy poco soluble en éter. -Se puede conservar entre 15 y 30 ºC y se debe proteger de la luz.

El benzoato de metronidazol sustituye usualmente al metronidazol base cuando se preparan composiciones orales debido a que tiene un sabor mucho menos amargo que aquél. Su solubilidad es 0,1 mg/ml frente a los casi 10 mg/ml del metronidazol base 2. Los preparados acuosos de benzoato de metronidazol presentan una serie de características que pueden comprometer la estabilidad de los mismos. EMITIÓ

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La formación del hidrato se sustancia en breves semanas y se caracteriza por un drástico incremento del tamaño de las partículas del benzoato de metronidazol, particularmente a temperaturas bajas, inferiores a 8 ºC, que podrá comprometer de forma notable la estabilidad de la suspensión preparada no sólo por incrementarse la capacidad de precipitación de las partículas sino, también, porque el monohidrato es especialmente sensible a sufrir alteraciones fotoquímicas que se manifiestan en que adquiere rápidamente una coloración amarilla cuando se expone a la luz. Por tanto, dado que las suspensiones de la forma monohidratada son termodinámicamente estables por debajo de 38 ºC, la posible variación en la biodisponibilidad de éste principio activo se deberá a la utilización del mismo en su forma anhidra o monohidratada debido a las diferencias en el tamaño de sus partículas y los problemas de suspensión que conlleva, y no a las diferencias en la actividad termodinámica de las mismas a la temperatura corporal, temperatura que coincide prácticamente con la temperatura de transición entre dichas formas cristalinas. Acción farmacológica Pertenece al grupo 5-nitroimidazol, activo contra la mayoría de las bacterias anaerobias obligatorias y protozoos, mediante la reducción química intracelular que se lleva a cabo por mecanismos únicos del metabolismo anaeróbico. El metronidazol reducido, que es citotóxico pero de vida corta, interactúa con el DNA y produce una pérdida de la estructura helicoidal, rotura de la cadena e inhibición resultante de la síntesis de ácidos nucleicos y muerte celular. Se absorbe bien por vía oral, atraviesa la placenta y la barrera hematoencefálica. Su unión a las proteínas es baja, se metaboliza en el hígado por oxidación de la cadena lateral y conjugación con glucurónico del 2-hidroximetil (también activo), y otros metabolitos. Las concentraciones séricas máximas que siguen a una dosis oral de 250 mg, 500 mg y 2 g son 6, 12 y 40 µg/mL, respectivamente. Se elimina por vía renal 60 a 80%. De esta cantidad 20% se excreta inalterado por orina, 6 a 15% se elimina en las heces, encontrándose metabolitos inactivos. También se excreta en la leche materna.

Objetivo Desarrollar un método analítico físico, químico o microbiológico con la finalidad de cuantificar el principio activo presente en una forma farmacéutica de acuerdo a los grupos funcionales que posee.

Objetivos particulares -Realizar la validación del método que se desarrolló en el laboratorio con la finalidad de evaluar si éste es adecuado para la cuantificación del principio activo en la forma farmacéutica. -Desarrollar y diseñar un método de extracción adecuado de acuerdo a las propiedades físicas, químicas y fisicoquímicas del principio activo para llevar a cabo la cuantificación de éste.

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Metodología Preparación de sustancia de referencia de Benzoil metronidazol

Pesar una cantidad equivalente a 50mg de Benzoil metronidazol, adicionar a un matraz volumétrico de 50 ml, disolver y aforar con una solución de ácido sulfúrico 0.1N en metanol, y mezclar. Pasar una alícuota de 1 ml de esta solución a un matraz volumétrico de 50 ml, aforar con el mismo disolvente, y mezclar. Esta solución contiene 20 µg/ml de benzoil metronidazol. Preparación de la muestra. (Variable: agitación con Bortex) Pasar a un matraz volumétrico de 50ml, 1ml de suspensión de Benzoil metronidazol (equivalente a 50mg), agregar 40 ml de una solución de ácido sulfúrico 0.1N en metanol, y mezclar en bortex durante 10 minutos y aforar. Filtrar por gravedad con papel filtro y descartar los primeros 15 ml del filtrado, pasar una alícuota del filtrado de 1ml a un matraz volumétrico de 50 ml y llevar al aforo con el mismo disolvente. Teóricamente se obtiene una concentración de 20 µg/ml de benzoil metronidazol. Preparación de la muestra . (Variable: agitación con sonicador)

Pasar a un matraz volumétrico de 50ml, 1ml de suspensión de Benzoil metronidazol (equivalente a 50mg), agregar 40 ml de una solución de ácido sulfúrico 0.1N en metanol, y mezclar en el sonicador durante 15 minutos y terminar de aforar. Filtrar por gravedad con papel filtro y descartar los primeros 15 ml del filtrado, pasar una alícuota del filtrado de 1ml a un matraz volumétrico de 50 ml y llevar al aforo con el mismo disolvente. Teóricamente se obtiene una concentración de 20 µg/ml de benzoil metronidazol. Preparación de la muestra. (Variable: agitación con sonicador)

Pasar a un matraz volumétrico de 50ml, 1ml de suspensión de Benzoil metronidazol (equivalente a 50mg), agregar 40 ml de una solución de ácido sulfúrico 0.1N en metanol, y mezclar en el sonicador durante 15 minutos y terminar de aforar. Filtrar por gravedad con papel filtro y descartar los primeros 15 ml del filtrado, pasar una alícuota del filtrado de 1ml a un matraz volumétrico de 50 ml y llevar al aforo con el mismo disolvente. Teóricamente se obtiene una concentración de 20 µg/ml de benzoil metronidazol. Preparación de la muestra . (Variable: centrifugación)

Pasar a un matraz volumétrico de 50ml, 1ml de suspensión de Benzoil metronidazol (equivalente a 50mg), agregar 40 ml de una solución de ácido sulfúrico 0.1N en metanol, y mezclar en el sonicador durante 15 minutos y terminar de aforar. Centrifugar 10ml de muestra a 4000rpm durante 10 minutos y tomar una alícuota de 1ml del sobrenadante y aforarla a 50ml en un matraz volumétrico con el disolvente empleado anteriormente. Teóricamente se obtiene una concentración de 20 µg/ml de benzoil metronidazol.

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Procedimiento Realizar un barrido en espectrofotómetro con luz UV para la muestra como para la referencia, empleando celdas de 1 cm y solución de ácido sulfúrico 0.1N en metanol como blanco de ajuste donde las absorbancias máximas deben darse en las mismas longitudes de onda 273-274nm. Si el espectro de la muestra concuerda con el de la referencia se obtiene la absorbancia de estas a la longitud de onda de máxima absorbancia de 273-274nm. Calcular la cantidad de benzoil metronidazol por ml de suspensión, por medio de la siguiente fórmula:

) (

Donde: C = Cantidad de benzoil metronidazol por mililitro en la preparación de referencia. D = Factor de dilución de la muestra. Am = Absorbancia obtenida con la preparación de la muestra. Aref= Absorbancia obtenida con la preparación de referencia.

Material y equipo               

24 matraces aforados de 50mL 12 pipetas volumétricas de 1mL 3 Soporte universal 3 Embudos de vidrio tallo corto estriado 3 Anillos metálicos 1 vaso de precipitado de 2L 4 vasos de precipitados 100 mL 2 celdas de cuarzo Papel filtro y papel glassin Espátula Espectrofotómetro. (Hitachi U-2900 Spectrophotometer) Balanza analítica Centrifuga Sonicador Agitador Bortex

Reactivos EMITIÓ

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Benzoil Metronidazol sustancia de referencia (50 mg) Suspensión de Benzoil Metronidazol 50ml Acido sulfúrico concentrado Metanol Agua destilada

Resultados Tabla no. 1

17 de Octubre 2012 Muestra

longitud de onda

Absorbancia

cantidad

Anotación

Estándar

273.5nm

0.423

0.0201mg/mL*

Estándar impuro

Suspensión

249.5nm

0.203

24.11mg+

Agitación con vortéx, se filtró la muestra *concentración de la última

dilución +Cantidad cuantificada, se esperaba obtener 50mg de metronidazol

Tabla no.2

24 de octubre 2012 Muestra

longitud de onda

Absorbancia

cantidad

Anotación

Estándar

273.5nm

0.503

0.0201mg/mL*

Estándar 2

1

273nm

0.585

58.44mg

Sonicó 5min.

2

273nm

0.667

66.63mg

Sonicó 10min

3

273.5nm

0.367

36.66mg

sonicó 15 min

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*Concentración de la última dilución Para las tres muestras se esperaba una cantidad de 50 mg

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Tabla no.3

31 de octubre 2012 Muestra

longitud de onda

Absorbancia

cantidad

Anotación

1

280nm

0.875

87.01mg

Sin centrifugar

2

279nm

0.874

87.31mg

Centrifugó

3

273.5nm

0.863

86.21mg

Centrifugó

Se tomó como estándar el del 24 de octubre del 2012 para hacer los cálculos Las muestras centrifugadas se realizaron a 1500rpm en 15 minutos Se esperaba para las tres muestras una cantidad de 50mg

Tabla no.4

7 de Noviemre del 2012 Muestra

longitud de onda

Absorbancia

cantidad

Anotación

1

273.5nm

0.813

81.22mg

Sonicó y centrifugó

2

273.5nm

0.847

84.61mg

Centrifugó

Se tomó como estándar el del 24 de octubre del 2012 para hacer los cálculos Las muestras centrifugadas se realizaron a 1500rpm en 15 minutos Se esperaba para las tres muestras una cantidad de 50mg

Tabla no.5

14 de Noviembre del 2012 Muestra

longitud de onda

Absorbancia

cantidad

Anotación

1

273.5nm

0.549

51.6 mg

Sonicó y centrifugó

2

273.5nm

0.654

61.475 mg

Sonicó y Centrifugó

3

273.5

0.494

46.450 mg

Sonicó y Centrifugó

Estándar

273.5

0.534

50.2 mg

-

Se preparó una nueva solución estándar Las muestras centrifugadas se realizaron a 4000 rpm en 10 minutos Se esperaba para las tres muestras una cantidad de 50mg

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Análisis de resultados

Debido a que la molécula del metronidazol es aromática, esta presenta transiciones entre electrones pi ( ), ya que cuando un fotón de energía adecuada incide en una especie absorbente, un electrón es promovido desde su estado fundamental a un estado electrónico excitado. Las energías de excitación en las transiciones son medianamente altas, correspondiendo a la región UV lejano y próximo. En espectroscopia UV se irradia con luz de energía conocida suficiente como para provocar transiciones electrónicas, es decir promover un electrón desde un orbital de baja energía a uno vacante de alta energía. El espectrofotómetro UV-Visible registra las longitudes de onda donde se registra absorción y la cuantifica. Debido a estas razones se procedió a cuantificar la molécula de benzoil metronidazol contenida en suspensión mediante una técnica espectrofotométrica. Para el tratamiento de la muestra y del estándar de benzoil metronidazol se decidió utilizar metanol como disolvente debido a su alta solubilidad en él. El metanol se encontraba en medio ácido, 0.1 N de ácido sulfúrico con la finalidad de hidrolizar la molécula y obtener solamente la molécula del metronidazol. En la primer determinación realizada el 17 de octubre, durante el tratamiento de la muestra se llevo a cabo una agitación de 15 minutos utilizando vortex, seguida de una filtración por gravedad, para posteriormente realizar las diluciones necesarias, sin embargo las lecturas obtenidas en el espectro para las muestras fueron muy bajas en comparación con la solución estándar, siendo que se esperaba tener en la muestra final una concentración de 20 µg/mL, y se obtuvieron concentraciones de 10.5µg/mL. La solución estándar que se ocupó para la primera determinación (17 octubre) presentó una absorbancia muy alta, de 0.423 en comparación con las absorbancias de las muestras de 0.204, por lo que se preparó una segunda solución estándar, que presentó una absorbancia de 0.503. Se realizó una segunda determinación (24 octubre) en la que se decidió cambiar la agitación con vortex por una sonicación; probando diferentes tiempos de sonicación, de 5, 10 y 15 minutos, seguida igualmente por una filtración por gravedad. Se cambió la agitación para ver si el analito se solubilizaba EMITIÓ

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mejor en el solvente y con esto se presentaran las concentraciones esperadas de 20 µg/mL. Se observó que la sonicación pudo haber influido ya que se logró cuantificar mayor cantidad de analito, sin embargo los datos obtenidos presentaron mucha variabilidad y se obtuvieron concentraciones muy altas del analito; de 23.64 µg/mL, 27.05 µg/mL. La variación de los resultados en dicha determinación, se pudieron deber a un mal aforado de matraces y pipetas volumétricas, así como a una mala preparación de la muestra, en la que se contenían excipientes que absorbían a la misma longitud de onda que el analito. A pesar de que las concentraciones obtenidas hasta este punto de la experimentación no fueron las esperadas, si se observa el máximo de absorción a la longitud de onda que se reporta en la literatura, de 273-274 nm. Un factor que pudo haber afectado a que no se obtuvieran las concentraciones esperadas es que la suspensión no era estable, ya que presentaba un sedimento de cristales, siendo esto un factor que afecta la homogeneidad de la suspensión y por lo tanto afecta directamente las determinaciones previas realizadas al obtener resultados no confiables. Debido a esta observación se cambio de muestra, por una nueva que si presento homogeneidad. En la tercera determinación, realizada el 31 de octubre, al utilizar la nueva suspensión se decidió realizar el mismo tratamiento de la muestra, con una sonicación de 15 minutos y filtración posterior. Se observó una variación mínima con un coeficiente de variación de 0.65 %, sin embargo las absorbancias presentadas por las muestras fueron muy altas, de 0.87, en comparación con el estándar de 0.503. Hay dos factores que podrían afectar dicho resultado, uno de ellos es la pureza del estándar y otra es que haya un excipente o excipientes en la muestra que estén absorbiendo a la misma longitud de onda del estándar. Por lo que se procedió a realizar una cuarta determinación, el día 7 de noviembre, en la que se cambió la filtración por una centrifugación, con el fin de lograr separar los excipientes que pudieran estar afectando la determinación. Sin embargo las absorbancias presentandas en el máximo de absorción siguieron siendo altas, de 0.83. Para verificar que la muestra utilizada presentara la concentración especificada en el marbete y descartar que esto influyera en la determinación por espectrofotometría uv, se realizó una titulación en medio no acuoso con ácido perclórico. Sin embargo debido a que no se pudo detectar con facilidad el punto final de titulación no se obtuvieron resultados confiables, y no se contemplo esto para decisiones posteriores. Partiendo de la suposición de que la sustancia de referencia no se encontrara en óptimas condiciones se procedió a preparar una nueva solución estándar, la cual presento una absorbancia de 0.534, la cual es ligeramente mayor a la segunda solución estándar, de 0.503.

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Se realizó una última determinación, el día 14 de noviembre, en la que se utilizó una suspensión de benzoil metronidazol, de formula conocida, para poder preparar un placebo. Al realizar un barrido de absorción de dicho placebo se observa que este no presenta interferencia en la lectura a la longitud de onda de interés, de 273.5 nm. Por lo que se descarta que los excipientes de esta suspensión puedan interferir en la lectura de las muestras. En las tres muestras evaluadas se logró cuantificar metronidazol, sin embargo se obtuvo un coeficiente de variación de 14.38 %. Por lo que el método desarrollado aún no es apto para la cuantificación de benzoil metronidazol en suspensión.

Conclusión Fue posible desarrollar un método analítico físico (espectrofotometría ultravioleta) con el cual se pudo cuantificar benzoilmetronidazol en una suspensión, sin embargo el coef iciente de variación para las muestras leídas fue muy elevado (14.38%) con respecto al 2% de un método espectrofotométrico (según ICH), por lo que no se desarrolló la validación del método analítico, además de que no se contó con el tiempo suficiente. Se desarrollaron diferentes métodos de extracción siendo el más adecuado la centrifugación.

Sugerencias

Referencias 1. Farmacopea de los estados unido Mexicanos, 9ª Ed. México (2008). 2. Guideline for Industry: Tex on validation of Analytical Procedures. ICH-Q2A, March 1995. 3. Guideline for Industry: Tex on validation of Analytical Procedures; methodology; ICHQ2B, November 1996. 4. García A, Soberon E, Cortes M. Guía de validación de métodos analíticos. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos. México, 2002.

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