Citocromo C Oxidasa El complejo IV cataliza la transferencia de electrones desde el citocromo c al oxigeno que es el aceptor electrónico terminal para para formar agua en un mecanismo acoplado a la translocación de protones a través de la membrana. Este complejo enzimático con múltiples subunidades de la mitocondria de mamíferos contiene 13 subunidades con una masa molecular de 200000 Da y contiene como componente componente redox dos citocromos, a y a3 y dos centros de cobre conocidos como CuA y CuB . Solo tres subunidades subunidades del complejo IV de mamíferos están codificadas codificadas en el ADN mitocondrial.
La subunidad subunidad I, el polímero mayor del complejo, contiene contiene 12 hélices
transmembrana pero carece de dominios extra membranosos significativos. Dos grupos hemo, a , a3
están unidos a la subunidad subunidad I de tal manera que que el hierro del anillo de la protoporfina está
coordinado con átomos de nitrógeno nitrógeno de residuos de histidina histidina conservados. Los planos tanto tanto del hemo a como del a3
son perpendiculares a la membrana. Además, la subunidad I contiene un
átomo de cobre (CuB ) que con el hemo a3 forma un centro binuclear implicado en la transferencia de electrones desde el hemo a al oxígeno. oxígeno. La subunidad II de la citocromo c oxidasa tiene un dominio grande que sobresale del lado citosolico de la membrana interna, en donde se une el citocromo c reducido, y que contiene contiene dos átomos de cobre (CuA ) unidos unidos a través través de grupos sulfhidrilo a dos cisteínas. La subunidad III contiene siete
hélices transmembrana
sin
prácticamente dominios extra membranosos negligibles pero no contiene ningún transportador redox. Las subunidades II y III III están localizadas en lados opuestos de la subunidad subunidad I.
Lactato Deshidrogenasa Es una enzima tetrámera que pertenece a la clase oxido-reductasa. Se encuentra ubicada en el grupo de enzima no funcionales, que son enzimas que participan en el metabolismo intermedio, la (2)
concentración tisular de estas enzimas es miles de veces más alta que en plasma.
Esta enzima la
podemos hallar en el corazón, hígado, músculos, eritrocitos, plaquetas y nódulos linfáticos. Su síntesis empieza desde dos genes individuales distintos, los cuales originan polipéptidos estructuralmente diferentes pero con la misma actividad catalítica. Existen 5 formas (1)
isoenzimáticas distintas codificadas por genes distintos.
La función de esta enzima es reducir reversiblemente el piruvato a lactato. Esta enzima está relacionada con el infarto de miocardio, hemólisis y enfermedades del parénquima hepático. Los niveles séricos aumentados de LDH se observan en muchas circunstancias como ser anemias megaloblásticas, infarto de miocardio y pulmonar, etc. El gran número de situaciones que aumenta la actividad de LDH hace relativa su utilidad diagnóstica. Sin embargo, es muy útil en el seguimiento de la quimioterapia del cáncer puesto que la respuesta en la terapéutica se acompaña por una disminución del nivel sérico de esta enzima. La determinación de la actividad de LDH es útil en el diagnóstico del infarto de miocardio y pulmonar. Son muy característicos los niveles de LDH elevados en los casos de infarto de miocardio y se observan valores altos ya a las pocas horas del comienzo del aparente infarto. Por si sola, la determinación de LDH no es determinante de lesión de ningún órgano en particular. Hay que tener en cuenta que es necesario evitar la hemólisis de la m uestra de sangre, para una correct a determinación. La LDH cataliza la reducción de piruvato a lactato y la simultanea oxidación de NADH a NAD+
Piruvato + NADH + H+ ↔ Lactato + NAD+ El NADH absorbe en el rango de la luz ultravioleta (340 nm), propiedad utilizada para la determinación enzimática. La mezcla de reacción aporta piruvato y NADH, como sustratos, en un medio de pH adecuado (buffer). La reacción se inicia por el agregado de muestra en estudio que contiene la LDH a dosar. Utilizando un espectrofotómetro se mide la disminución de absorbancia a 340 nm, indicador del consumo de NADH. La velocidad de desaparición del sustrato es proporcional a la cantidad de enzima LDH presente en la muestra.
Reacciones en las que esta enzima participa
Precursor
Enzima
Producto
ciclo
Piruvato
Lactato deshidrogenasa
Lactato
Ruta 11: ciclo piruvato-isovaleratoisoleucina
Precursor Lactato
Enzima Lactato dehidrogenasa
Producto Piruvato
Ciclo Ruta 11: vía piruvato-isovaleratoisoleucina
Precursor Piruvato
Enzima Lactato deshidrogenasa
Producto Lactato
Ciclo Ruta 8: Ciclo de Krebs
Parte Experimental Ensayo Nº 2: Seguimiento de la reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa
Aceite mineral
1 mL
-
1 mL
-
Lactato de sodio 0,1 M
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
Sol. Azul de metileno
0.5mL
0.5 mL
-
-
Homogenizado de hígado
-
-
0.5ml
0.5 mL
Homogenizado de corazón
1
2
3
4
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1
2
3
4
Mezclar
Dejar en reposo hasta por 20 minutos en baño Maria y observar los resultados.
Agitar vigorosamente y observar.
Ensayo N° 3: Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa. Agregar a cada tubo los reactantes que indican en el cuadro adyacente respectivamente, luego agitar vigorosamente, para favorecer la difusión del oxígeno dejar en reposo 30 minutos, agitando continuamente, observar la progresión de las reacciones y e l comportamiento de cada uno de los sistemas.
Tubo 1: ANTES
DESPUES
REACTIVO Sol. P- fenildiamina Buffer fosfato 0,1 M, pH 7,4
CANTIDAD 1ml
Agitar
1,5 ml
Tubo 2: ANTES
DESPUES
REACTIVO
CANTIDAD
Homogenizado de corazón
1ml
Sol. P- fenildiamina
1ml
Buffer fosfato 0,1 M, pH 7,4
1,5 ml
Agitar
Tubo 3:
ANTES
DESPUES
REACTIVO Homogenizado de corazón Cianuro de sodio 0,1 M (inhibidor) Sol. P- fenildiamina
CANTIDAD 1ml 0,5 ml
Agitar
1ml
Tubo 4: ANTES
DESPUES
REACTIVO Homogenizado de corazón Malonato de sodio 0,1 M (inhibidor) Sol. P- fenildiamina
CANTIDAD 1ml 0,5 ml 1ml
Agitar
Ensayo Nº 4: Seguimiento de la reacción c atalizada por la succinato deshidrogenasa
Azul de metileno (0,02%) Buffer fosfato 0.1 M pH 7,4 Succinato de sodio 0.1 M Agua bidestilada Malonato de sodio Cianuro de sodio 0,1 M Ferricianuro de potasio 0.1 M Homogenizado de higado
1 0,5 0,5 0,2 0,5
2 0,5 0,5 0,2 0,3 0,5
3 0,5 0,5 0,2 0,3 0,5
4 0,5 0,5 0,2 0,3 0,5
5 0,5 0,5 0,2 0,3 0,5
6 0,5 0,5 0,2 0,3 0,5
Aceite mineral
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
Dejar en reposo hasta por 20 minutos Agitar vigorosamente y observar.
en baño Maria y observar los resultados.
7 0,5 0,5 0,2 0,3 0,5
RESULTADOS
Ensayo N° 2:
++ Alta
Homogenizado Hígado Corazón + media - baja
Reacción catalizada por la LDH + ++
Figura 1. De izquierda a derecha: reacción catalizada por la LDH presente en el homogenizado de hígado y reacción catalizada por la LDH presente en el homogenizado de co razón.
Ensayo 3:
La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de sustancias como la pfenilendiamina en presencia del sistema de citocromos.
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Homogenizado de corazón (contiene a los citocromos y al citocromo c oxidasa).
Homogenizado de corazón (contiene a los citocromos y al citocromo c oxidasa). inhibidor
Tubo 4 Homogenizado de corazón (contiene a los citocromos y al citocromo c oxidasa). inhibidor
Sol. pfenilendiamina
La reacción se da con el oxígeno del medio
Color :palo roza – marrón Tiempo en que se demoró para cambiar de color: 3 minutos
Sol. p-fenilendiamina
Sol. p-fenilendiamina
La p-fenilendiamina reacciona con el citocromo c oxidado y con el oxígeno del medio.
La p-fenilendiamina reacciona con el oxígeno del medio y con casi nada citocromo c oxidado. Debido a la presencia del inhibidor la reacción se hiso demasiado lenta
Sol. p-fenilendiamina
La p-fenilendiamina reacciona con el oxígeno del medio y con poco citocromo c oxidado. Debido a la presencia del inhibidor la reacción se hiso lenta
Color: azul-marrón oscuro
Color: marrón
Color : azul claro-marrón oscuro
Tiempo en que se demoró para cambiar de color: 4 minutos
Tiempo en que se demoró para cambiar de color a lo esperado que es azul: 30 minutos a más.
Tiempo en que se demoró para cambiar de color: 5 minutos.
Ensayo 4:
Inhibidor Malonato Ferricianuro de potasio 0.1M Cianuro de potasio 0.1M ++ Alta + media - baja
Inhibición de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa ++ + -
Figura 2. De izquierda a derecha: tubo 1 – control, tubo 2 y 3 – inhibición del malonato, tubo 4 y 5
–
inhibición del cianuro de
potasio, tubo 6 y 7 – inhibición del ferrocianuro de potasio.
Discusiones 1.
La lactato deshidrogenasa es una enzima que tiene una estructura cuaternaria tretamérica, resultante de la combinación de los monómeros H o M, que reciben esta denominación atendiendo a su localización preferente en el corazón (heart) o músculo (muscle). La LDH se encuentra ampliamente distribuida en el citoplasma celular de casi todos los tejidos, aunque es especialmente relevante su presencia en las células hepáticas. (4)
El seguimiento de reacción de esta enzima mediante la observación de la decoloración
de un indicador (azul de metileno) nos indica que existe mayor cantidad de LDH en el corazón (LDH1) que en el hígado (LDH5), contrastando este resultado con los resultados de electroforesis obtenidos en los trabajos de W ieland y Pflenderer (1961). 2.
En el tubo 1 tenemos la solución p-fenilendiamina, se utiliza principalmente como un
producto intermedio de colorante, y la solución buffer pH 7,4 que es para incrementar el volumen y darle el medio adecuado. La p-fenilendiamina es oxidada por el agente oxidante, que en este caso es el oxígeno que capta del medio por lo tanto transfiere electrones al oxígeno y éste se reduce. Esta reacción es lenta y reversible, por lo tanto es notable a medida de que sea mayor el tiempo de contacto de la p-fenillendiamina con el oxígeno ya que se intensifica el color de rosa palo a marrón. E n e l tubo 2 La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de sustancias como la p-fenilendiamina
en presencia del sistema de
citocromos. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros. La actividad del complejo citocromo c oxidasa es la de transferir un electrón de cada una de las moléculas de citocromo c al oxigeno molecular además contiene Cu el cual cambia su carga +2 a +1 en la reducción, el receptor final de electrones es el oxígeno. La subunidad II de la citocromo c oxidasa tiene un dominio grande que sobresale del lado citosolico de la membrana interna, en donde se une el citocromo c reducido para la transferencia de electrones. Los electrones se transfieren desde el citocromo c reducido al sitio CuA de la subunidad II y, a continuación, al hemo a de la subunidad I del complejo IV .Los electrones se transfieren a continuación al centro binuclear que está formado por CuB y hemo a3 en donde se produce la transferencia final de electrones al oxígeno.
La p-fenilendiamina son aminas aromáticas primarias, derivados diamino del benceno. La citocromo oxidasa no reacciona directamente con la p-fenilendiamina pero oxida el citocromo c, el que a su vez oxida al p-fenilendiamina. El compuesto básico de los reactivos, la fenilendiamina, es metilado. Cuando mas grupo metilados se introducen en el radical amino (NH2) el color es más azul; y si se introducen tres grupos fenilo en lugar del metilo, el color es aún más oscuro. En el tubo 3 empleamos el homogenizado de corazón, donde la presencia del complejo citocromo C oxidasa es mucho mayor, este complejo contiene moléculas de citocromo oxidasa (enzima) que tiene hierro hémico (a y a3) y además cobre. El hierro hémico en el citocromo cambia de +3 a +2, al ser reducido, el cianuro de sodio es sustancia altamente toxica, cuando entra en contacto con la enzima citocromo oxidasa actúa como tóxico a través de la inhibición del complejo citocromo oxidasa, el cianuro forma un complejo estable con la citocromo oxidasa, ya que tiene afinidad por el Fe ´+3; pero tiene más afinidad por la metahemoglobina que por la citocromo oxidasa y juntos forman (8,9)
cianometaglobina
. El cianuro actúa como un inhibidor de tipo no competitivo, la
citocromo oxidasa es una oxido-reductasa; y como tal, contiene hierro en su núcleo porfirínico, este hierro puede ser afectado por el cianuro(10). Produce un bloqueo en la función de los citocromos (complejo citocromo-citocromo oxidasa), el cianuro se une de manera covalente y bloquea el ingreso de O2 a nivel intracelular. El cianuro es transportado a los tejidos, al llegar a la célula penetra y se libera el cianuro. Este tipo de inhibidor puede actuar de dos formas, puede interactuar con la enzima o con el complejo enzima-sustrato, esta inhibición no puede ser superada. Esto se evidencia al no cambiar el color del p-fenilendiamina que es rosa palo a marrón. En el tubo 4 debido que presenta un inhibidor competitivo como es el malonato de sodio la reacción ya antes mencionada de la transferencia de electrones del citocromo c al oxigeno será más lenta debido a que
el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de la
enzima en el que también se une el citocromo c; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima disminuyendo su actividad es por eso que se tarda en cambiar de color. 3.
La succinato deshidrogenasa, una enzima del ácido cítrico que actua en la conversión de succinato a fumarato, es inhibida en forma competitiva por el malonato, que tiene una estructura similar al succinato
(11)
, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la
enzima, lo que genera la acumulación de succinato. La inhalación por o la ingestión de ácido cianhídrico gaseoso o cianuro de potasio produce una rápida inhibición de la cadena de transporte elctronico mitocondrial a nivel de la citocromo oxidasa.
(12)
El cianuro es un
inhibidor enzimático no específico (succinato deshidrogenasa, superóxido dismutasa, anhidrasa carbónica, citocromo oxidasa, etc.) inhibiendo su acción y de esta manera bloqueando la producción de ATP e induciendo hipoxia celular.
(13)
El seguimiento de la
inhibición de la enzima causada por las sustancias utilizadas nos corrobora que el
malonato es el que mejor inhibe a la succinato deshidrogenasa por encima del cianuro de potasio y ferrocianuro de potasio; sin embargo, se determinò que el ferrocianuro de potasio es mejor inhibidor que el cianuro de potasio, no encontrándose información que respalde tal efecto, abriendo camino a posteriores investigaciones con respecto al efecto entre aquellas dos sustancias.
Conclusiones: 1.
Se pudo identificar satisfactoriamente, mediante un análisis cualitativo, la actividad del lactato deshidrogenasa, en diferentes muestras de tej idos animales (Tejido hepático y cardíaco de res).
2.
En este ensayo pudimos concluir que el cianuro es un inhibidor no competitivo que se une a la Hb formando Cianohemoglobina, actúa en la Citocromo oxidasa en la mitocondria de las células, por lo que éstas no pueden c aptar O2 y hay Hipoxia, Anoxia y Acidosis láctica. Actúa a nivel IV (citocromo oxidasa). El malonato es un inhibidor y actúa a nivel
3.
Se determinó que el malonato tiene mayor inhibición que el cianuro y el ferricianuro. A su vez el ferricianuro tiene mayor act ividad inhibitoria que el cianuro. El malonato actúa a nivel de segundo complejo; el cianuro al nivel del c uarto, por lo cual determinamos que las actividades de inhibición entre el malonato y los compuestos de cianuro no son las mismas debido a que actúan en diferentes niveles de la cadena trasportadora de electrones.
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