TUGAS IMUNOKIMIA
“REVIEW : FLOWCYTOMETRY DAN ELISA”
Dosen Pengampu Mata Kuliah : Muhaimin Rifa’i
OLEH : Mery budiarti supriadi - 106090212141006
Program pascasarjana Jurusan kimia kekhususan biokimia Fakultas matematika dan ilmu pengetahuan alam Universitas brawijaya malang -2011-
1. FLOWCYTOMETRY 1.1 PENDAHULUAN
Flowcytometry adalah suatu tehnik untuk menghitung dan menganalisa suatu partikel mikroskropis, seperti sel dan kromosom, dengan menyiapkannya dalam bentuk suspensi kemudian dialirkan dalam suatu aliran cairan dan melewatkannya melalui suatu alat pendeteksi elektronik. Flowcytometry juga dapat diartikan sebagai suatu metode pengukuran sel-sel didalam suatu sistem aliran (flow), dimana mengantarkan sel-sel secara individu atau tunggal melewati titik pengukuran. Apabila ditinjau secara teori, maka terdapat banyak tipe pengukuran yang dapat dipergunakan, akan tetapi dalam prakteknya, istilah tersebut menunjukkan suatu instrumen yang menggunakan sinar sebagai fokus dalam titik p engukurannya. engukurannya. Pada tehnik ini, dapat dipergunakan sinar yang disebarkan dan yang mengalami fluoresensi memiliki perbedaan panjang gelombang, dimana kemudia n akan terekam. Biasanya, sinar yang disebarkan pada dua sudut yang berbeda dan satu hingga enam atau lebih sinar berfluorensensi dapat terukur. Flowcytometry ini merupakan metode analisa multiparameter yang dapat dikerjakan secara bersamaan, yaitu baik dengan menganalisa sifat kimia dan/atau fisika dari beribu partikel per detik. Flowcytometer ini dapat dipergunakan untuk menganalisa banyak jenis sel, seperti sel-sel mamalia, tanaman, alga, ragi dan bakteri, akan tetapi saat ini juga dapat dipergunakan untuk menganalisa partikel lain, seperti inti sel (nukleus) dan kromosom atau small beads. Dimana flowcytometry umumnya digunakan dalam diagnosis gangguan kesehatan, khususnya kanker darah, tetapi juga dapat dipergunakan pada beberapa aplikasi lainnya
yang
melibatkan
suatu
penelitian
dan
praktek
klinis.
Dimana
penggunaaannya secara umum adalah untuk menyortir secara fisik partikelpartikel berdasarkan sifat-sifatnya, atau dengan kata lain dapat dipergunakan sebagai suatu metode pemurnian. Prinsip dari analisa dengan flowcytometry ini adalah adanya sumber sinar (umumnya sinar laser) atau suatu sinar dengan panjang gelombang tunggal yang dipancarkan menuju suatu pemfokusan hidrodinamik aliran cairan. Beberapa jenis
detektor digunakan pada suatu titik dimana aliran cairan tersebut kemudian akan melewati pancaran sinar tersebut, salah satunya berada sejajar dengan pancaran sinar (Forward Scatter atau FSC) dan beberapa berada berseberangan dengan aliran cairan tersebut (Side Scatter atau SSC) serta satu atau lebih merupakan detektor fluoresensi. fluoresensi. Setiap partikel p artikel tersuspensi dengan ukuran 0,2 hingga 150 µm akan melewati pancaran sinar laser dan bahan kimia berfluoresensi yang terdapat pada partikel atau berinteraksi dengan partikel tersebut dimungkinkan dapat tereksitasi menghasilkan suatu emisi sinar pada panjang gelombang yang lebih tinggi dibandingkan panjang gelombang sumber sinar tersebut. Kombinasi sinar yang tersebar dan berfluoresensi akan ditangkap oleh detektor, dan, dengan menganalisi fluktuasi yang terjadi pada intensitas cahaya pada setiap detektor (satu untuk setiap puncak emisi fluoresensi), hal tersebut memungkinkan untuk mengantarkan beberapa tipe informasi mengenai struktur fisika dan kimia setiap individu partikelnya. FSC berkorelasi dengan volume sel dan SSC tergantung pada kekompleksan bagian dalam partikel (seperti bentuk nukleus, jumlah dan tipe sitoplasma granulosa atau kekasaran membran). Beberapa flowcytometer dipasaran telah menghilangkan keperluan fluoresensi dan menggunakan hanya sinar yang menyebar untuk pengukuran. Sedangkan beberapa instrumen flowcytometer yang lain membentuk gambaran setiap fluoresensi fluoresensi sel, penyebaran dan transmitansi sinar. Kelemahan utama dari metode flowcytometry ini adalah bahwa metod e ini memerlukan suspensi dari sel-sel tunggal atau partikel lainnya, dengan sedikit clumps dan debris. Dimana hal ini berarti bahwa susunan jaringan dan informasi lainnya mengenai hubungan spasial antara sel-sel yang berbeda akan hilang saat sel-sel tunggal ataupun inti sel tersebut dipersiapkan. Beberapa organisme, seperti alga laut, adalah organisme yang dapat memfluoresensikan sinar secara alami, akan tetapi secara umum fluoresensi ini dapat berasal dari label yang berbeda. Beberapa jenis bahan kimia yang memiliki sifat fluoresensi dimungkinkan dapat digunakan untuk melabel komponen sel, seperti DNA (secara langsung), atau yang lainnya melalui interaksi dengan suatu antibodi dengan beragam jenis protein seluler. Gambar 1.1 menunjukkan salah satu contoh gambaran hasil analisa d engan menggunakan menggunakan flowcytometry.
Gambar 1.1. Analisa flowcytometry pada sampel organisme laut (phytoplankton)
1.2 FLOWCYTOMETER
Flowcytometer modern dapat dipergunakan untuk menganalisa beberapa ribu partikel dalam setiap detik, pada saat yang tepat ‘real time’, dan dapat secara aktif memisahkan dan mengisolasi partikel yang memiliki sifat spesifik. Suatu flowcytometer serupa dengan mikroskop, kecuali dalam penghasilan gambar selnya,
flowcytometry
memberikan
hasil
akhir
yang
secara
otomatis
menggambarkan pula kuantitas sejumlah tersebut dalam suatu parameter. Untuk menganalisa jaringan padat, suspensi sel tunggal terlebih dahulu harus dipersiapkan. Suatu instrumen flowcytometer memiliki lima komponen utama, diantaranya : 1. suatu flow cell – liquid stream (sheath fluid), yang membawa dan meluruskan sel-sel sehingga dapat melewati keadaan tunggalnya hingga melalui pancaran sinar untuk sensor 2. sistem pengukuran, biasanya yang digunakan adalah pengukuran impedansi (atau konduktivitas) dan suatu sistem optik, seperti lampu (mercury, xenon); high-power water-cooled lasers (argon, krypton, dye laser); low-power air-cooled lasers (argon (488 nm), red-HeNe (633 nm), green-HeNe, HeCd (UV)); diodelasers (biru, hijau, merah, ungu) yang menghasilkan sinyal sinar.
3. suatu detektor dan sistem Analogue-to-Digital Conversion (ADC), yang menghasilkan FSC dan SSC sebaik sinyal fluoresensi dari sinar menjadi suatu sinyal elektrik yang kemudian dapat diproses secara komputasi. 4. sistem amplifikasi, baik linier ataupun logaritmik 5. komputer untuk analisa sinyal Salah
satu
hal
yang
mendasar
mengenai
flowcytometry
adalah
kemampuan untuk menentukan sifat dari setipa individu partikel. Ketika sampel berada dalam larutan diinjeksikan kedalam suatu flowcytometer, partikel-partikel tersebut secara acak akan didistribusikan dalam suatu ruang tiga dimensi. Oleh karena itu, sampel harus dikenalan dalam suatu aliran partikel-partikel tunggal yang mampu dianalisa oleh sistem deteksi mesin. Proses ini diatur oleh suatu sistem fluiditas atau cairan. Berikut ini adalah diagram instrumen flowcytometer :
Gambar 1.2. Diagram flowcytometer Umumnya, sistem fluiditas ini terdiri atas suatu central channel atau core sebagai tempat sampel diinjeksikan, dimana letaknya tertutupi oleh suatu outer sheats (pelapis terluar) yang mengandung aliran cairan yang deras. Sebagai
pelapis cairan yang bergerak, bagian ini menciptakan pengaruh gesekan yang tinggi pada bagian central chamber yang menyempit. Hal inilah yang mengubah kecepatan cairan central yang mengalir dengan kecepatan tersebar di pusat dan kecepatan nol pada dinding (Gambar 1.3 dan 1.4).
Gambar 1.3. Pemfokusan hidrodinamik yang menghasilkan aliran sel-sel tunggal
Gambar 1.4. Pemfokusan dengan lensa silindris yang d ipasang bersilangan Flow chamber terletak di jantung instrumen. Biasanya disebut sebagai flow cell tetapi lebih sesuai digunakan kata chamber , hal ini untuk menghindari
ketimpangan dengan sel-sel biologis. Flow chamber ini didesain untuk mengantarkan sel-sel dalam bentuk tunggal pada titik pengukuran. Sampel diinjeksikan kedalam pusat aliran cairan (air atau buffer), yang dikenal sebagai selubung cairan (sheath fluid). Apabila aliran terganggu, sheath fluid dan aliran sampel tidak akan bercampur dan yang terakhir akan menyempit, secara umum diameternya berkisar 10 µm, menghambat sel-sel untuk bergerak masuk melewati pusat chamber. Pada titik ini, sinar kemudian akan difokuskan. Gambar 1.5 ini menunjukkan flow chamber dan kelengkapannya, yaitu sebagai berikut :
Gambar 1.5. Flow chamber dan kelengkapannya Terdapat dua tipe flow chamber yang mendasar, yaitu chamber yang tertutup penuh dimana dipergunakan hanya untuk menganalisa dan chamber dimana aliran sampel terbuka, yang dipergunakan untuk analisa dan penyortiran sel-sel. Bentuk chamber yang seringkali ditemukan adalah kuvet yang berbahan dasar kuarsa. Desain tipe yang lain dipergunakan dalam microscope-based cytometer (Gambar 1.6), dimana fluoresensi diukur pada jalur optik. Permukaan atas biasanya ditutupi oleh slip atau yang serupa lainnya (equivalent).
Gambar 1.6. Microscope-based flow cytometer Suatu chamber desain khusus yang berbentuk kuvet b erbahan dasar kuarsa (Gambar 1.7), desain ini sangat sesuai u ntuk penyortiran sel.
Gambar 1.7. Salah satu d esain flow chamber
Salah satu instrumen analisa, yang mana tidak dapat menyortir sel, aliran biasanya berada mengarah vertikal dengan tujuan untuk menghilangkan keberadaan gelembung-gelembung udara. Seperti halnya sheath dan sample lines, terdapat juga
vacuum
line
yang
berfungsi
untuk
membersihkan
dan
mampu
menghilangkan hambatan yang ada. Sekumpulan
lensa
yang
berinteraksi
dengan
chamber
akan
memaksimalkan jumlah fluoresesensi dan sinar yang menyebar. Ketika sel-sel disortir secara elektrostatis, sheath dan aliran sampelnya berada diudara terbuka. Terdapat dua jenis chamber untuk sortir, salah satunya berdasarkan desain kuvet dan yang lain didasarkan pada interograsi sinar laser pada sel-sel diluar chamber, dimana sistem ini sering disebut dengan istilah ‘stream-in-air’ atau ‘jet-in-air’ (Gambar 1.8).
Gambar 1.8. Flow chamber menggunakan sistem ‘stream-in-air’
Sheath fluid, umumnya digerakan melalui flow chamber oleh tekanan air yang tersedia dengan suatu kompresor (Gambar 1.9). Tekanan yang sama digunakan untuk melawan sampel kedalam sheath, dimana rata-rata aliran sampel diregulasi oleh regulator tekanan. Parameter ini dapat digolongkan sebagai variabel yang kontinu atau tetap, yaitu menjadi tiga pengaturan (tinggi, menengah dan rendah).
Gambar 1.9. Sistem fluiditas flowcytometer
Sumber sinar yang digunakan dapat berupa laser, suatu lampu arc atau bahkan LED. Akan tetapi, yang lebih banyak dipergunakan saat ini adalah laser. Laser dipilih karena dapat menghasilkan intensitas yang ti nggi dari pancaran sinar monokromatis. Selain itu, karena laser juga memiliki ukuran spot yang kecil, dimana hal ini menjadi penting karena sinar tersebut perlu untuk difokuskan menjadi volume kecil untuk mendapatkan eksitasi yang maksimum pada sel tunggal, serta untuk meminimalkan kemungkinan menjadi lebih dari satu sel oleh karena pancaran laser. Sedangkan, lampu Arc memerlukan suatu filter optis u ntuk memilih panjang gelombang yang diperlukan. Kespesifikan deteksi diatur oleh filter optis (Gambar 1.10), dimana mampu menghalangi panjang gelombang tertentu saat yang lain bertransmisi. Terdapat beberapa tipe filter utama, diantaranya ‘long pass’ filter yang memungkinkan melalui sinar diatas panjang gelombang batas, ‘short pass’ yang mampu mentransmisikan sinar dibawah panjang gelombang batas dan ‘b and pass’ yang dapat mentransmisikan sinar diantara range sempit yang spesifik pada panjang gelombang. Seluruh filter ini menghambat sinar melalui proses absorpsi.
Gambar 1.10. Perbedaan beberapa tipe filter optis o
Ketika filter diletakkan pada suhu 45 terhadap sinar datang, maka disebut sebagai dichroic filter/mirror, seperti namanya, tipe filter ini menunjukkan dua fungsi, pertama, untuk melewatkan panjang gelombang yang spesifik dengan ara h o
yang sejajar, dan kedua, untuk membelokkan sinar pada sudut 90 , dimana hal ini bertujuan untuk menggandakan sinyal secara berkelanjutan (Gambar 1.11).
Gambar 1.11. Skematik pengaturan flowcytometer tertentu
Laser memiliki keragaman jenis, diantaranya air-cooled dan solid state. Tipe laser yang paling umum adalah laser air-cooled argon-ion yang menghasilkan sinar biru pada panjang gelombang 488 nm. Panjang gelombang ini mencukupi
untuk
proses
eksitasi
fluoresensi,
yang
merupakan
label
immunofluorescent yang pertama kali digunakan. Laser air-cooled umumnya menggunakan He-Ne (633 nm) dan He-Cd (325 nm). Sedangkan laser solid state menghasilkan sinar dengan panjang gelombang 355, 405, 488, 530, 594, 635 dan 780 nm. Hampir seluruh solid state dihasilkan diantara 10 dan 25 mW, dimana paling minimum adalah menggunakan laser diode yang memberikan mW pada 488 nm. Walaupun kekuatan output yang tinggi mampu meningkatkan sensitivitas, tetapi kondisi tersebut juga memberikan efek samping yaitu peningkatan biaya, perbaikan dan ukuran. Beberapa aplikasi memerlukan kekuatan laser yang tinggi, seperti analisa dan sortir kromosom, dimana laser water-cooled yang menghasilkan 200 mW sering digunakan pada prosesnya.
1.3 APLIKASI FLOWCYTOMETRY
PEMILAHAN
SEL
BERDASARKAN
EFEK
ELEKTROSTATIK
(ELECTROSTATIC CELL SORTING)
Aplikasi utama dari flowcytometry adalah untuk memisahkan atau separasi sel-sel berdasarkan ekspresi subtipe atau epitop, dimana selanjutnya dipergunakan untuk penelitian biologis. Proses ini dikenal juga dengan istilah cell sorting (pemilahan sel) atau analisa FACS. Terdapat dua metode pemilahan sel dengan menggunakan flowcytometer. Metode yang paling umum adalah dengan memanfaatkan pembelokan (defleksi) elektrostatik dari droplet yang bermuatan. Metode alternatif lain adalah menggunakan alat piezo-electric untuk memilah sel-sel secara mekanik. Proses sorting sel dengan elektrostatik dapat terjadi sebagai berikut suatu cairan pelapis (sheath fluid) yang bersifat konduktif digunakan dalam proses tersebut, biasanya yang digunakan adalah buffered saline. Flow chamber digetarkan secara vertikal oleh tranduser piezoelektrik umumnya pada frekuensi
antara 20 dan 60 kHz. Getaran ini menyebabkan cairan tersebut muncul dari gangguan yang keluar (umumnya berdiameter 75 m) u ntuk kemudian dapat pecah menjadi droplet. Flow chamber, dan aliran arus, yang bermuatan (+ v dimana v umumnya terletak antara 50 dan 150 V) pada saat sel yang diinginkan terdapat didalam droplet sedang terbentuk. Arus droplet lewat melalui sepasang plate bermuatan (+ 500 V) sehingga droplet yang bermuatan tersebut akan terdefleksi dan berkumpul bersama dengan sel yang terkandung didalamnya. Oleh karena itu, sel-sel dalam dua pre definisi gerbang dapat dipisahkan dengan menggunakan muatan positif dan negatif. Berlangsungnya proses analisa ini adalah setelah sampel difokuskan secara hidrodinamik, setiap partikelnya kemudian dilapisi dengan pancaran sinar. Sinyal yang tersebar dan fluoresensi dibandingkan dengan pengaturan kriteria pemilihan dalam instrumen. Apabila partikel-partikel tersebut sesuai dengan kriteria, aliran cairan dianggap sebagai gangguan yang masuk kedalam sistem fluidik. Muatan elektrostatik biasanya terjadi pada saat yang tepat atau disebut sebagai ‘break-off point’,dimana hal ini menjelaskan bagaimana droplet yang mengandung partikel yang diinginkan terpisah dari aliran dan dapat terjatuh secara oto matis. Hal-hal yang mempengaruhi posisi ‘break off point’ (perubahan suhu, sebuah kotoran, draft dalam sel orifice flow) dapat mempengaruhi stabilitas penyortir. Untuk mencegah terjadinya ‘break-off point’ pada sembarang jarak dari gangguan dan untuk menjaga konsistensi ukuran droplet, gangguan divibrasikan pada frekuensi yang tinggi. Droplet umumnya melewati medan dengan elektrostatik yang kuat dan membelokkan ke arah kiri atau kanan tergantung muatannya (Gambar 1.12).
Gambar 1.12. Elektrostatic sorting flow Kecepatan sorting aliran tergantung pada beberapa faktor, termasuk ukuran partikel dan laju pembentukan droplet. Suatu jenis gangguan yaitu berdiameter antara 50 – 70 M, bergantung pula pada kecepatan jet, sehingga dapat menghasilkan 30.000 – 100.000 droplet per detik, yang merupakan kondisi yang akurat untuk proses sorting atau pemilahan. Semakin tinggi kecepatan jet maka memberikan resiko gangguan menjadi semakin terhambat sehingga mampu menurunkan kemurnian preparasi.
1. ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
1.1 PENDAHULUAN
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan salah satu metode immunoassay yang menggunakan antibodi untuk menangkap suatu antigen dan suatu antibodi berlabel enzim untuk menentukan jumlah antigennya. Istilah immunoassay merupakan kombinasi antara istilah ‘immuno’ yang berarti suatu aplikasi imunokimia yang melibatkan interaksi antara antigen-antibodi dan ‘assay atau pengukuran’ yang menunjukkan suatu teknik untuk penentuan kemurnian suatu substansi atau jumlah suatu konstituen campuran. Sehingga, immunoassay dapat diartikan sebagai suatu metode untuk mengukur sutau substansi dalam suatu campuran menggunakan aplikasi reaksi ikatan spesifik antibodi. Berikut ini merupakan perkembangan ‘radioimmunoassay’ sebagai salah satu tehnik dalam immunoassay dengan label radioisotop :
Gambar 2.1. Perkembangan Radioimmunoassay
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), dikenal juga sebagai metode Enzyme Immunoassay (EIA), merupakan suatu tehnik biokimia yang digunakan pada bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan suau antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah dipergunakan sebagai alat diagonis dalam dunia medis dan patologi tumbuhan, serta dapat juga dipergunakan sebagai pendeteksi quality control pada berbagai macam industri. Secara sederhana, dalam ELISA, sejumlah antigen yang tidak diketahui ditempatkan atau dilekatkan pada suatu permukaan, dan kemudian diperlakukan dengan suatu antibodi yang spesifik diatas permukaan tersebut sehingga terjadi interaksi pengikatan dengan antigen. Antibodi tersebut dilekatkan dengan suatu enzim, dan pada tahapan terkahir substansi ditambahkan sehingga enzim dapat berkonversi menjadi b eberapa sinyal yang dapat terdeteksi, umumnya sinyal tersebut berupa perubahan warna dengan adanya suatu substrat kimia.
2.2 HAL-HAL YANG PENTING DALAM IMMUNOASSAY
Berikut ini merupakan hal-hal penting yang perlu dipahami dalam immunoassay, antara lain : ANTIBODI (ANTISERUM)
Pada immunoassay, antibodi digunakan sebagai reagen pengikat dengan spesifitas dan kemampuan pengikatan yang tinggi, sehingga afinitasnya terhadap substansi yang tinggi ini dapat terukur. Antibodi berinteraksi dengan substansi lain diperoleh dengan cara melakukan imunisasi pada suatu hewan dengan suatu subtansi tertentu. Beberapa substansi dapat dengan mudah secara langsung memproduksi antibodi dan beberapa substansi lainnya memerlukan dukungan suatu adjuvant, seperti complete Freund’s adjuvant, agar dapat meningkatkan respon imun serta mempercepat proses produksi antibodi tersebut. Antibodi dikenal juga sebagai ‘immunoglobulins’ yang berasal dari sifat kimianya, dan molekul dasarnya terbentuk dari dua heavy (H) dan dua light (L) chain, memiliki berat molekul antara 50000 – 70000 dan/atau 23000. Immunoglobulin diklasifikasikan berdasarkan struktur dari H chain, yaitu IgG, IgM, IgA, IgD dan IgE. Dan L chain diklasifikasikan ke dalam dua tipe, yaitu lamda dan kappa. IgG, IgD dan IgE merupakan struktur dasar dan memiliki berat
molekul antara 150, 170-200 dan 190 kDa. IgA merupakan tipe dimer dengan berat molekul 390 kDa, sedangkan IgM adalah suatu pentamer dengan berat molekul 900 kDa. Antibodi memiliki suatu lokasi tertentu pada akhir H dan L chain yang kemudian dikenal sebagai wilayah variable (VH, VL), karena variasi dari sekuen asam amino diantara kelas yang sama, sedangkan akhir dari chain disebut dengan wilayah konstant (CH, CL). Wilayah variabel merupakan tempat untuk pengenalan dan pengikatan dengan epitop yang spesifik dari antigen.
ANTIGEN DAN HAPTEN
Antigen umumnya merupakan suatu makromolekul dengan ukuran di atas 1000 Dalton. Substansi dengan ukuran molekul yang lebih kecil tidak dapat memproduksi antibodinya sendiri, akan tetapi tetap dapat berikatan dengan antibodi, dan substansi ini biasa dikenal dengan hapten. Untuk memperoleh suatu antibodi untuk hapten, maka hapten perlu digabungkan dengan suatu carrier protein yang berukuran besar. Kemudian antibodi dapat diproduksi melalui proses imunisasi suatu hewan dengan suatu immunogen. Antibodi akan muncul setelah inokulasi pertama dan dikenal sebagai tipe IgM, yang merupakan suatu pentamer dan komponen dasat antibodi. Antibodi tipe ini, kemudian akan berubah menjadi tipe IgG setelah dilakukan inokulasi berulang, dimana antibodi tipe IgG ini merupakan antibodi yang sering digunakan dalam immunoassay.
LARUTAN STANDAR
Preparasi larutan standar adalah hal yang diperlukan untuk immunoassay. Larutan standar digunakan untuk merancang suatu kurva standar dari suatu reaksi bertingkat
yang
menghasilkan
variasi
konsentrasi
standar,
dan
dengan
membandingkan reaksi yang dihasilkan oleh sampel dengan kurva standar, maka akan diperoleh harga sampel. Hasil akhir pengukuran menunjukkan jumlah absolut substansi target, seperti berat dan konsentrasi, atau jumlah substansi pendukung, seperti potensi (unit biologis, aktivitas enzim dan beberapa variabel dengan satuan internasional).
MATERI TERLABEL
Dalam immunoassay, sangat diperlukan untuk menggunakan penanda atau marker agar dapat diketahui proses pengikatan antigen-antibodi. Untuk tujuan tersebut, maka perlu dilakukan pelabelan baik pada antigen ataupun antibodi dengan suatu bahan atau materi yang tidak mengganggu proses pengikatan. Umumnya digunakan radioisotop, enzim, substansi berfluoresens seperti FITC, unsur pengkhelat yang berasal dari unsur lantanida, dan yang lainnya. Dan faktor ini merupakan faktor yang paling penting d alam immunoassay.
2.3 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
Metode pengukuran ini menggunakan enzim sebagai materi pelabel dan antibodi yang telah mengeras atau melekat sebagai agen yang akan menangkap antigen sebagai targetnya. Pada ELISA dikenal adanya mikroplate dengan 96 sumuran (well plate) dan umumnya well terlebih dahulu akan dilapisi atau dicoating dengan antibodi. Antibodi ini disebut sebagai antinodi penangkap atau ‘captured antibodies’, yang berperan utama sebagai penangkap molekul antigen yang terdapat dalam sampel. Pelapisan atau coating dilakukan dengan proses adsorpsi pada permukaan dari bagian dasar sumuran well plate (Gambar 2.2).
Gambar 2.2 Microplate ELISA
Well plate tersebut terbuat dari polistirene yang dimodifikasi sehingga memiliki efisiensi adsorpsi yang tinggi. Karena konsentrasi antibodi t erkait dengan efisiensi penangkapan antigen untuk mendapatkan sensitifitas yang sempurna, preparasi antibodi yang digunakan adalah fraksi IgG, atau fraksi antibodi monospesifik
yang diperoleh dengan suatu proses kromatografi afinitas. Fraksi tersebut lebih baik digunakan dibanding dengan fraksi crude gamma globulin (IgG) yang dipreparasi dengan fraksinasi amonium sulfate.
PROSEDUR DASAR ELISA
Berikut ini merupakan prosedur mendasar ELISA, yaitu sebagai berikut (Gambar 2.3): 1. Larutan standar atau sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang telah terlapisi atau tercoating dengan antibodi, kemudian diinkubasi selama beberapa jam sehingga molekul antigen dapat tertangkap dengan sempurna oleh antibodi penangkap atau ‘capture antibody’. 2. Setelah reaksi pengikatan, campuran reaksi tersebut dibuang kemudian sumuran dicuci untuk menghilangkan materi atau bahan berlebih. 3. Antibodi sekunder yang mengenali epitop lain dari antigen ditambahkan. Antibodi sekunder tersebut telah terlabel dengan suatu enzim seperti horseradish peroxidase (HRP). 4. Antibodi sekunder berlabel enzim akan terikat pada antigen yang telah terikat pada antibodi yang berada didasar sumuran. Hal ini berarti bahwa enzim (HRP) juga akan melekat pada bagian dasar sumuran. Jumlah antigen yang terperangkap sebanding dengan enzim yang melekat. 5. Aktivitas enzim diukur dengan menambahkan substrat kromogen dari enzim tersebut. Dalam hal ini, untuk HRP umumnya digunakan tetramethylbenzidine (TMB). Setelah inkubasi untuk beberapa saat, substrat kromogen akan mengalami perubahan warna. Reaksi tersebut kemudian dihentikan dengan penambahan suatu reaktan penghenti reaksi atau stopper, biasanya adalah suatu larutan asam sulfat, dan absorbasni diukur dengan menggunakan suatu plate reader. 6. Kurva standar disiapkan dari beberapa variasi konsentrasi larutan standar yang diukur absorbansinya. Dan nilai pengukuran sampel ditentukan dari nilai absorbansinya yang telah dibandingkan dengan kurva standar (kurva kalibrasi).
Gambar 2.3. Tahapan prosedur dasar ELISA
PROSEDUR ELISA DENGAN BIOTIN AVIDIN BINDING
Enzim merupakan makromolekul, sehingga terkadang pelabelan dengan menggunakan enzim dapat mengganggu reaksi pengikatan antara antigen dan antibodi. Untuk menghindari gangguan tersebut, maka umumnya antibodi sekunder dilabeli dengan suatu substansi yang memiliki ukuran molekul lebih kecil, yaitu biotin (MW=244,31), dan suatu protein spesifik untuk berikatan dengan biotion, avidin yang berkonjugasi dengan enzim, seperti HRP (Gambar 2.4).
Gambar 2.4. Prosedur ELISA dengan biotin avidin binding Biotin (Gambar 2.5) adalah semacam growth factor atau faktor pertumbuhan yang ada pada setiap sel dan termasuk ke dalam golongan vitamin B kompleks, dan umumnya dikenal juga sebagai vitamin H.
Gambar 2.5. Struktur biotin Biotin ini berperan sebagai ko-faktor dari beragam jenis enzim yang terkait dengan reaksi karboksilasi, biasanya dikenal juga dengan koenzim R. Biotin terdapat melimpah di hati, ginjal, penkreas, ragi dan susu. Substansi ini juga
penting dalam metabolisme asam lemak dan karbohidrat, dan kekurangannya dapat menyebabkan luka pada kulit. Sedangkan avidin merupakan suatu glikoprotein dasar yang berada dalam putih telur mentah, diproduksi di saluran telur unggas dan amfibi. Avidin ini termasuk substansi tetramer yang tersusun atas subunit rantai tunggal yang terdiri atas 128 asam amino (N-terminal berupa alanin dan C-terminal berupa asam glutamat). Berat molekulnya adalah berkisar 66000 Dalton dan diperoleh melalui proses pemecahan dengan perlakuan panas dan iradiasi. Avidin terikat secara kuat dengan biotin dan dapat menonaktifkannya. Setiap subunit dapat terikat dengan satu biotin. Konstanta disosiasinya (Kd) adalah 10 -15 M.
2.4 SISTEM METODE ELISA
Terdapat beberapa sistem metode ELISA yang terkait dengan prinsip pelaksanaannya, dimana sistem tersebut terbagi atas : DIRECT ELISA
Metode ELISA ini merupakan bentuk metode ELISA yang paling sederhana (Gambar 2.6), dimana pada metode ini antigen berinteraksi dengan pasif terhadap fase tetap atau plastic solid phase (microtiter plate well) melalui suatu periode inkubasi. Setelah proses pencucian, antigen dideteksi dengan penambahan antibodi yang berikatan secara kovalen dengan enzim. Setelah inkubasi dan pencucian, tes atau analisa ini dikembangkan dengan penambahan kromogen atau substrat yang dimana mampu menghasilkan suatu aktivitas enzim dalam wujud terjadinya perubahan warna. Jumlah enzim tertinggi dalam sistem ditentukan dengan kecepatan warna tersebut terbentuk. Umumnya warna yang terbentuk tersebut dibaca setelah waktu yang telah ditentukan atau setelah aktivitas enzimatis tersebut dihentikan dengan suatu bahan kimia pada suatu waktu yang tertentu. Kemudian warna tersebut dibaca secara spektrofotometer.
Gambar 2.6. Tahapan direct ELISA
INDIRECT ELISA
Antigen berinteraksi secara pasif dengan sumuran melalui suatu proses inkubasi. Setelah pencucian, antibodi yang spesifik untuk suatu antigen diinkubasi dengan antigen. Sumuran dicuci dan semua antibodi yang terikat dideteksi dengan penambahan antispesies antibodi yang secara kovalen berinteraksi dengan suatu enzim. Seperti antibodi yang spesifik untuk suatu spesies yang sama seperti tempat antibodi yang pertama kali ditambahkan diproduksi. Setelah inkubasi dan pencucian, analisa dikembangkan dan dibaca serupa dengan metode pada direct ELISA, yaitu dengan penambahan kromogen atau substrat yang menghasilkan suatu aktivitas enzim. Dimana aktivitas enzim ini diwujudkan dalam perubahan warna yang akhirnya dapat terukur secara spektrofotometer. Gambar 2.7 ini menunjukkan tahapan-tahapan dari metode indirect ELISA yaitu sebagai berikut :
Gambar 2.7. Tahapan indirect ELISA
Metode indirect ELISA ini merupakan salah satu metode analisa yang banyak diaplikasikan sebagai metode analisa diagnosis.
SANDWICH ELISA
Terdapat
dua
bentuk
ELISA
berdasarkan
jumlah
antibodi
yang
dipergunakan. Prinsip yang dipergunakan sama seperti kedua metode ELISA yang dipergunakan sebelumnya, yaitu penambahan antigen secara langsung pada fase padatan, antibodi ditambahkan pula pada fase padatan, kemudian antibodi tersebut berperan sebagai penangkap antigen. Sistem ini berguna apabila antigen berada dalam bentuk crude atau pada konsentrasi yang rendah. Pada kasus ini, antigen tidak dapat secara langsung ditambahkan pada fase padatan karena tidak terdapat konsentrasi yang cukup tinggi untuk dapat diperoleh keberhasilan pengukuran berdasarkan prinsip direct ataupun indirect ELISA. Sandwich ELISA tergantung pada antigen yang stidaknya memiliki dua sisi antigenik sehingga setidaknya dua antibodi dapat terikat. Metode sandwich ELISA ini terbagi menjadi dua metode pelaksanaan, yaitu direct sandwich ELISA dan indirect sandwich ELISA. DIRECT SANDWICH ELISA
Antibodi merupakan protein yang terdapat secara alami dan dapat secara pasif berinteraksi dengan fase padatan. Setelah pencucian untuk menghilangkan antibodi berlebih yang tidak berikatan, antigen ditambahkan dan akan tertangkap secara spesifik. Antigen kemudian akan dideteksi dengan suatu antibodi sekunder yang berlabel enzim secara langsung terhadap antigen. Antibodi ini dapat secara identik menangkap antibodi yang bereaksi dengan sisi antigenik yang berulang atau suatu antibodi yang berasal dari spesies yang berbeda dihadapkan secara langsung pada sisi yang sama ataupun berbeda. Tipe pengukuran ini berguna apabila terdapat suatu spesies antiserum tunggal dan jika antigen tidak berinteraksi dengan plate. Gambar 2.8 menunjukkan tahapan pelaksanaan direct sandwich ELISA, dimana pelaksanaannya adalah sebagai berikut :
Gambar 2.8 Tahapan direct sandwich ELISA
INDIRECT SANDWICH ELISA
Metode ELISA ini memiliki prinsip yang sama dengan metode direct sandwich ELISA, akan tetapi melibatkan tiga antibodi. Tahapannya meliputi pelapisan atau coating pada fase padatan dengan antibodi dan penangkapan antigen, kemudian antigen tersebut dideteksi d engan suatu antibodi sekunder yang tidak berlabel. Antibodi ini kemudian dideteksi menggunakan suatu antispesies enzim yang terlabel konjugat. Hal ini pentinga bahwa antispesies konjugat tidak terikat pada antibodi penangkap, oleh karena itu spesies yang digunakan sebagai
temapat produksi antibodi penangkap harus berbeda. Satu hal yang harus dimiliki adalah keberadaan antigen dengan dua sisi antigenik. Dimana keuntungan dari sistem ini adalah bahwa konjugat antispesies tunggal dapat digunakan untuk mengevaluasi pengikatan antibodi pada beberapa jenis sampel. Gambar 2.9 menunjukkan tahapan pelaksanaan direct sandwich ELISA, dimana pelaksanaannya adalah sebagai berikut :
Gambar 2.9 Tahapan indirect sandwich ELISA
COMPETITIVE/INHIBITION ELISA
Keseluruhan metode ELISA yang ada dapat digunakan sebagai adaptasi untuk pengukuran antigen atau antibodi menggunakan metode kompetitif atau inhibisi. Sehingga, setiap pengukuran diatas menjelaskan perlunya pretitrasi reagen untuk memperoleh suatu kondisi yang optimum. Kondisi optimum ini kemudian dapat dilanjutkan dengan penambahan antigen atau antibodi. Metode
sandwich
ELISA
ini
terbagi
menjadi
beberapa
metode
pelaksanaan, yaitu : COMPETITIVE ELISA DIRECT ANTIGEN
Berikut ini merupakan prinsip tahapan pelaksanaan competitive ELISA direct antigen :
Gambar 2.10. Prinsip competitive ELISA direct antigen
Reaksi antigen yang terkandung didalam sampel dengan antibodi berlabel enzim secara langsung terhadap antigen pada fase padat menghambat label dari pengikatan pada antigen fase padat. Apabila ntigen tidak memiliki crossreactivity atau tidak terdapat sama sekali, kemudian antibodi berlabel akan berikatan dengan antigen fase padat dan reaksi warna merupakan hasil akhir yang akan dianalisa.
COMPETITIVE ELISA DIRECT ANTIBODY
Berikut ini merupakan prinsip tahapan pelaksanaan competitive ELISA direct antibodi :
Gambar 2.11. Prinsip competitive ELISA direct antibodi
Tingkat penghambatan oleh antibodi yang terikat pada serum untuk pretitrasi reaksi antiserum berlabel enzim merupakan parameter yang dipergunakan.
COMPETITIVE ELISA INDIRECT ANTIGEN
Berikut ini merupakan prinsip tahapan pelaksanaan competitive ELISA indirect antigen :
Gambar 2.12. Prinsip competitive ELISA indirect antigen
Pretitrasi indirect ELISA dibandingkan dengan/atau tanpa antigen. Apabila antigen membagikan sisi antigenik dengan antigen yang terikat pada fase padatan, kemudian berikatan dengan antibodi pretitrasi dan mencegah terjadinya ikatan dengan antigen pada fase padat. Jika tidak terdapat kemiripan, kemudian antibodi tidak terikat dan bereaksi dengan antigen pada fase padat. Penambahan konjugat enzim antispesies sebanding dengan jumlah ikatan antibodi yang ada.
COMPETITIVE ELISA INDIRECT ANTIBODY
Berikut ini merupakan prinsip tahapan pelaksanaan competitive ELISA indirect antibodi :
Gambar 2.13. Prinsip competitive ELISA indirect antibodi
Metode ini berprinsip pada keterlibatan antigen pretitrasi dan antiserum dalam suatu indirect ELISA. Penambahan serum yang memiliki crossreactivity dengan antibodi akan mengacaukan keseimbangan dalam sistem pretitrasi. Karena konjugat antispesies yang digunakan, spesies yang merupakan tempat sampel serum diperoleh tidak dapat disamakan seperti p ada sistem pretitrasi.
2.5 KELEBIHAN ELISA
Terdapat empat alasan utama tentang penggunaan ELISA, dimana seperti yang ditunjukkan pada diagram (Gambar 2.13) berikut ini :
Gambar 2.13. Kelebihan utama ELISA
Pada Gambar 2.13 tersebut ditunjukkan bahwa ELISA memiliki empat kelebihan utama, diantaranya : 1. Versatile atau serbaguna 2. Simple atau sederhana 3. Sensitive 4. Quantifiable atau dapat digunakan sebagai metode untuk mengukur suatu kuantitas
