Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a temperaturas entre 90 – 100 ºC y luego usarlo directamente. Es evidente que mediante este método el ADN obtenido es de muy baja pureza y con aplicaciones muy reducidas. Otra desventaja de este método son las pérdidas de ADN por acción de las nucleasas n ucleasas y otros componentes de los orgánulos que están en contacto con el ADN y pueden destruirlo, por lo que no es útil para almacenar el ADN pues los contaminantes pueden degradar las moléculas de ADN.
Si se opta por realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico hay que tener en cuenta la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN que se intentan separar, por lo que este debe bastar para lograr la lisis de las células pero no ser muy agresivo para proteger el ADN. Este método puede ser usado para extraer ADN de material crudo, liofilizado o congelado, que puede romperse con un mortero, por congelación-descongelación o usando ultrasonidos. El lisado de células se puede extraer con cloroformo, alcohol isoamílico o fenol, siendo las proteínas y otros componentes de la célula solubles en el disolvente orgánico, por lo que de esta forma se logra la separación de los ácidos nucleicos. Este método se puede usar para moléculas de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos rendimientos de moléculas relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que hay que controlar el pH de la fase acuosa y la concentración de sales, que son los factores que aseguran una buena separación. Las desventajas de este método son el uso de d isolventes orgánicos dañinos para la salud humana y que pueden quedar como trazas en la muestra de ADN y luego actuar como interferentes en técnicas como el PCR, PCR, que es largo, en ocasiones puede dar rendimientos poco reproducibles y requiere de varios trasvases que aumentan la posibilidad de contaminación de la muestra.
Este es un procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un detergente aniónico pu ede romper la pared celular y así se produce la lisis de las células. El uso de detergentes aniónicos no solo se restringe a la extracción de ADN vegetal, puede ser usado para ADN genómico de bacterias y otros tipos de organismos. Un ejemplo de este método, quizás el más conocido, es el uso de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) como detergente para lograr la lisis. El CTAB además, en presencia de EDTA como agente quelatante y TRIS-HCl como tampón, forma complejos insolubles con el ADN. Luego se extraen los residuos orgánicos con cloroformo, para separar posteriormente el ADN por precipitación con etanol. Si se quiere evitar el uso de disolventes orgánicos se puede llevar a cabo el método del CTAB separando directamente los complejos insolubles formados con el ADN del sobrenadante donde han quedado disueltos el resto de componentes celulares. Estos complejos se resuspenden en disolución salina y se adiciona ad iciona posteriormente alcohol y RNAsa, logrando que precipite el ADN con un grado de pureza aceptable para muchas aplicaciones.
A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas y otros contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal que hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa. En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K,
el TRIS-HCl para regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total inactivación de las enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN. Para la extracción se utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio y el cloruro de sodio en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas orgánicas. El precipitado formado se separa por centrifugacón y luego se puede extraer el ADN de la disolución acuosa mediante la adición de alcohol, por precipitación. Este método es sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN obtenido en muchas ocasiones debe ser purificado antes de ser usado en posteriores aplicaciones. La ventaja es que se elimina el uso de disolventes orgánicos.
El procedimiento conocido como PK-SDS por sus siglas en inglés proteinase K - sodium dodecyl sulfate, es uno de los más usados para la extracción de ADN ya que la digestión de la muestra se puede realizar con proteinasa K que es activada por el dodecil sulfato de sodio. La proteinasa K inactiva las DNAsas presentes en el lisado celular usando detergente aniónico el SDS. La proteinasa K también es usada en otros de los métodos descritos en este artículo para la digestión de las proteínas y otros contaminantes del lisado celular.
La compañía Wako pone a disposición de los investigadores y empresas varios kit de ADN que usan yoduro de sodio como agente caotrópico, que tienen la ventaja de que la extracción se realiza en un único micro tubo de centrifugado. El yoduro de sodio además de provocar la lisis celular rompe la capa de hidratación que rodea el ADN y logra que las cargas negativas de los grupos fosfatos del ADN queden más expuestas. En estos kits después del tratamiento de la muestra con yoduro de sodio en el mismo tubo se adicionan detergentes aniónicos como es el caso del N -lauril sarcosinato de sodio, proteinasa K y/o otros reactivos que permiten separar las proteínas y lípidos contenidos en las muestras biológicas del ADN. Plantas La extracción de ADN se utiliza en la modificación genética de las plantas. Muchas empresas agrícolas utilizan la extracción genética para crear el ADN que luego modifican para que una determinada cepa genética de un cultivo sea resistente a varias sustancias químicas o plagas. Un ejemplo es el número de líneas de semillas fabricadas por la Corporación Monsanto, que son inmunes al herbicida Roundup. Al hacer los cultivos (remolacha, por ejemplo) resistentes al Roundup, el herbicida en cuestión puede ser rociado sobre los campos para matar las malas hierbas, pero sin afectar la cosecha de remolacha. Animales La extracción de ADN es también el primer paso en la ingeniería genética de los animales. La ingeniería genética de los animales es un tema muy amplio que va desde el cambio de un solo gen para que, en un ejemplo de un laboratorio de investigación de Taiwán, un cerdo brille en la oscuridad. En el extremo más complejo de todo el espectro de la ingeniería gen ética está la clonación de animales, un proceso del cual se pueden hacer animales idénticos. Farmacéuticos La extracción de ADN se utiliza como el paso inicial en la fabricación de un número de productos farmacéuticos. Los farmacéuticos hechos a través de la genética recombinante, incluyen la
hormona de crecimiento bovina (BVH) y la hormona del crecimiento humana (hGH). Además de un número de otras hormonas, una de las más utilizadas es la insulina. Diagnósticos médicos El diagnóstico de ciertas condiciones médicas a menudo se pueden hacer a p artir del ADN extraído de un paciente. Las condiciones que pueden ser diagnosticadas mediante pruebas genéticas son la fibrosis quística, anemia de células falciformes, síndrome de X frágil, la enfermedad de Huntington, el síndrome de hemofilia A Down y la enfermedad de Tay-Sachs. Además de diagnosticar las enfermedades existentes, también es común probar para ver si una pe rsona es portadora de una enfermedad en particular, pero sin tenerla. Verificación de identidad Un uso bien conocido para la extracción genética es la huella genética, un proceso en el cual el material genético puede ser emparejado en una e scena del crimen, por ejemplo. La verificación genética ha trabajado tanto para colocar a una persona en la escena de un crimen, como para exonerar a las personas condenadas erróneamente por un delito.
