Cultivo de meristemos. Técnica de cultivo que consiste en aislar asépticamente la región meristemática con 1-3 de los primordios foliares más jóvenes e implantarla en un medio de cultivo estéril, con el propósito de inducir la diferenciación de células y tejidos en plantas completas, mediante la utilización de medios de cultivos adecuados.
Generalidades En multitud de especies cuyo método de propagación habitual es de tipo vegetativo e incluso en algunas cuya propagación es por semilla, se encuentran problemas de contaminación por diversos microorganismos, que los métodos tradicionales de desinfección utilizados por los propagadores y viveristas no consiguen erradicar, ni siquiera mediante tratamientos químicos agresivos, esto conlleva una serie de pérdidas económicas por pérdidas de producción, de calidad de fruto y hasta de cosechas completas. Incluso utilizando técnicas de cultivo in vitro es a veces imposible eliminar a determinados organismos patógenos, como virus, micoplasmas, bacterias y hongos endógenos, algunos de los cuales se transmiten incluso vía semillas, y ante los cuales muchas veces son ineficaces los antibióticos, bactericidas y antivíricos añadidos a los medios de cultivo.
Método de saneamiento La técnica de cultivo in vitro de meristemos, como método de saneamiento, se fundamenta en la distribución no uniforme de los microorganismos (virus, bacterias, micoplasmas) en los tejidos de las plantas infectadas, y su disminución progresiva hacia el ápice del tallo. Por tanto, son mayores las posibilidades que las células del meristemo apical se encuentren libres de microorganismos, a diferencia de los tejidos más organizados de las plantas. Desde que Morel y Martin (1955) mostraron la posibilidad de regenerar clones de papa (Solanum tuberosum L), libres de virus, mediante el cultivo in vitro de meristemos, varios trabajos han confirmado la existencia de esta técnica de saneamiento, para el saneamiento de numerosas especies portadoras de enfermedades. Algunos estudios han demostrado la presencia de partículas virales en las células del meristemo ápical; sin embargo plantas obtenidas a partir del cultivo de meristemos resultaron libres de virus. La obtención de plantas libres de patógenos, por medio del cultivo de meristemos, hace suponer que las zonas meristemáticas tienen propiedades o características especiales, en relación con el resto de los tejidos, para mantenerse libre de virus. Este hecho supone la existencia de otros factores, los cuales probablemente operan en el momento del cultivo in vitro y son responsables de la inactivación del virus en las nuevas plantas. Una interrupción temporal de la organización normal del tejido meristemático ocasiona la inhibición de la multiplicación de los virus, debido a la no-disponibilidad de enzimas claves. Para explicar la sanidad o limpieza del meristemo se han formulado varias hipótesis, una de ellas plantea, que debido a la ausencia de tejido vascular en la proximidad del meristemo apical y que las conexiones plasmodermáticas en las células de este tejido son muy pequeñas, por tanto los microorganismos se desplazan muy lentamente hacia esta zona. Esta característica morfológica, unida a la activa
multiplicación celular que allí ocurre, puede explicar la baja concentración o la ausencia de patógenos en este tejido. Existe la hipótesis sobre la producción en las células meristemática, de sustancias inhibitorias de los microorganismos y que el efecto de las hormonas en el medio de cultivo, influyen en la inhibición de los virus mediante el cultivo de meristemos. Otra de las hipótesis se basa en la activa multiplicación celular en que se encuentra la zona meristemática, invirtiendo la totalidad de la maquinaria bioquímica celular para la formación de macromoléculas, membranas y otras estructuras de las células nuevas, dejando por tanto a los virus, parásitos obligados, en condiciones desventajosas para su propia multiplicación.
Tamaño de los meristemos El tamaño óptimo del meristemo es entre 0.2-1mm, pero realmente el utilizado está en dependencia de los objetivos que se persigan con propagación comercial. Si el objetivo es la obtención de plantas libres de enfermedades sistémicas es necesario, la utilización de meristemos, pero si por el contrario solamente se requiere de la multiplicación y no hay peligro de diseminación de enfermedades o se parte de plantas sanas, se pueden utilizar ápices de mayor tamaño con un mayor porcentaje de regeneración.
Aislamiento y siembra de los meristemos El reconocimiento de la zona meristemática varía entre especies, por tanto, se requiere de estudios preliminares que revelen su ubicación y manipulación adecuada, con el objetivo de facilitar su extracción. Existen meristemos muy fáciles de localizar, como son los expuestos, tal es el caso de la papa; en otros cultivos pueden estar más internamente protegidos y se necesita separar mayor cantidad de pequeñas hojas, para encontrar la zona meristemática. Este es el caso de bulbos, ya sean de ajo (Allium sativum L.), cebolla (Allium cepa L.) o en el caso de tubérculos o cormelos de (Xanthosoma sp.). La disección aséptica del meristemo es un proceso delicado y requiere de muchas horas de práctica; se realiza con el apoyo de un microscopio esterioscópico, desprendiendo los foliolos que rodean el punto de crecimiento, hasta que solo queda el ápice con algunos primordios foliares, para su posterior transferencia a medios de cultivo de establecimiento. La eficiencia del cultivo de meristemos, como método de saneamiento a patógenos, esta determinada por los siguientes factores:
Origen y edad del explante inicial La selección de un adecuado explante inicial determina mejores resultados en la regeneración o formación de plantas in vitro. La sección de tejido utilizada varía en dependencia de las características morfológicas de las diferentes especies, como regla general, se toman las yemas del tallo principal y de los brotes axilares de las plantas. Las principales causas de pérdidas están dadas por la muerte de los meristemos, ocasionada por daños en el momento de la extracción, y por la formación de plantas no definidas con crecimiento en rosetas.
Tamaño del explante inicial El tamaño de los meristemos es directamente proporcional a su regeneración y crecimiento posterior in vitro. En caña de azúcar, plátanos y bananos, a pesar de emplearse ápices meristemáticos, de mayor tamaño, la principal causa de bajos índices de establecimiento está dada por la necrosis de los tejidos, producto de la oxidación fenólica. De forma general el riesgo de aparición de patógenos en los tejidos vegetales aumenta con el incremento del tamaño de los explantes iniciales. La ubicación de los patógenos en los tejidos es determinante en la elección del tamaño a utilizar, por ejemplo el (PLRV) es un virus confinado al floema y puede ser eliminado cuando se extraen meristemos de mayor tamaño.
Características genotípicas Existe una marcada influencia del genotipo en el éxito del cultivo de meristemos donde los porcentajes de establecimiento varían entre especies, variedades y clones. Independientemente de la influencia del origen del explante, del tamaño de los meristemos y del genotipo, la eficiencia del cultivo de meristemos como método de saneamiento, depende de las condiciones de crecimiento según los requerimientos de las diferentes especies, la habilidad del operador para efectuar dicha escisión y la utilización de medios de cultivo con adecuado balance hormonal que favorezca la regeneración de los ápices meristemáticos.
Influencia del medio de cultivo Es importante señalar que aunque el balance hormonal utilizado está en dependencia del genotipo que se trabaje, para el éxito del empleo del cultivo de meristemos como método de saneamiento este factor debe tenerse muy en cuenta. En el cultivo de meristemos no existe ningún medio de cultivo universal, sin embargo, los medios basales propuestos por Murashige & Skoog (1962), con algunas modificaciones en sus componentes, han sido los que con más frecuencia se han utilizado. Un balance adecuado entre auxina y citoquinina en el medio de cultivo es necesario para la formación de plantas a partir de meristemos.
Ventajas Los meristemos son genéticamente estables y resultan el tejido idóneo para la iniciación de programas de propagación in vitro. El cultivo de meristemos permite eliminar la contaminación de algunos virus por escape, puesto que los tejidos meristemáticos se mantienen sanos aun cuando el resto de las células están infestadas. Este método resulta efectivo para el control de bacterias y hongos contaminantes y patógenos. Los progresos alcanzados en su aplicación han hecho posible propagar gran número de especies de importancia económica, los resultados han sido particularmente atractivos porque se pueden obtener clones limpios de patógenos a partir de plantas sistémicamente infectadas.
Limitaciones El éxito en el cultivo de meristemo es juzgado por el porcentaje de regeneración, tamaños pequeños (0.1-0.2mm) crecen lentamente disminuyendo la eficiencia del método. La resistencia de algunos genotipos al cultivo in vitro limita su extensión a diferentes variedades y especies. En la actualidad el cultivo de meristemos apicales constituye una alternativa en la erradicación de patógenos, aunque no siempre se logran los niveles de efectividad deseados; por esta razón es frecuentemente combinado con otros métodos de saneamiento que aumenten su eficiencia y generalización. En el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT), es frecuentemente utilizado con éxito en la multiplicación in vitro de yuca, boniato y malanga, con el objetivo de obtener explantes libres de patógenos.
Fuentes
García, Leyanis y J.C. Noa (1998). Obtención de plantas libres de patógenos. En: J.N. Pérez (ed.) Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. pp. 135-149. IBP, Santa Clara. López, R. (2002). Producción de plantas libres de virus y morfogénesis indirecta a partir de cultivo de meristemos de tres genotipos de quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott). Trabajo de Diploma. Universidad Nacional Agraria. Nicaragua. 40 p. Morel, G. y Martin, C. (1955). Guerison de pomme de terre de maladie a virus. C.R. Acad. Sci. Paris. 1315-1324.
Saneamiento del material vegetal: cultivo de meristemos Carlos López Encina y José Manuel Cazorla González En multitud de especies cuyo método de propagación habitual es de tipo vegetativo e incluso en algunas cuya propagación es por semilla, se encuentran problemas de contaminación por diversos microorganismos, que los métodos tradicionales de desinfección utilizados por los propagadores y viveristas no consiguen erradicar, ni siquiera mediante tratamientos químicos agresivos, esto conlleva una serie de pérdidas económicas por pérdidas de producción, de calidad de fruto y hasta de cosechas completas. Incluso utilizando técnicas de cultivo in vitro es a veces imposible eliminar a determinados organismos patógenos, como virus, micoplasmas, bacterias y hongos endógenos, algunos de los cuales se transmiten incluso vía semillas, y ante los cuales muchas veces son ineficaces los antibióticos, bactericidas y antivíricos añadidos a los medios de cultivo. Existen varios sistemas para sanear integralmente una planta eliminando los microorganismos que las infestan; sólo uno de ellos, la termoterapia (Kunkel, 1936; Kassanis, 1965), no necesita condiciones in vitro para aplicarse. Consiste en la incubación del especimen a sanear en un ambiente con alta temperatura (35 a 40°C) y alta humedad, durante periodos de 20 días a varios meses, este método se aplica con éxito en frutales. En los otros sistemas de
saneamiento se aplican técnicas de cultivo in vitro y se basan fundamentalmente en el cultivo de meristemos o ápices meristemáticos. Suelen utilizarse procedimientos mixtos que combinan termoterapia, microinjerto y formación de tallos adventicios con el cultivo de meristemos. La técnica del cultivo de meristemos consiste en la disección e incubación del meristemo apical de una planta en condiciones de asepsia. Se considera como meristemo en sentido estricto al domo meristemático del ápice o bien el domo meristemático con uno o dos primordios foliares. La dificultad del cultivo del meristemo aislado aconseja diseccionarlo y cultivarlo con al menos uno de los primordios foliares, con lo que también se obtienen buenos resultados. Así se obtienen «plantas libres de patógenos», pero atención, porque esta definición puede llevar a error, ya que la aplicación del sistema precisa de una serie de requisitos previos y posteriores. Lo primero consiste en la identificación y caracterización de los patógenos y la puesta a punto de técnicas de detección fiable, para que una vez aplicado el tratamiento de saneamiento se puedan realizar pruebas y analizar las plantas obtenidas (ensayo mediante métodos inmunológicos, injerto sobre especies marcadoras, microscopía electrónica) para verificar la total eliminación de determinados patógenos, pero cuidado, pueden existir otros patógenos cuya eliminación no se haya comprobado. Esto quizá se entienda mejor si aclaramos que la obtención de meristemos «limpios» es un proceso probabilístico, que no ocurre en el 100% de los casos, sino sólo en una alta proporción, por eso unos meristemos se obtienen libres de patógenos y otros no, y es necesario realizar tests de comprobación de los patógenos uno por uno, antes de certificar la planta como libre de patógenos. Una vez certificadas, estas plantas deben ser tratadas con esmero para impedir su reinfección por vectores o por malas prácticas higiénicas en su manipulación (Quak, 1977). Esta historia del cultivo de meristemos empezó allá por 1934, cuando White observó que un virus del tabaco se distribuía desigualmente a lo largo de la planta, y luego Limasset y Cornuet (1949) propusieron que el meristemo podría estar libre del virus. Esto llevó a Morel y Martin en 1952 a cultivar meristemos de dalias infestadas por virus y obtener plantas libres de dichos virus. Después de este trabajo y siendo muy claras las aplicaciones de este método en horticultura y fruticultura, se dedicaron muchos esfuerzos en este campo y hoy día es una técnica de aplicación rutinaria en multitud de especies (patata, fresa). Luego surgieron las preguntas sobre el porqué de la distribución diferencial del virus en la planta y su ausencia en el meristemo. En una primera hipótesis se explicaría la ausencia de virus en el meristemo por problemas de transporte de los virus, así si estos se mueven por el sistema vascular de la planta, como los vasos no llegan al meristemo, el virus no podría alcanzarlo, e incluso si el virus fuera capaz de invadir o moverse de célula a célula, la velocidad de avance de los virus sería inferior a la de crecimiento del meristemo e impediría su invasión; otras hipótesis proponen una inhibición de la replicación de los virus en la zona meristemática debido a la alta tasa metabólica del meristemo y a la elevada concentración de reguladores en esa zona. Aunque el motivo de la ausencia de virus en el meristemo no está totalmente esclarecido, estas hipótesis o una conjunción de las mismas parecen ser bastante correctas. De todo esto se desprende sin mucho esfuerzo que el tamaño del meristemo es quizá el factor más crítico de esta técnica, y el éxito en el saneamiento es mayor cuanto más pequeño es el explanto (desde 0.05 mm a 0.2 mm de diámetro) el tamaño más usual de un meristemo con los dos Como ya se ha indicado es necesario ajustar el tamaño del explanto, es decir el número de primordios foliares que van a acompañar al meristemo para equilibrar el desarrollo del cultivo y conseguir un porcentaje de axenia óptimo. Es necesario indicar que los requerimientos de los
medios de cultivo no son muy exigentes salvo si se cultiva el domo meristemático sin primordios foliares y sólo es necesario efectuar los habituales ajustes en el medio para cada especie. Otros factores que influyen en el éxito del tratamiento son la rapidez en el aislamiento del meristemo, para evitar la deshidratación de esa frágil estructura y la época del año en que se obtiene el explanto, siendo la influencia estacional muy fuerte en algunas especies (patata, clavel, etc). En la actualidad esta técnica se utiliza rutinariamente con especies ornamentales (begonias, claveles, geranios), con especies hortícolas (patata, fresa), especies leñosas (viña, eucalipto, manzano y cítricos), obteniéndose espectaculares mejoras de calidad de planta y de producción.