Inf 4 - 5 Ensayos de Preparacion de Meristemos

INFORME DE LABORATORIO No. 5 “CULTIVO DE YEMAS Y MERISTEMOS, VÍA ORGANOGÉNESIS DIRECTA. ESTABLECIMIENTO DE ROSAS Y PIÑA”

Becerra Francisco 1, Díaz Mayari 2 , Pineda Bryan 1610684 1,1610584 2 , 1610864 3 Biotecnología vegetal, Msc. Alina Sigarroa Rieche.

Resumen Con el objetivo de generar destreza en la extracción de meristemos en especies de interés por sus cualidades de propagación, se realizó este practica de laboratorio; inicialmente realizamos una práctica de ensayo en la que practicamos la extracción en piña y rosa; con especies de clavel y caña no se hizo el procedimiento porque no fue posible encontrar buen material para practicar. Posteriormente hicimos la practica real sembrando en medios MS en cabina de flujo laminar llevando a cabo los respectivos procedimientos de desinfección y finalmente la evaluación del crecimiento en cada uno de los frascos cultivados

Palabras clave: Meristemos, extracción, primordios, yemas, organogénesis directa.

INTRODUCCIÓN La organogénesis directa en términos generales es la formación de un primordio unipolar a partir de una yema con el subsecuente desarrollo de este en un brote vegetativo, existiendo siempre una conexión entre los nuevos brotes y el tejido madre. Estos brotes vegetativos son posteriormente puestos a enraizar en otra etapa, vía formación de primordios de raíces y el subsecuente enraizamiento final. Se produce una formación directa de órganos sobre la superficie del medio a partir de un explante tipo yema o meristemo sin que sea necesaria la inducción de callos, con esto se reduce la probabilidad

de que se presente variación de algún tipo, sobre toso variaciones somaclonales por la sucesiva división celular a la que se someten en procedimientos de formación de callos.

Imag Imag en 1: reg eneración eneración veg etal etal vía org anogénes nogénes is directa directa.

Facultad de ciencias agrarias y del ambiente Ingeniería Biotecnológica 2015


Con la organogénesis se conduce a la diferenciación de meritemos que originarán tallos o raíces adventicias, respectivamente, hay que regenerar la planta (organogénesis). Cojo yemas auxiliares, para conseguir una planta clónica. Es un proceso rápido, muy útil para plantas de mucho valor (sólo se obtiene tantas plantas como yemas hay). Estas yemas en un medio adecuado dan tallos. A continuación describimos el procedimiento realizado desde la extracción de los meristemos de piña y la obtención de las yemas de rosa hasta la siembra en medios de cultivo y finalmente la evaluación de crecimiento que se presentó tras haber hecho la siembra, identificando viabilidad y frascos contaminados.

OBJETIVOS

En términos generales el procedimiento a que se llevó a cabo fue:

Piña Quitarle a las coronas de piña las hojas. Cortar las coronas hasta que queden en cubos de dos centímetros con las últimas hojas de la corona. Colocar los cubos de piña en el estereoscopio y con la ayuda de una aguja quitar las últimas hojas hasta llegar al meristemo.

Rosa Cortar los tallos de rosa en fragmentos en donde se encuentres los meristemos. Llevar los fragmentos al estereoscopio. Quitar los primordios foliares, hasta llegar al meristemo.

Fase preparativa

Dominar la etapa I ó fase de establecimiento de rosas y de piña, vía Organogénesis Directa, mediante el cultivo de yemas y meristemos.

Se escogieron las yemas de rosa y se separaron los segmentos con yemas axilares, se sumergieron en solución antioxidante.

Continuar adquiriendo habilidades en el trabajo de cultivo de tejidos, especialmente en siembra de material vegetal.

Se limpió y rebano los cogollos de piña al tiempo que se iban preparando las soluciones desinfectantes Llevamos desinfección continuación:

a cabo el como se

proceso describe

de a

MATERIALES Y METODOS Des infecci ón de yemas de ros a

Instrumentos de disección Fragmentos de tallos de rosas que  Área no estéril contengan yemas axilares de tamaño 5 minutos en la solución jabonosa. grande. Enjuagamos 3 veces con agua destilada estéril. Cogollos de piña. Papel Aluminio Facultad de ciencias agrarias y del ambiente Ingeniería Biotecnológica 2015




Área estéril

RESULTADOS

5 minutos en la solución de alcohol al 70 %. Enjuagamos 3 veces con agua destilada estéril. 8 minutos en la solución de hipoclorito de Sodio al 3 % 

Cabina de flujo laminar

Enjuague 3 veces con agua destilada estéril

Desinfección de yemas de piña 

Área no estéril

5 minutos en la solución jabonosa Enjuagamos 3 veces con agua destilada estéril 

Área estéril

Corona de piña con las hojas del centro

5 minutos en la solución de alcohol al 70 %. Enjuagamos 3 veces con agua destilada estéril. 6 minutos en la solución de hipoclorito de Sodio al 3 %. 

Cabina de flujo laminar

Enjuague 3 veces con agua destilada estéril

Fase de establecimiento Dentro de la cabina de flujo laminar, con la ayuda de los instrumentos de disección, y sobre papel estéril, hicimos la disección de la yema y la obtención del meristemo, cortamos y sembramos en el medio de cultivo apropiado para cada especie vegetal. Finalmente cerramos los frascos con aluminio y envoplast, rotulamos y dejamos incubando.


Ultimas Hojas, listo para llevar al estéreo, terminar de limpiar y sembrar.

Meristemo de piña observado en el estéreoscopio.


Primordio rosal Frascos sembrados con yemas de rosa y meristemos de piña.

Fragmentos de rosa en el estereosco io.

Cultivo de explantes Primera semana

Frasco

Contaminación End. Exo.

Muerte por desinfección

Crecimiento

Observaciones

Yemas de rosa 1

-

-

-

-

Ligera Fenolización

2

-

-

-

-

Ligera Fenolización

3

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

4 1

Meristemos de piña -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Se observan puntos claros en el medio

2 3 4



Segunda semana

Frasco 1



Crecimiento

Yemas de rosa -

-

-

-

-

-

-

-

2 3

-

-

-

Yemas más verdes

-

-

-

4

2 3 4

La Fenolización disminuye La Fenolización disminuye

-

1

Observaciones

Yemas más verdes

Meristemos de piña -

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

X

-

-

Descarte


Crecimiento

Observaciones

Tercera semana

Frasco


Yemas de rosa 1

-

-

-

X

Se observan brotes foliares

2

-

-

-

X


3

-

-

-

X


4

-

-

-

X




Meristemos de piña 1

-

-

-

-

No hay crecimiento

2

-

-

-

-

No hay crecimiento

3

-

-

-

-

No hay crecimiento


Crecimiento

Observaciones

Cuarta semana

Frasco


Yemas de rosa 1

-

-

-

X


2

-

-

-

X


3

-

-

-

X


4

-

-

-

X


Meristemos de piña 1

-

-

X

-

Descarte

2

-

-

X

-

Descarte

3

-

-

X

-

Descarte



Vi troplantas de ros a a las dos s emanas de habers e s embrado y meri s temos de piña s in crec imiento.

DISCUSIONES

CONCLUSIONES

La regeneración vía organogénesis directa que se llevó a cabo nos permitió obtener plantas completas de rosa a partir de yemas seleccionadas de tallos de las mismas; por el lado de la piña, no fue posible obtener crecimiento de la vitroplanta porque creemos hubo algún error en el proceso de desinfección ya que ninguno de los cuatro frascos presento crecimiento.

Con esta práctica de laboratorio logramos aprender la extracción de meristemos de Piña y Rosa para obtener material listo para propagar en medios de cultivo; también logramos dilucidar lo complejo que es hacer la extracción y la importancia de estar concentrado y dispuesto a realizar las cosas de la mejor manera ya que exigen bastante destreza y práctica.

Respecto a la contaminación, el protocolo que realizamos fue muy bueno ya que solo un frasco de piña (N4) presento contaminación exógena, los demás frascos sembrados no presentaron contaminación pero tampoco exhibieron crecimiento; el motivo aparente es que hubo algún error en el proceso de desinfección, probablemente nos excedimos en el tiempo de aplicación de algún desinfectante y por ello los meristemos perdieron su viabilidad.

Los explantes tomados de plantas jóvenes o zonas de crecimiento activas tienen un mejor desarrollo que aquellos tomados de plantas adultas o yemas en reposo. A medida de que es más joven y menos diferenciado el tejido que se va a implantar, mejor será la respuesta “in vitro”.

El estado de desarrollo de la planta madre y la edad fisiológica del explante, así como su tamaño, son de gran influencia en el éxito del cultivo “in vitro”.(Hernández, 1997).

El tamaño del explante es un factor importante que influye en la desinfección y regeneración de plantas, a medida que el explante es más



pequeño es menor el riesgo de contaminación y más fácil la regeneración, mientras que con el aumento del tamaño del explante es mayor el peligro de contaminación.

CUESTIONARIO 1. Por

qué se suele utilizar tejido meristemático como explante inicial en los cultivos “in vitro”? Justifique ampliamente su respuesta. Se utiliza este tipo tejido debido a que en este hay células con alto potencial totipotente, las cuales pueden dar origen una planta completa a través de la organogénesis directa, sin la formación de callo; las plantas que se obtienen son idénticas genéticamente a la planta madre; también porque este tejido se encuentra bastante protegido y por tanto existe menos riesgo de contaminación.

3. Enumere

las características (anatómicas y fisiológicas) principales de las células que conforman este tipo de tejido vegetal. Las células son pequeñas y regulares. con pequeñas vacuolas presentan un núcleo grande pared celular muy fina que les permite dividirse continuamente, dando células superiores aún embrionarias y células inferiores que se diferencian en los distintos tejidos de la planta según su posición.

De esta forma, la crecimiento continuo.

planta

tiene

un

MERISTEMOS PRIMARIOS

proviene directamente de células TOTIPOTENTES.

MERISTEMOS APICALES

2. Cuál es la función principal de este

MERISTEMOS INTERCALARES

tejido en la planta PROTODERMIS

El tejido meristematico tiene como función dividirse para formar los tejidos adultos diferenciados de la planta y formar otras células meristematicas. También tiene como función producir el crecimiento longitudinal y lateral del organismo vegetal; también es impórtate en la regeneración de la planta.

PROCAMBIUM Da origen a la EPIDERMIS Forma tejidos conductores primarios


MERISTEMO FUNDAMENTAL

da lugar al resto de tejidos.


MERISTEMOS SECUNDARIOS

se origina a partir de células diferenciadas que conservan su capacidad de división. (PLURIPOTENTES)

CAMBIUM VASCULAR

https://sites.google.com/site/botanic afesi/i--meristemas-y-tejidossecundarios



FELOGENO

responsable del crecimiento secundario en grosor de los tallos

Tejidos meristematicos, botanicafesi, meristemos y tejidos secundarios, consultado noviembre de 2015, disponible en:

Origina la PERIDERMIS

Propagación a través de yemas, Propagación de plantas por cultivo in vitro: una Biotecnología que nos acompaña hace mucho tiempo, inia.org.uy, consultado noviembre de 2015, disponible en: www.inia.org.uy/publicaciones/docu mentos/lb/ad/2004/ad_382.pdf+PRO PAGACION+YEMAS+ROSA+IN+VIT RO&hl=es&ct=clnk&cd=3&gl=co&lr=l ang_es 

BIBLIOGRAFÍA SIGARROA, Alina. Guías de laboratorio de biotecnología vegetal. Universidad Francisco de Paula Santander.

Pérez Ponce, J.N. Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Volumen 1. 1988

Producción de vitroplantas, establecimiento de cultivos de tejidos vegetales in vitro, exa.unne.edu.ar, consultado noviembre de 2015, disponible en:



http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologi a.vegetal/Cultivo%20de%20Tejidos%2 0en%20la%20Agricultura/capitulo2.pdf

Libro fisiología vegetal vol. 2 Lincon Taiz, & Eduardo Zeiger. Pag. 656 Gutiérrez Martha, tejido meristematicas, todo sobre los meristemos vegetales, consultado noviembre de 2015; disponible en: http://slideplayer.es/slide/130198/

Propagación de rosa, el cultivo de rosas y su propagación, redalyc.org, consultado noviembre de 2015, disponible en: http://www.redalyc.org/pdf/1932/19321 7832008.pd 





ANEXO: CUESTIONARIO PRACTICA 5 1. ¿Cuáles son las condiciones ambientales que deben ser reguladas para el crecimiento de los explantes sembrados? Las condiciones ambientales a tener en cuenta son:

Medio de cultivo: Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta: sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir ni in vitro ni in vivo. También se debe añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones.

pH El pH final del medio de cultivo es un factor importante por diversas razones: 

Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificación de los agentes gelificantes añadidos a los medios sólidos• Si la evolución del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5 se puede producir su licuación.



El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos componentes del medio de cultivo



El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados nutrientes por parte del explante ( la absorción de iones NO3-aumenta con la acidez del medio)



El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y como consecuencia a la actividad de muchos enzimas

Por todas estas razones conviene optimizar el pH del medio para cada caso en concreto. En general, no obstante, en la mayoría de situaciones se trabaja a pH entre 5.2 y 5.8.

La temperatura El control de la temperatura no es solamente importante porque pueda afectar al crecimiento del cultivo sino también porque puede ser un factor que induzca determinados procesos fisiológicos. Así, temperaturas bajas (del orden de 4-50C) permiten superar los periodos de Facultad de ciencias agrarias y del ambiente Ingeniería Biotecnológica 2015


dormición de algunas leñosas y la conservación prolongada de determinados cultivos in vitro; mientras que una temperatura constante de 200 C induce la formación de raíces en la mayoría de coníferas.

La luz La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los cultivos in vitro. Los aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos in vitro son:   

La cantidad de luz: la irradiación La calidad de la luz: El espectro La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: el fotoperiodo

Detalle en qué condiciones quedaron creciendo los explantes que usted sembró: 

 

Crecieron en medio sólido que incluye sales inorgánicas, carbohidratos y vitaminas y aminoácidos. A menudo se denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento. Con un fotoperiodo de 16 horas luz y 4 horas oscuridad. Una temperatura de 22 °C máxima y 12 °C mínima.

2. ¿Qué tipo de crecimiento debe esperarse de acuerdo al explante usado y a la composición del medio del cultivo? (Señale la composición del medio utilizado). Que factores podrían afectar ese crecimiento. 

De acuerdo al explante se debe esperar la formación de tallos.

Los factores que afectan el crecimiento son.     

Contaminación del medio Contaminación endógena El tamaño del explante El origen del explante. Mal manejo del protocolo de desinfección.



composición del medio MS

3. Proponga y elabore un esquema o diagrama con todo el proceso de micropropagación de rosas, a partir de yemas axilares. Especifique, por separado, medios de cultivo, métodos de desinfección, condiciones ambientales de crecimiento y otros factores que considere de interés particular, en cada fasede la propagación.

FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE 

Es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo, en un invernadero, en condiciones sanitarias óptimas



Se toman las inflorescencias jóvenes que sirven de explantes



Se separan las yemas axilares y se sumergen en solución antioxidante



FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIA    

Se hace la desinfección de las yemas Se lavan con agua y jabón azul Se sumergen en una solución de hipoclorito de sodio comercial, a una concentración final del 1%, bajo la acción de una bomba de vacío por 15 min Se trasladan a la cámara de flujo laminar donde se lavan tres veces con agua destilada estéril.

El material así preparado se corta en segmentos de 1 cm aproximadamente, los cuales se sumergen rápidamente en una solución de alcohol al 70% y luego se siembran en en el medio de cultivo MS.

FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES 

(Medio de cultivo)Para la determinación del medio nutritivo adecuado en el establecimiento del cultivo se realizan pruebas usando las sales MURASHIGE y SKOOG (1962) (MS), suplementadas con tiamina 0,4 mg/l, mioinositol 100 mg/l, sacarosa (30 g/l). Así mismo se puede probar diferentes combinaciones de sustancias de crecimiento (benciladenina BA, ácido naftalenoacético ANA, ácido 2,4 diclorofenoxiacético 2,4-D).  Para el desarrollo de los brotes se empleó el medio MS suplementado con combinaciones de BA y ANA

FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTES  

En la etapa de enraizamiento se utilizaron medios libres de sustancias de crecimiento con sacarosa 20 y 30 g/l. Para el desarrollo de los brotes, los cultivos se transfirieron a medio fresco y la incubación fue realizada bajo luz continua (5 000 lux) a temperatura de 27 ± 1oC.

5 FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTES ENRAIZADOS 

La aclimatación en condiciones de vivero se realiza utilizando como sustrato una mezcla de suelo y turba en una proporción 1:1 y abonada con un fertilizante comercial, de fórmula NPK(15-15-15).


Inf 4 - 5 Ensayos de Preparacion de Meristemos

Recommend Documents