IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS UNIVERSIDAD DE NARIÑO DEPARTAMENTO DE QUIMICA Resumen: Para la determinación de distintos carbohidratos presentes en miel, leche, jugo de uvilla y una solución problema , los cuales se compararon con patrones de carbohidratos, se realizaron diferentes pruebas que se basan en la reactividad de los grupos funcionales carbonilo e hidroxilo que hacen parte de estos y les confieren la base para la mayoría de las reacciones usadas para su identificación; algunas de ellas fueron: prueba de Molisch, ácido múcico, Fehling, Benedict, Barfoed, Seliwanoff, Bial y Lugol. A través de estas estas pruebas pruebas se encontró que el jugo de uvilla uvilla contiene contiene glucosa y fructosa, fructosa, la leche contiene lactosa y ésta está formada por galactosa y glucosa, la miel contiene sacarosa (glucosa y fructosa), maltosa y galactosa y la solución problema contiene fructosa.
Palabras clave: carbohidratos, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, azúcares reductores.
Introducción Los carbohidratos son los compuestos orgánicos más abundantes de la biosfera y a su vez los más diversos. Normalmente se los encuentra en las partes estructurales de los vegetales y también en los tejidos animales, como glucosa o glucógeno. Estos sirven como fuente de energía para todas las actividades celulares vitales. En cuanto a la bioquímica elemental de los hidratos de carbono, podemos decir que son polihidroxicetonas o polihidroxialdehídos y sus derivados. Para los fines de estudio en nutrición solamente se tienen en cuenta aquellos con cuatro o más átomos de carbono. Estos compuestos son extremadamente polares y se unen entre si dando polímeros. Las funciones que cumplen en el organismo son, enérgeticas, de ahorro de proteínas, regulan el metabolismo de las grasas y estructural. En tanto a los tipos y fuentes de hidratos de carbono, existen tres tipos de carbohidratos: los monosacáridos, los oligosacáridos y los polisacáridos [1]. Los monosacáridos se clasifican de acuerdo con el número de átomos de carbono presentes (triosa, tetrosa, pentosa, etc.), y depende también de que
el grupo carbonilo se presente como un aldehído (aldosa) o como una cetona (cetosa). Ejemplos: glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa y xilosa [2]. La glucosa tiene fórmula empírica C6H12O6, la misma que la fructosa pero con diferente posición relativa de los grupos -OH y CO. Es una hexosa, es decir, que contiene 6 átomos de carbono, y es una aldosa, esto es, el grupo carbonilo está en el extremo de la molécula. Es una forma de azúcar que se encuentra libre en las frutas y en la miel. Es el azúcar que normalmente está presente en la sangre. La fructosa es una forma de azúcar encontrada en las frutas y en la miel. Tiene la misma fórmula empírica que la glucosa (C 6H12O6), forma un derivado pentaaecetilado y tiene las propiedades de un compuesto carbonílico. Es una cetosa y no una aldosa. La galactosa, galactosa , desde el punto de vista químico es una aldosa, es decir su grupo químico funcional es un aldehído (CHO) ubicado en el carbono 1. Por otra parte, al igual que la glucosa, la galactosa es una piranosa ya que teóricamente puede derivarse del anillo de seis lados formado por cinco átomos de carbono y uno de oxígeno, llamado pirano. La arabinosa posee cinco carbonos con un grupo aldehído por lo
que pertenece al grupo de las aldosas y dentro de éste al de las aldopentosas. De las dos formas D y L, el enantiómero ampliamente extendido en la naturaleza es la L-arabinosa, siendo uno de los constituyentes de la pectina y la hemicelulosa. La xilosa también llamada azúcar de madera es una aldopentosa, que tiene un isómero funcional que es la xilulosa. Tiene forma de pirano (hexágono) y se encuentra ampliamente distribuida en distintas materias vegetales: madera (cerezo), paja, etc. También se puede encontrar en los tejidos conectores como en el páncreas o el hígado. Los disacáridos están formados por dos monosacáridos unidos entre sí por enlaces glucosídicos. Ejemplos: (+)maltosa (azúcar de malta), (+)-celubiosa¸ (+)-celubiosa¸ (+)-lactosa (azúcar de leche) y sacarosa (azúcar de caña o remolacha). La maltosa se obtiene por hidrólisis parcial del almidón. La maltosa está formada por dos unidades de glucosa. Tiene fórmula molecular C12H22O11. Es un azúcar reductor. La (+)-lactosa tiene fórmula molecular C12H22O11. Es también un azúcar reductor forma osazonas y existe en formas alfa y beta. La lactosa es el azúcar principal en la leche humana y en la de vaca (de 4 a 8% de lactosa). La hidrólisis de la lactosa produce cantidades equimolares de D-galactosa y D-glucosa. La sacarosa es el compuesto orgánico de mayor producción en forma pura, tiene la fórmula molecular C12H22O11. Es un azúcar no reductor. Los oligosacáridos tienen entre tres y diez monosacáridos unidos también por enlaces glucosídicos. Las dextrinas son un grupo de oligosacáridos de poco peso molecular producidas por la hidrólisis del almidón. Tienen la misma fórmula general que los polisacáridos pero son de una longitud de cadena más corta. Los polisacáridos son polímeros naturales con varios miles de unidades de azúcar sencillo ligadas entre sí. Ejemplos: El almidón, glucógeno y celulosa. El almidón es la reserva
alimenticia de los vegetales, se hidroliza con mayor facilidad que la celulosa. El almidón se utiliza como alimento: papas, maíz, trigo, arroz, etc. Está formado por cuatro unidades de glucosa unidas principalmente por enlaces 1,4 alfa glicosídicos, aunque sus cadenas pueden presentar un número de ramificaciones unidas mediante enlaces 1,6 alfa glicosídicos. La hidrólisis parcial del almidón produce maltosa, y la hidrólisis completa produce solamente D-glucosa. El glucógeno se encuentra en tejidos animales, mayormente en el hígado y el tejido muscular y es la forma de almacenamiento de carbohidratos. El glucógeno posee unidades de 1,4glucosa repetidas, interrumpidas por puntos de ramificación 1,6, sin embargo el glucógeno tiene cadenas lineales más cortas que la de la amilopectina, con 12 a 18 residuos de glucosa y ramificación más frecuente. Entre los azúcares que son esenciales para la nutrición humana, se encuentran: la xilosa, la galactosa, la glucosa, la manosa, la N-acetilglucosaminíco, Nacetilgalactosamínico, la fructosa y el ácido sálico. Azúcar
Importancia
Fuente de Obtención
D-Glucosa
Constituye el carbohidrato del organismo. Es el azúcar que transporta la sangre y el que se encuentra en mayor proporción en los tejidos.
Néctar de frutas. Hidrólisis del almidón. Azúcar de Caña.
D-Fructosa
El hígado y el intestino, pueden transformarla en glucosa.
Néctar de frutas. Hidrólisis del azúcar de caña y de la insulina. Miel.
D-Galactosa
D-Manosa
El hígado puede transformarla en glucosa. Forma la lactosa de la leche materna. Es un constituyente del polisacárido prostético de las albuminas.
Hidrólisis de la lactosa. Hidrólisis de las manosas vegetales. Gomas.
Tomado de: Rodríguez, G. León, P. L. (1984). Bioquímica. Buenos Aires: Lizar. Además de reconocer si un compuesto pertenece a la familia de los carbohidratos, es necesario diferenciar si
se trata de un monosacárido tipo aldosa o cetosa, si es fácilmente oxidable o no, es decir si es un azúcar reductor o no lo es, si es de cinco o seis átomos de carbono, si es disacárido o polisacárido [3] . Existen varias pruebas químicas con las cuales se identifican los carbohidratos entre ellas se encuentran: Ensayo de Molisch: Esta prueba es un ensayo para reconocimiento general de carbohidratos en el que los polisacáridos y disacáridos se hidrolizan con ácido sulfúrico concentrado hasta monosacáridos y se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural los cuales reaccionan con α naftol formando un anillo de color púrpura violeta Ensayo de Benedict: El ensayo de Benedict permite el reconocimiento de carbohidratos reductores, al igual que el reactivo de Felhing, el de Benedict contiene ion cúprico en medio alcalino que se reduce hasta óxido cuproso en presencia de azúcares con el hidroxilo hemiacetálico hemiacetálico libre. Ensayo de Barfoed: Esta prueba permite diferenciar entre monosacáridos y disacáridos reductores, también contiene ion cúprico que se reduce hasta óxido cuproso más rápidamente con los monosacáridos que con los disacáridos. Ensayo con Lugol: El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer polisacáridos, particularmente el almidón por la formación de una coloración azul-violeta intensa y el glicógeno y las dextrinas por formación de coloración roja. Ensayo de Seliwanoff: Este ensayo es específico para cetosas y se basa en la conversión de la cetosa en 5-hidro-metilfurfural y su posterior condensación con resorcinol formando así complejos coloreados. Ensayo de Bial: El reactivo de Bial contiene orcinol en ácido clorhídrico, el cual forma complejos de coloración sólo con las pentosas.
Resultados y discusión Tabla 1. Resultados de la identificación de carbohidratos M
P
l e i M
e h c e L
a m e l b o r a p l l . i n v l U S
Molish
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A.múcic o Fheling Benedict Barfoed Seliwano ff Bial Lugol
a a a s s s o o r o t a c c c u u l a r G F S
n ó d i m l A
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o a a n s s e o a a o a t n g s i a c s i r ó s n o o t a t b t l l x c c o u a l a a a e l i r G L D G X A M
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PRUEBA DE MOLISCH RECONOCIMIENTO CARBOHIDRATOS
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PARA DE
Figura 1. Prueba de Molish Se considera que la reactividad de los hidratos de carbono es debida fundamentalmente, a los grupos funcionales carbonilo e hidroxilo, que les confieren a su vez la base para la mayoría de las reacciones usadas para su identificación y cuantificación, algunas de las cuales se llevaron a cabo en la práctica. La primera prueba que se realizó para determinar la presencia de carbohidratos en las diferentes muestras biológicas, fue la prueba de Molisch, dicha prueba se constituye en un punto de partida, ya que permite la identificación de azúcares en
general (es una reacción general para carbohidratos que contienen más de 5 átomos de carbono). Entendiéndose como azúcar, un compuesto químico del grupo de los hidratos de carbono que se disuelve en agua con facilidad; entre cuyas propiedades están el ser incoloros, inodoros y normalmente cristalizables. A todos se les confiere un sabor más o menos dulce. En general, a todos los monosacáridos, disacáridos y trisacáridos se les denomina azúcares para distinguirlos de los polisacáridos como el almidón, la celulosa y el glucógeno. Es por ello que la glucosa, fructosa y sacarosa, monosacáridos monosacáridos los dos primeros y disacárido el último, dieron positiva esta prueba, al presentarse la aparición de un anillo violeta-.rojizo en el sitio de contacto de los dos líquidos (Tabla 1), ya que los ácidos concentrados originan una deshidratación de los azúcares para rendir furfurales, que son derivados aldehícos del furano, posteriormente los furfurales se condensan con los fenoles para dar productos coloreados característicos. La ecuación de la reacción de Molisch, se representa en la figura 1.
PRUEBA DEL ÁCIDO MÚCICO PARA RECONOCIMIENTO DE GALACTOSA
quercita y la mayoría de las variedades de goma natural que incorporan ácido nítrico. Es por ello que tanto la galactosa como la lactosa dieron respuesta positiva a la prueba de ácido múcico (Tabla 1), lo cual se evidenció debido a que en los tubos que las contenían, la solución resultante era transparente, confirmando la presencia de ácido múcico. Esta prueba permite diferenciar la galactosa o los azúcares que la contienen, de las demás aldohexosas por formación de un ácido sacárico que es el ácido múcico. El ácido sacárico cristalino es insoluble en ácido nítrico diluido. El ácido nítrico concentrado oxida los dos carbonos terminales de las aldohexosas formando los correspondientes ácidos sacáricos. En general, los ácidos sacáricos son solubles en ácido nítrico diluido, pero el ácido múcico es insoluble en estas condiciones, por lo que precipita como cristales transparentes si la solución se enfría rápidamente. Dichos cristales fueron observados en un microscopio óptico, presentando una apariencia alargada.
AZÚCARES REDUCTORES PRUEBA DE FHELING
Figura 3. Prueba de Fheling
Figura 2. Prueba de ácido múcico El ácido múcico, C 6H10O8, se obtiene por la oxidación del azúcar de la leche (lactosa), la dulcita, la galactosa, la
La prueba de Fehling o la prueba de Benedict, permiten determinar si un carbohidrato es o no reductor, sin embargo estas reacciones son menos útiles de lo que parecen, ya que entre otras cosas, no sirven para diferenciar aldosas de cetosas.
El reactivo de Fehling es un agente oxidante moderado, el cual permite la oxidación de los grupos aldehídos al mismo tiempo que éste se reduce. Consiste de dos partes: una parte está constituida por una solución de sulfato cúprico, y la otra por hidróxido de sodio y tartrato de sodio potasio (sal de Rochelle). Al mezclar cantidades iguales de estas dos soluciones, se forma un complejo soluble de tartrato cúprico, de color oscuro, el cual proporciona una pequeña concentración de iones cúprico. La presencia de carbohidratos reductores queda evidenciada, ya que el grupo aldehído reduce la solución de Fehling y forman un precipitado rojo ladrillo de óxido cuproso. El hidróxido de sodio y el tartrato que contiene el reactivo de Fehling, son empleados, ya que actúan como agentes quelantes, para que el ion cuproso no se precipite como hidróxido cúprico e interfiera con la reacción. El tartrato no puede formar complejos con el ión cuproso, de manera que la reducción del ion cuproso a cúprico, al reaccionar con los carbohidratos, provoca la formación de un precipitado rojo ladrillo, proveniente del óxido cuproso, cuando la reacción es positiva. Pero, las cetosas también dan positiva a la reacción de Fehling, ya que en condiciones básicas se tautomerizan a aldosas, debido a un equilibrio cetoenólico, catalizado por el medio básico y la adición de energía, en este caso representados por el hidróxido de sodio y el calentamiento. En el caso de la fructosa, ésta se isomeriza a Glucosa y Manosa. Todos los monosacáridos, sean aldosas o cetosas, son azúcares reductores, como lo son también la mayoría de los disacáridos, siendo una excepción importante la sacarosa (azúcar común de mesa), que no es reductora, ya que es un disacárido formado por la unión de dos monosacáridos mediante un enlace glucosídico que se efectúa entre dos carbonos anoméricos, por lo cual no
presenta el potencial aldehído o cetona libre, es por ello que la glucosa y la fructosa dieron una respuesta positiva a esta prueba, mientras que la sacarosa dio respuesta negativa (Tabla 1). Finalmente cabe mencionar que la ecuación de la reacción de Fehling, se representa en la figura 3.
PRUEBA DE BENEDICT
Figura 4. Reacción de Benedict Una de las reacciones más comunes en la identificación de carbohidratos es la reacción de Benedict. Esta reacción es específica para azúcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los monosacáridos poseen un grupo reductor libre. Los disacáridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando ésta es formada. Este reactivo contiene sales cúpricas que le dan un color azul al reactivo. En medio alcalino el ion cúprico Cu +2 se transforma en hidróxido cúprico y éste en presencia de un azúcar reductor se transforma en hidróxido cuproso que a su vez, por acción del calor se transforma en óxido cuproso, el cual es insoluble en agua y produce un precipitado de color rojo y amarillento a bajas concentraciones. La glucosa al ser un azúcar simple y al reaccionar con el reactivo de Benedict formó un precipitado de color rojo, puesto que las formas cíclica de esta azúcar está en equilibrio con la correspondiente forma lineal aldehídica, un reactivo reacciona con el azúcar eliminando del equilibrio la forma abierta, la glucosa se
oxidó dando lugar a la reducción del sulfato de cobre (II), de color azul, a óxido de cobre (I) de color rojoanaranjado. La sacarosa dio la reacción de Benedict negativa debido a que esta es un disacárido que no posee carbonos anoméricos libres por lo que carece de poder reductor. Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza, es decir incorpora una molécula de agua y se descompone en los monosacáridos que la forman, glucosa y fructosa que si son reductores. La prueba puede o podría haberse verificado con la hidrólisis que se realiza con el reactivo de Fheling y si el resultado es positivo aparecería un precipitado rojo. Si el resultado es negativo, la hidrólisis no se ha realizado correctamente y si en el resultado final aparece una coloración verde se debe a una hidrólisis parcial de la sacarosa {4}.
calentamiento se prolonga unos minutos más, los disacáridos podrían dar una prueba positiva. (Ver tabla 1). Los disacáridos tienen menor poder reductor al tener comprometido uno de sus carbonos anoméricos en el establecimiento del enlace glucosídico, no reaccionan y por lo tanto dan un resultado negativo.
Figura 5. Prueba positiva para la fructosa
PRUEBA PARA EL RECONOCIMIENTO RECONOCIMIENTO DE CETOSAS (SELIWANOFF)
PRUEBA DE BARFOED PARA DISTINGUIR ENTRE MONOSACÁRIDOS MONOSACÁRIDOS Y DISACÁRIDOS RCOH + 2Cu+2 + 2H2O → Cu2O↓ + 4H+
RCOOH +
Ec.1 Prueba De Barfoed Esta prueba sirve para distinguir monosacáridos reductores de disacáridos reductores, basándose en la velocidad de reacción, en los monosacáridos la formación del óxido cuproso es más rápido que en los disacáridos. La reacción consiste en utilizar acetato cúprico y ácido acético con lo que sólo los monosacáridos son capaces de reducir al cobre. La formación de un precipitado rojo entre 5 y 7 minutos, es prueba positiva para monosacáridos reductores, lo que indica que los carbohidratos: glucosa y fructosa están incluidos en este grupo. La maltosa y lactosa, son disacáridos y por ende dan una prueba negativa, pero si el
Figura 6. Prueba de Seliwanoff Esta prueba es específica para cetosas que contengan 5 o más átomos de carbono. En presencia de un ácido fuerte producen rápidamente derivados furfúricos que reaccionan con resorcinol, este condensa con los fufurales derivados de cetosas originando un color rojo-anaranjado intenso. Este fenómeno se desencadena porque las cetosas se deshidratan a mayor velocidad que las aldosas. En las condiciones en las que se efectúa el ensayo, todas las cetosas que puedan estar unidas por enlaces glucosídicos, quedaran en libertad y darán una reacción positiva como ocurre con el residuo de fructosa derivado de la sacarosa. Según la tabla 1. Los carbohidratos: fructosa y sacarosa reaccionan con el reactivo de Seliwanoff y forman el producto coloreado; mientras que la
glucosa no reacciona, esto quiere decir que, la última no pertenece al grupo de las cetosas si no al de las aldosas. En la figura 6 se muestra la reacción de la fructosa con el reactivo de Seliwanoff formando un complejo coloreado rojoanaranjado.
PRUEBA BIAL PENTOSAS
PARA RECONOCER
Figura 7. Prueba de Bial Cuando se calientan pentosas con HCl concentrado se forma el furfural, este se condensa con orcinol en presencia de iones férricos para dar un color verde azulado. Esta prueba es positiva para la xilosa y arabinosa, porque son pentosas. Mientras que la glucosa pertenece al grupo de las hexosas y por tanto no hay reacción. La reacción no es absolutamente específica para las pentosas, ya que el calentamiento prolongado de algunas hexosas produce hidroximetil furfural que también reacciona con orcinol para dar productos coloreados.
RECONOCIMIENTO DE POLISACÁRIDOS CON EL REACTIVO DE LUGOL
El yodo forma complejos coloreados de absorción con los polisacáridos. El almidón al combinarse con solución de yodo en yoduro de potasio toma una coloración azul. Mientras, que si la reacción se efectúa con glucógeno y almidón parcialmente hidrolizado da un color pardo rojizo. El almidón es un polisacárido vegetal formado por dos componentes: la amilosa (figura 8.1) y la amilopectina (figura 8.3). La primera se colorea de azul en presencia de yodo debido no a una reacción química sino a la adsorción
o fijación de yodo en la superficie de la molécula. Se forma un complejo de coordinación entre las micelas de almidón y yodo. Estas micelas están formadas por cadenas polisacáridas enrolladas en hélices (figura 8.2). El color observado desaparece cuando se somete a calentamiento la solución, lo cual destruye el complejo formado por el yodo y almidón. Por lo anterior esta prueba se lleva a cabo en frio. La reacción con las muestras biológicas dio negativa porque estos alimentos no están formados por polisacáridos, sino por azucares simples.
Conclusiones A través de estas pruebas y realizando la comparación con las muestras biológicas se concluye que; el jugo de uvilla contiene glucosa y fructosa, ya que dio reacción positiva en las pruebas de Molisch, Fehling y Barfoed, porque se consideran monosacáridos reductores, y reacción positiva en la prueba de Seliwanoff para la fructosa, que es una cetosa. La leche contiene lactosa, que se hidroliza en galactosa y glucosa, por tanto dio positiva a las pruebas de Molisch, ácido múcico, Fehling. La miel de abeja contiene principalmente principalmente glucosa y fructosa, ya que dio positiva a las pruebas de Molisch, Benedict, Fehling y Barfoed, también contiene galactosa al dar positiva la prueba de ácido múcico. Con los datos de la tabla 1 se concluye que la solución problema contenía carbohidratos dando positiva a la prueba de Molisch, una vez comprobada su presencia se procedió a realizar la prueba de Benedict mediante la cual se encontró que dicha muestra contenía un carbohidrato reductor, mediante la prueba de Barfoed se determinó la presencia de un monosacárido debido a la formación de
un precipitado rojo amarillento, con la prueba de Seliwanoff se estableció que la muestra es una cetosa, esto fue evidente por la reacción inmediata ya que esta se caracteriza por tener en su cadena un grupo carbonilo en el carbono 2. Con la prueba de Bial se concluye que la cetosa no es una pentosa porque dio prueba negativa y finalmente con la prueba de lugol se reafirmó reafirm ó que se trataba de un monosacárido ya que esta prueba resultó negativa, ya que esta se utiliza para identificación de polisacáridos. Con esto se puede deducir que la cetosa puede corresponder a la fructosa debido a que esta es una hexosa y es un monosacárido reductor.
Bibliografía [1] Morrison y Boyd, Química orgánica, quinta edición, Adison Wesley Iberoamericana S.A, 1990. [2] Hart Harold, Química orgánica, novena edición, McGraw-Hill, 1995. [3] Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano, GUIA 7: reconocimiento e identificación de carbohidratos. [4] KAIRUZ de Civeta, Luz A. “Introducción al estudio de la composición de alimentos”. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. 1984 Pag. 31,68,108,109