UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIENCIAS CIENCIENCIAS DE LA VIDA Y AGROPECUARIA Ingeniería en Biotecnología BIOLOGÍA ANIMAL II Nombre: Cristian Roberto Benalcazar López Nrc: 4327 Fecha: 08 de Agosto del 2015
TEMA: Análisis Coproparasitario 1.- OBETIVOS 1.1 Obje Obj eti vo General General :
Analizar parásitos parásito s presentes en muestr muestras as de heces de animales domésticos mediante la técnica de Ritchie y de flotación. 1.2 Obj O bj etivos eti vos Especí Especí f i cos:
Realizar una adecuada muestra para la aplicación de los métodos Aprendidos en clases. Analizar las muestras haciendo uso de los protocolos establecidos. Comparar los dos métodos de análisis y determinar según los resultados obtenidos cuál de los ellos es el más confiable. Observar e identificar los microorganismos que existen en las muestras de heces usando como referencia las características de los microorganismos existentes en cada especie.
2.- MARCO TEORICO Actualmente las enteroparasitosis presentan en el mundo un importante problema de salud pública (Dra. Cabrera, 2013). La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que la ascaridiasis produce cuadros clínicos en 214 millones de personas a nivel mundial la tricocefalosis en 133 y las uncinarias en 96 millones. En el caso de los protozoarios enteroparásitos, sirven como ejemplo: la giardiasis con una incidencia de 500.000 nuevos casos anuales, así como la infección por Entamoeba histolytica que afecta aproximadamente a 50 millones de individuos. (Harada, 2008) Aunque la mortalidad producida por enteroparasitosis es baja, los números totales a nivel mundial, alcanzan altas cifras como 90.000 decesos para anquilostomiasis, 60.000 por ascaridiasis y 70.000 por amibiasis. Fuera de estos lamentables efectos, este grupo de afecciones motiva infecciones crónicas con efectos negativos e insidiosos en el crecimiento, nutrición y desarrollo psicofuncional de los ‘niños, con especial reper cusión
en niñas y mujeres. (García, 2006) El estudio en el laboratorio de muestras fecales de origen humano permite obtener datos con los cuales determinar la situación del funcionalismo digestivo, Infecciones intestinales causadas por bacterias, virus y hongos así como por parásitos intestinales o de órganos anejos. De estas posibilidades, el denominado Análisis Coprológico Parasitario se centra en la tercera; es decir, su objetivo es la detección, en un paciente concreto, de la existencia de parasitismo intestinal o de glándulas anejas, pudiéndose revelar también parasitismos localizados en órganos y sistemas muy alejados del intestino, siempre que los parásitos productores de los mismos empleen la vía fecal del hospedador para eliminar los elementos que le sirven para su diseminación por la naturaleza. El Análisis Coprológico Parasitario se basa en la identificación microscópica, en muestras fecales del sospechoso, de los elementos parasitarios presentes en ellas. Teniendo esto en cuenta, se puede decir que, con raras excepciones, un resultado analítico positivo siempre es indicación de existencia de parasitismo en el paciente. Pero, por el contrario, un resultado analítico negativo no descarta la posibilidad de parasitismo, ya que el propio método analítico conlleva la obtención, por causas diversas, de falsos resultados negativos. (García, 2006)
Entre las causas determinantes de falsos resultados negativos, existen algunas imputables a los propios métodos o técnicas operativas y otras que se deben a la propia biología de los parásitos cuya presencia se trata de demostrar. (Dra. Cabrera, 2013)
Toma de Muestras Para que la muestra recogida sea adecuada debe impedirse que el paciente ingiera medicamentos a base de carbón, sales de bario, magnesio, bismuto y purgantes oleosos Asimismo, debe recomendarse que unas 72 horas antes de la toma de muestra se reduzca en la dieta las féculas y verduras. Las heces deben recogerse en frascos de cierre hermético, limpios y secos, impidiendo la contaminación con orina, y deben ser remitidas en su totalidad al laboratorio. (Harada, 2008) Este examen debe realizarse en dos etapas sucesivas que comprenden:
1. Examen Macroscópico El análisis macroscópico deberá prestar especial atención a los siguientes aspectos: a) Consistencia fecal. b) Presencia de elementos no fecales. c) Presencia de parásitos y pseudoparásitos. Las heces pueden presentar consistencia homogénea o heterogénea. Esta peculiaridad debe indicarse en el informe final, pues puede ser la justificación de un falso resultado negativo. En efecto, unas heces líquidas, susceptibles de contener trofozoítos de protozoos, pero remitidas al laboratorio en condiciones inadecuadas serán la causa, casi segura, del resultado negativo. En las heces pueden aparecer elementos no fecales como moco o restos de tejido conjuntivo. (MV. Rodríguez Izaguirre, 2011)
2. Examen Microscópico En este apartado se consideran los métodos normalmente empleados para la detección de parásitos sólo microscópicamente visibles, utilizándose como muestra las porciones fecales reservadas durante el examen macroscópico. Si bien no existe ninguna técnica que permita detectar todas las formas de las distintas especies de parásitos intestinales, sí que deben seguirse une serie de pautas a la hora de la realización del examen microscópico. (Negrete Karen, 2011)
3.- EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS Muestras: Heces de bovino porcino y perro.
Equipos: Centrifugadora Microscopio.
Materiales de protección personal: Mandil guantes.
Reactivos: Lugol. Éter etílico Solución de formaldehído al 10%.
Materiales e insumos:
2 Vasos plásticos.
2 Gasas.
2 Palos de helado.
Agua destilada.
Solución glucosada o sulfato de Zinc.
1 Tubos de ensayo.
Pipetas Pasteur.
Porta y cubre objetos.
Organismos: Parásitos encontrados en las heces fecales.
4.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Método de Flotación 1) Manejar con cuidado las muestras antes de comenzar y tomando en cuenta el protocolo de bioseguridad. 2) En vaso de plástico colocar 1g de la muestra utilizando los palos de madera.
3) Añadir 10ml de agua destilada. 4) Mezclar la muestra hasta que la solución esté homogeneizada. 5) Filtrar las muestras usando las gasas bien colocadas en un segundo vaso de plástico. 6) La solución filtrada será traspasada a un tubo de ensayo el cual será taponado y centrifugado a 3500 rpm 7) Eliminar el sobrenadante. 8) Al precipitado agregar una solución glucosada hasta que forme un menisco ayudándose por una pipeta pasteur. 9) Se coloca encima del tubo de ensayo un cubreobjetos observando que este se encuentre en contacto con la solución. 10) Esperar 10 minutos. 11) En un portaobjetos colocar una gota de lugol y una gota de agua destilada. 12) Retirar con cuidado los cubreobjetos del tubo y colocarlos sobre el portaobjetos. 13) Observar en el microscopio con lentes 10x y 40x. 14) Anotar resultados.
Método de Ritchie 1) Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. De la materia fecal en el vaso de plástico, se añaden 10 ml de agua destilada. 2) Homogenizar la solución. 3) En un segundo plástico filtrar la solución con la ayuda de las gasas. 4) Traspasar el filtrado al tubo de ensayo. 5) Centrifugar por 5 minutos a 3500 rpm. 6) Se decanta el sobrenadante. 7) Se agregan 10 mL de formaldehído al 10% y 5 mL de éter etílico. 8) Se agita energéticamente hasta que la mezcla sea homogenizada. 9) Se centrifuga por 5 minutos a 3500 rpm. 10) Después de centrifugar se observan 4 capas. a) Éter en la superficie. b) Un tapón de restos fecales. c) Formaldehido. d) Sedimento de elementos parasitarios. 11) Se elimina las tres primeras capas decantando. 12) En un portaobjetos se pone una gota de lugol y una gota de agua destilada. 13) Se introduce la pipeta Pasteur, se extrae con cuidado una gota del sedimento. 14) Se coloca la gota del sedimento en el portaobjetos donde se encuentra la gota del lugol y posteriormente en la gota de agua. 15) Se cubre con el cubreobjetos. 16) Se observa en el microscopio con objetivos de 10x y 40x. 17) Se anotan los resultados de la observación.
5.- RESULTADOS
Análisis de muestra de heces de perro
Muestra de perro en dilución con agua.
Centrifugación de las muestras
Eliminación del sobrenadante.
Solución homogénea de muestra de perro
Solución saturada de sacarosa (550ml)
Agregación de la dilución a un tubo de ensayo
Filtración de la gasa
Adición de sacarosa al sedimento.
Procedimiento de la muestra de heces perro para la observación de sus parásitos. Fotos tomadas por: Sofía Ocaña
Muestras de cerdo Primer método
Muestra de cerdo diluida en agua.
Muestra con lugol.
Filtración de la muestra diluida.
Colocación de la dilución en un tubo.
Muestra sin lugol.
Muestra luego de ser centrifugada.
Procedimiento de la muestra de heces cerdo para la observación de sus parásitos. Fotos tomadas por: Tania Pachacama
Muestras de cerdo Primer método
Adición de formol a la muestra.
Centrifugación de la muestra
Muestra con formol y éter
Agitación de la solución seguida por centrifugación
Procedimiento de la muestra de heces cerdo para la observación de sus parásitos. Fotos tomadas por: Tania Pachacama
Muestras de vaca
Muestra diluida con 100ml de agua.
Filtración de la muestra diluida con una gasa.
Muestra sin lugol
Muestra con lugol
Disolución en tubo de ensayo.
Procedimiento de la muestra de heces vaca para la observación de sus parásitos. Fotos tomadas por: Paul Romero
Muestras de la gallina
Muestra diluida en agua.
Filtración de la muestra.
Muestra centrifugada
Muestra colocada en un tubo de ensayo.
Procedimiento de la muestra de heces de la gallina para la observación de sus parásitos. Fotos tomadas por: Andrea Pumisacho
REPORTE DE RESULTADOS OBSERVADOS EN EL MICROSCOPIO: Muestras de perro Fibras de restos de alimento
Muestras de vaca
Muestras de vaca con Huevo operculado de
Fasciola hepática
Residuos vegetales
Muestra identificada con el lente de 40 X
Observación Presenta una forma ovalada No hay presencia de división celular Presenta un cubierta fina Color marrón Sin presencia de opérculos, espículas, tapones.
6. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En esta práctica se realizó el análisis Coproparasitario de muestras con el objetivo de analizar las muestras de perro, gallina, cerdo y vaca las cuales se sospechaban tener infecciones parasitarias. Según la bibliografía revisada se esperaba encontrar huevos de protozoos y helmintos los cuales son los más comunes en este tipo de mamíferos. Según la Universidad de Madrid (2002), el examen coprológico consiste en el estudio de las formas parasíticas eliminadas con las heces, sean estos huevos, larvas o adultos. Su observación se ve influenciada por varios factores que derivan del propio parasito como el sexo, número de ejemplares, edad, momento de ciclo biológico, etc., del hospedador depende mucho el estado inmunitario, mediación, alimentación recibida, etc., y de la propia técnica de recolección o el proceso de la muestra. (Negrete Karen, 2011) Los animales
tanto silvestres como domésticos están expuestos a numerosos
microorganismos tales como bacterias, virus, Rickettsias, micoplasmas, clamidias, hongos y parásitos. Los parasitos gastrointestinales son generalmente producidas por helmintos (nematodos, cestodos) y protozoarios. (Curtis, Schnek, 2008) Cuando los parásitos se alojan en el aparato digestivo, una proporción de ellos, o las larvas, o los huevos son eliminados con las heces. Como la cantidad que se elimina en cada defecación puede ser variable, y si hay poco número de parásitos en el intestino, lógicamente también serán escasos en las muestras que se tomen, no siempre que una muestra sale negativa se puede descartar la infección. Por esta razón se toman entre dos a tres muestras de heces, en días distintos. De esta manera es más segura la infección. (Negrete Karen, 2011) Para la identificación de las muestras atraves del método de flotación se utilizó una solución de sacarosa que tuvo una densidad de 1.25-1.27 g/ml (Sixtos, 2012). El método de flotación se deja en reposo entre (15-20) min los líquidos pueden impregnar los huevos y estos tienden a caer al fondo, mientras que en el procedimiento mencionado por Sixtos, (2012) lo factible es de (10-20) min, lo que estos dos conceptos justifican la ausencia de parásitos en la práctica. Desacuerdo a las características morfológicas y la presencia en estos tipos de rumiantes, se presume que es un trematodo platelminto que afecta a la mayoría de los mamíferos denominado fasciola hepática en estadio de huevo. (Junquera, 2015)
Fasciolosis es una zoonosis causada por el trematodo Fasciola hepática, que afecta a animales vertebrados herbívoros (vacas, ovejas, cabras, entre otros) y a humanos. La infección se adquiere debido a la ingesta de diversos vegetales acuáticos crudos, algunos terrestres, o agua contaminados con metacercarias, la forma infectante. (Junquera, 2015)
7.- CONCLUSIONES
Mediante el adecuado uso de los protocolos establecidos se analizó las tres muestras de heces, es importante, ya que se evita la contaminación con parasitos del medio en el que nos rodeaba, así como para un mayor diagnostico en las muestras analizadas .
Desacuerdo a la bibliografía de resultados obtenidos entre las dos técnicas se podría decir Ritchie es más efectiva, pero debido a falta de parasitos en las muestras no puedo concluir mucho al respecto.
Se logró identificar un posible huevo de parasito en una muestra de vaca utilizando el método de flotación sin lugol, por lo que se determina que el animal tiene una infestación ligera de fasciola hepática.
En las muestras de gallina, cerdo y perro no se logró distinguir ningún tipo de parasitos
9. CUESTIONARIO: 1.
Enumere los factores de los cuales depende la presencia de parásitos en una muestra
Hay varios factores de los que depende de la cantidad de muestra usada si se usan métodos como la observación directa no se verán muchos, pero si se recurre métodos de concentración aumentan las posibilidades de presencia de parasitos en la muestras. (Ausina, 2006) Entre los más comunes tenemos:
Infestación directa y grave del animal por uno o más parasitos Ingestión de medicamentos previo a la recolección de las muestras Las medidas de higiene ya que la muestra puede contagiarse de parasitos o bacterias que se encuentran en el medio
2.
Tiempo de transporte de la muestra al laboratorio, pues debe ser en un mínimo de tiempo. Muestras almacenadas y conservadas de manera inapropiada
Investigue ¿por qué es mejor el método de Ritchie?
Porque esta técnica se la realiza en dos fases sucesivas partiendo de un volumen de heces, para despreciar los restos vegetales y grasas, que pueden interferir en la visualización microscópica este método se asocia la metodología física con la acción disolvente de reactivos químicos, es rápido y de fácil ejecución (Ausina, 2006). Unas ventajas que tiene este método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permitiendo el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para determinación de frecuencia y evaluación de tratamiento (García, 2006) 3.
Investigue a fondo sobre las complicaciones causadas por uno de los parásitos encontrados en las muestras de la práctica.
La paramfistomiasis es una enfermedad parasitaria, ocasionado por trematodos de la familia Paramphistomidae, afectando al tracto digestivo de los rumiantes domésticos como lo son los bovinos, estos alteran la digestión la utilización de los alimentos, produciendo bajas notorias en la productividad lo cual refleja perdidas económicas. La fasciola hepática, un gusano trematodo, causa mayor daño en su estadio juvenil cuando esta emigra a través del tejido hepático para penetrar en los conductos hepáticos destruyendo tejidos del hígado y provocando hemorragias, la inflamación de los tejidos provoca fibrosis, anemia, hipoproteinemia, edema, emaciación y muerte celular. (Junquera, 2015).
Bibliografía Ausina, V. &. (2006). Tratado SEIMC de enfermedades infecciosas y microbiología clínica. Madrid, España: Ed. Médica Panamericana. Dra. Cabrera, M. J. (2013). Métodos de estudio de las enteroparasitosis. México DC.
García, P. F. (2006). Microbiología Clínca Práctica. Cádiz: Imprenta Repeto. Harada, C. (28 de Junio de 2008). MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR SEDIMENTACIÓN RITCHIE. Obtenido de Parasitología General: https://para1.wordpress.com/2008/06/21/metodo-de-concentracion-por-sedimentacionritchie/ Junquera, P. (27 de june de 2015). Fasciola hepática o duela del hígado. Retrieved. Obtenido de http://parasitipedia.net/index.php?option=com_content&view=article&id=190&Itemid= 278 MV. Rodríguez Izaguirre, L. A. (2011). La Paramfistomiasis y su tratamiento. lima: Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Negrete Karen, P. (. (12 de Diciembre de 2011). Parasitología Veterinaria, Técnicas de diagnóstico coprológico. Obtenido de Bacteriología-Blogspot: http://karenpaterninanegrete.blogspot.com/2011/12/parasitologia-veterinaria-tecnicasde.html
