Año del Diálogo y la Reconciliación Nacional
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA
INFORME N°01
TECNICA PARA LA EXTRACCION DE SANGRE EN HUMANO, AVE Y CONEJO
Curso:
Bioquímica
Integrantes:
Aguilar Rivera Larry Stewar Chumacero Agramonte Alexandra Carolina Espinoza Vinces José Ignacio Pighi Mogollon Adriana Yvette
Profesor: Blgo. Henry Robles Cueva.
Fecha:
24/10/2018
I.
INTRDUCCION Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten, desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas (Granados, 2014). Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (V0) y la concentración inicial de sustrato ([S], Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre (Granados, 2014). La ecuación de Michaelis-Menten es capaz de describir el cambio sufrido por la velocidad de una reacción catalizada por una enzima al variar la concentración del sustrato. La reacción que se establece entre la enzima y su sustrato va precedida de la formación de un complejo, hipótesis que no pudo comprobarse experimentalmente hasta cincuenta años después del establecimiento de la ecuación gracias a la aplicación de las técnicas espectroscópicas (López & García, 2015). La constante de K m de Michaelis es la concentración de sustrato a la cual velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima (Vmax/2) alcanzable a una concentración particular de enzima. De este modo, K m tiene las dimensiones de la concentración de sustrato (Rodwell, Bender, Botham, Kennelly, & Weil, 2016). La constante de Michaelis (K m) caracteriza la afinidad de la enzima por su sustrato [A], a la cual v alcanza la mitad de la velocidad máxima. Una alta afinidad de la encima por el sustrato significa que el valor de K m es bajo y a la inversa (Koolman & Rohm, 2003). Michaelis determinó la denominada constante de Michaelis (Km) que establece la afinidad entre una enzima y su sustrato. Predijo y explicó la velocidad de reacción, es decir la cantidad de sustrato que reacciona con la enzima por unidad de tiempo, así como los factores que estimulan o inhiben dicha velocidad de reacción. Demostró que las sucesivas adiciones de sustrato al medio de la reacción provocan un abrupto incremento de la velocidad de reacción hasta un cierto punto en el que la enzima se satura y la adición posterior de sustrato ya no afecta a la velocidad; es el momento en el que se alcanza la velocidad máxima de reacción (Vmax). El objetivo de la presenta práctica fue estudiar la influencia de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática.
II. MATERIAL Y MÉTODO a) Para la primera muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de Reactivo de Trabajo para luego añadirle 10 ul de Glucosa con la ay uda de una micropipeta, se incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó al Espectrofotómetro para observar su absorbancia. b) Para la segunda muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de Reactivo de Trabajo para luego añadirle 20 ul de Glucosa con la ayuda de una micropipeta, se incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó al Espectrofotómetro para observar su absorbancia.
c)
Para la tercera muestra a un tubo de ensayo se le agregó con una pipeta, 1 ml de Reactivo de Trabajo para luego añadirle 30 ul de Glucosa con la ayuda de una micropipeta, se incubó a 37°C por 10 minutos. Después del tiempo estimado se llevó al Espectrofotómetro para observar su absorbancia.
El filtro fue de 505 nm para la lectura del fotocolorímetro. Para el cálculo de la concentración de la glucosa se realizó con la siguiente ecuación:
[ ] = × Donde “F” equivale 200mg/dl. Al Obtener los resultados se colocaron en un gráfico para obtener el Km por medio de la siguiente ecuación: = 2
III. RESULTADO a)
Primer Tubo de Ensayo Cálculo:
[] = × [ ] = 200 × 0,44 [ ] = 88 / b)
Segundo Tubo de Ensayo Cálculo:
[ ] = × [] = 200 × 0,52
[ ] = 104 /
c)
Tercer Tubo de Ensayo Cálculo:
[ ] = × [ ] = 200 × 0,57 [] = 114 / d)
Cálculo de K m =
=
2 0,6
2 = 0,3
Fig. 1: Cálculo de K m.
IV. DISCUSIÓN Según el autor Mathews (1992) nos expresa que el valor de un Km de una enzima para un sustrato específico es la concentración del sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima y que la Vmax es la velocidad teórica máxima de la reacción es catalizada por la enzima. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad máxima de la reacción, pero nunca se llega a ésta. Según Los valores de Km y Vmax son característicos de una enzima, y se conocen como parámetros cinéticos de la enzima. Aunque son constantes, dependen de las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción, ya que hay que recordar que la enzima es una proteína cuya estructura y carga eléctrica se modifican cuando los componentes de la solución cambian. Según lo Observado y determinado en la práctica, un sustrato va a ser una molécula sobre la cual va actuar una enzima. Mediante crezca la concentración de sustrato, la velocidad de la reacción aumentará debido al aumento de la probabilidad de formación de complejos enzima-sustrato. El km es la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuanto mayor es Km menor es la afinidad ( donde predominan las formas Enzima y Sustrato libres), cuanto menor es Km mayor es la afinidad (predomina la forma Enzima - Sustrato). En cuanto a la velocidad máxima (Vmáx) se va a estimar el número de centros activos del enzima es decir al aumentar la concentración de sustrato, la actividad enzimática aumenta, hasta alcanzar la velocidad máxima, punto donde la enzima se satura, debido a que las enzimas tienen todos sus sitios activos ocupados Según UNAM (2015) La velocidad inicial de una reacción es la velocidad medida antes de que se haya formado suficiente producto para permitir que la reacción inversa ocurra. Además, la velocidad inicial de una reacción enzimática es siempre proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de sustrato. La velocidad de transformación de los sustratos de una reacción en los correspondientes productos, mediante una enzima y bajo condiciones de estado estacionario, es dependiente tanto de las concentraciones de la enzima como de los sustratos. Normalmente esa dependencia puede ser expresada matemáticamente por la ecuación de Michaelis-Menten. En esta práctica se observó, mediante una gráfica trazada con los datos obtenidos, que la actividad catalítica de una enzima se determina midiendo la velocidad inicial de la reacción, debido a que la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente es proporcional a la cantidad de enzima. Luego la reacción transcurre linealmente y deja de ser lineal (curva) por lo tanto a concentración de sustrato llega a su equilibrio.
V. CONCLUSIÓN En el primer tubo de ensayo hubo una absorbancia de 0.44 y una concentración de glucosa de 88 mg/dl, mientras que el segundo tuvo una absorbancia de 0.52 y una concentración de 104 mg/dl y por últi mo el tercero con una absorbancia de 0.57 y una concentración de 114 mg/dl. La reacción tuvo una velocidad máxima = 0.6 y un Km= 0.3. De esto se obtiene que cuando la enzima se satura por el aumento del sustrato, no se va a producir producto, llegando a su velocidad máxima.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Granados, J. (2014). Cinética Enzimática. Colombia: Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Koolman, J., & Rohm, K. (2003). Bioquimica: Texto y Atlas. Madrid: Editorial Medica Panamericana. López , J., & García, F. (2015). Los Cuatro Mosqueteros de la Cinética Enzimática. Eubacteria, 40. Mathews, C. (1992). Bioquimica. McGraw-Hill. Rodwell, V., Bender, D., Botham, K., Kennelly, P., & Wei l, P. (2016). Bioquimica Ilustrada. Mexico: McGraawHill. UNAM. (2015). Efecto de la Concentración de una Enzima.
VII.
ANEXOS
Fig. 2: Tubos de ensayo con Glucosa y Glucosa oxidasa.
Fig. 3: Absorbancia obtenida en el espectrofotómetro.
