UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
“EFECTO DE LA DOSIS DE LA ENZIMA PROTEOLITICA EN LA HIDRÓLISIS DE PROTEINA DE ANCHOVETA Engraulis ringens)!
PROYECTO TRABAJO DE INVESTIGACION INVESTIGACION
AUTORES: BALLICO ROBLES CESAR MANUEL M ANUEL CABRERA CALDERON CALDERON MILAGRITOS MILAGRITOS CECILIA
ASESOR: MS. GILBERT RODRIGUEZ PAUCAR PAUCAR
NUEVO CHIMBOTE – PERU 2010
PROYECTO DE INVESTIGACION I. GENERALIDADES: 1.1 T"#$%& “Efecto de la Dosis de la Enzima Poteol!tica en la "id#lisis de Pote!na de Anc$o%eta & Engraulis ringens' “
1.2 P'()&*+% I*,')#"-+&(
(allico Ro)les Cesa Man*el
Ca)ea Calde#n Mila+itos Cecilia
1./ F+$%#+ + %+ $' P'(#'*'' Fac*ltad de In+enie!a E,A,P In+enie!a A+oind*stial Uni%esidad Nacional del Santa
1. T"3& ' I*,')#"-+"4* E-.eimental / A.licada
1.5 L$-+( &*' )' ')+((&%%+(+ '% P(&6'#& N*e%o
C$im)ote0
La)oatoio
de
com.osici#n
a+oind*stiales0 La)oatoio de In%esti+aci#n,
de
.od*ctos
1.7 (&*&-(+8+ ' +#","+') MESES ACTIVIDADES
AGOSTO
1. ELABORACION Y PREPARACION DEL PROYECTO 2. REVISION BIBLIOGRAFICA
SETIEMBRE
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3. PRESENTACION DEL PROYECTO 4. APROBACION DEL PROYECTO 5. EJECUCION DEL PROYECTO 6. ANALISIS DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES 7. REDACCIÓN DEL INFORME FINAL
OCTUBRE
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8. PRESENTACION DEL INFORME FINAL . SUSTENCION DEL INFORME
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NOVIEMBRE
DICIEMBRE
ENERO
FEBRERO
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II. PLAN DE INVESTIGACION 2.1 ANTECEDENTES Se+1n (, Camac$o &2342' dice0 s* o)5eti%o f*e o)tene $idolizados .oteicos .o %!a enzim6tica a .ati de cai)e coloado, Seleccion# *n lote de 789+ de es.ecimenes ad*ltos0 e%isceados0 .o%eniente del !o I+:es &M*nici.io El (a1l0 Co5edes0 ;enez*ela', Cada es.23?C, La $id#lisis f*e catalizada .o *na .oteasa comecial +ado alimenticio &Alcalase @ 4,L', El m6-imo +ado de $id#lisis &G"' alcanzado f*e 2807B, El endimiento en $idolizado .oteico des$idatado &"PD' se incement# con el G"0 siendo el m6-imo %alo alcanzado 20+ "PD288+ de m1sc*lo molido $1medo, Los $idolizados .esentaon %aiaciones si+nificati%as &P8087' en la com.osici#n .o-imal / en las .o.iedades f*ncionales, La $id#lisis .oteica del .escado cai)e coloado con Alcalase es *na altenati%a ecomenda)le .aa el a.o%ec$amiento de esta es.ecie =*e en la act*alidad es de .oco %alo comecial, Se+1n A*e9oet-ea dice
se caacteizaon %aios ec*sos .es=*eos
II. PLAN DE INVESTIGACION 2.1 ANTECEDENTES Se+1n (, Camac$o &2342' dice0 s* o)5eti%o f*e o)tene $idolizados .oteicos .o %!a enzim6tica a .ati de cai)e coloado, Seleccion# *n lote de 789+ de es.ecimenes ad*ltos0 e%isceados0 .o%eniente del !o I+:es &M*nici.io El (a1l0 Co5edes0 ;enez*ela', Cada es.23?C, La $id#lisis f*e catalizada .o *na .oteasa comecial +ado alimenticio &Alcalase @ 4,L', El m6-imo +ado de $id#lisis &G"' alcanzado f*e 2807B, El endimiento en $idolizado .oteico des$idatado &"PD' se incement# con el G"0 siendo el m6-imo %alo alcanzado 20+ "PD288+ de m1sc*lo molido $1medo, Los $idolizados .esentaon %aiaciones si+nificati%as &P8087' en la com.osici#n .o-imal / en las .o.iedades f*ncionales, La $id#lisis .oteica del .escado cai)e coloado con Alcalase es *na altenati%a ecomenda)le .aa el a.o%ec$amiento de esta es.ecie =*e en la act*alidad es de .oco %alo comecial, Se+1n A*e9oet-ea dice0 se caacteizaon %aios ec*sos .es=*eos infa*tilizados &es.ecies de )a5o inte
s*stato0 la elaci#n enzimas*stato0 el tiem.o de inc*)aci#n / las condiciones fisico=*!micas tales como el ." / la tem.eat*a0 oto facto tam)i
2.2 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 2.2.1 A*9&,'#+ N&8(' C"'*#;<"&H En+a*lis in+ens N&8(' C&8=*H Anc$o%eta N&8(' '* I*-%')H Anc$o%/ N&8(' FAOH Anc$o%eta .e*ana,
CARACTER>STICAS DE LA ESPECIE: La anc$o%eta es *na es.ecie .el6+ica0 de talla .e=*ea0 =*e .*ede alcanza $asta los 48 cm, de lon+it*d total, S* c*e.o es ala+ado .oco com.imido0 ca)eza la+a0 el la)io s*.eio se .olon+a en *n $ocico / s*s o5os son m*/ +andes, S* colo %a!a de az*l osc*o a %edoso en la .ate dosal / es .lateada en el %iente, ;i%e en a+*as modeadamente f!as0 con an+os =*e oscilan ente 2JK / 4KC en %eano / de 2K a 23KC en in%ieno, La salinidad .*ede %aia ente ,7 / 7,2 *nidades .6cticas de salinidad &UPS', La anc$o%eta tiene $6)itos altamente +e+aios fomando enomes / e-tensos cad1menes =*e en .eiodos de alta dis.oni)ilidad0 facilita =*e s*s ca.t*as sean de +an ma+nit*d,
PATRONES DE DISTRIBUCIÓN Y ABUNDANCIA
En .eiodos nomales es ca.t*ada en la fan5a costea0 dento de las J8 millas n6*ticas / a .of*ndidades menoes de 288 metos, S* disti)*ci#n %etical est6 en elaci#n con las condiciones am)ientales ,
ASPECTOS BIOLOGICOS +. E+ 6 C('"8"'*#& La anc$o%eta es *na es.ecie de cecimiento 6.ido0 s* in+eso a la .es=*e!a se da a *na talla ente 3 a cm de lon+it*d total &7 a J meses de edad'0 .inci.almente ente diciem)e / a)il0 siendo los +*.os de edad de *no / dos aos los =*e constit*/en ma/omente las ca.t*as,
. R'3(&$"4* La
anc$o%eta
tiene
se-os
se.aados0 alcanza s* mad*ez se-*al a los 24 cm / se e.od*ce mediante la .od*cci#n de $*e%os .o .ate de las $em)as0 =*e son fetilizados .o el mac$o en el a+*a / el em)i#n se desaolla f*ea del c*e.o de la $em)a, El deso%e de la anc$o%eta a)aca casi todo el ao0 con dos .eiodos de ma/o intensidad0 el .inci.al en in%ieno &a+osto>setiem)e' / oto en el %eano &fe)eo>mazo',
. A%"8'*#+"4* La anc$o%eta es .lanct#fa+a .o e-celencia0 es deci =*e se alimenta e-cl*si%amente
de
.lancton
&fito.lancton
/
zoo.lancton',
D*ante e%entos El Nio0 la anc$o%eta se alimenta ma/omente de co.<.odos / e*fa*sidos dismin*/endo el cons*mo de fito.lancton en s* dieta,
PES?UERIA +. F%&#+ 6 +(#') ' 3')+ La .esca de anc$o%eta se ealiza a lo la+o de todo el litoal .e*ano, La ca.t*a de anc$o%eta se ealiza con
em)acaciones
de
ceco0
com1nmente
conocidas como “)olic$eas / *tilizan edes con a)et*a de malla de 2 mm, La anc$o%eta tam)i
. C+3#$(+) La seie $ist#ica de ca.t*as de anc$o%eta desde 278 al 48870 m*esta *n cecimiento im.otante de las ca.t*as des.*30 con *n m6-imo en 20 dismin*/endo .o efecto del Nio 2>30 se+*ido .o *na 6.ida ec*.eaci#n en 2 / el 4888,
. E,+%$+"4* La e%al*aci#n de la .o)laci#n de anc$o%eta
en
el
Pe10
es
efect*ada .o el Instit*to del Ma del Pe1 &IMARPE'0 con la finalidad de localiza / e%al*a los cam)ios de a)*ndancia0 disti)*ci#n / accesi)ilidad en elaci#n con el medio am)iente en =*e %i%e, De)ido a la im.otancia de este ec*so el IMARPE $a montado *n sistema de se+*imiento / monitoeo )asado enH *n se+*imiento en tiea &se c*enta con La)oatoios Re+ionales / La)oatoios tem.oales'0 *n se+*imiento a )odo de em)acaciones de la Flota Ind*stial &Po+ama (it6coas de Pesca / O.eaciones EUREA' / C*ceos de E%al*aci#n, IMPORTANCIA ALIMENTICIA
Este ec*so es *na %aliosa f*ente .ote!na animal de alta calidad, S* alto contenido de lisina / otos amino6cidos esenciales la $acen .atic*lamente adec*ada .aa el com.lemento de dietas icas en ca)o$idatos, Es ico en
mineales comoH .otasio0 $ieo0 f#sfoo / calcio, S* com.onente +aso c*enta con *na nota)le .esencia de %itamina A / D0 constit*/endo *na %aliosa f*ente de 6cidos +asos m*/ necesaios .aa *n adec*ado desaollo del cee)o / el c*e.o, La anc$o%eta0 en .atic*la es la es.ecie =*e .esenta los m6s altos contenidos de ome+a >0 .inci.almente 6cidos +asos .olinsat*ados &EPA / D"A', En los 1ltimos aos0 el desc*)imiento =*e el cons*mo de este ti.o de 6cidos +asos .o.ociona )eneficios en fisiolo+!a $*mana dismin*/endo los ni%eles de colesteol en la san+e / .e%iniendo la oc*encia de enfemedades cadio%asc*laes $an $ec$o de =*e a la anc$o%eta se le .este *n ma/o inte
2.2.2 ENZIMA PROTEOLITICA La ma/o!a de las enzimas meta)#licas0 las enzimas =*e e+*lan todo0 desde las f*nciones del $!+ado $asta las f*nciones de sistema inm*nol#+ico0 son .oteasas0 o enzimas .oteol!ticas las c*ales e+*lan la f*nci#n .oteica en el o+anismo, Las enzimas .oteoliticas o .oteasas son *n +*.o de enzimas =*e descom.one en *nidades mas .e=*eas las .ote!nas, Las enzimas .oteol!ticas om.en la cadena la+a de mol
Las .oteasas se .od*cen de manea nat*al en el o+anismo / constit*/en ente el 2B / el 7B del contenido +en
E*@"8+: D'%,&%+)' - Es *na .oteasa alcalina nota o)tenida .o c*lti%o s*me+ido de *na ce.a
seleccionada de (acill*s lic$enfomis, - Es *na .oteasa alcalina llamado tam)i
es *na .oteasa seina .o=*e containen *n amino6cido seina en s* cento catal!tico,
D'3'*'*"+ ' %+ A#","+ )&(' 3H 6 T'83'(+#$(+ +. 3H Del%olase en sol*ci#n es esta)le ente ." 807 / 28, .tima acti%idad de 07 / 2807, Es dif!cil .ecisa las condiciones #.timas .o=*e el efecto del ." tam)i
. T'83'(+#$(+ El efecto so)e la acti%idad tem.eat*a es0 .o s*.*esto0 las de.endencias .o el tiem.o0 con *na eacci#n de 8 min*tos0 la acti%idad es +enealmente #.tima a J8 KC,
Del%olase se6
com.letamente inacti%ada si la sol*ci#n enzim6tica se mantiene a 8 KC d*ante 27 min*tos
. A3%"+"&*') - Del%olase es m*/ adec*ado c*ando la acti%idad de endo.e.tidasa
se e=*iee a.licaciones m*/ am.lias en las ind*stias de los alimentos =*e sean .osi)les &$aina de .escado0 $aina de so/a0 +elatina0 case!na o de cane', - Se ecomienda aadi ente 808B / 8027B de .ote!nas del%olase
en )ase seca / se inc*)a d*ante 4 a J $oas $asta 78 o J8 KC, - Tem.eat*a s*.eio a J7 K C de)en se e%itados de)ido a la
inacti%aci#n de la acti%idad enzim6tica, Paa los ceeales $id#lisis de .ote!nas0 =*e ecomiendo a n*estos .oteasa de (acill*s s*)tilis0 =*e es *na .oteasa de ." ne*to,
2.2./. HIDRÓLISIS PROTEINA La $id#lisis enzim6tica de .ote!nas es *n .oceso =*e tansc*e a ta%
proteosas
peptonas
péptidos
aminoácidos
Cada *na de estas es.ecies intemedias0 se difeencia )6sicamente de las otas en s* sol*)ilidad0 / se coes.onde a.o-imadamente con los tamaos molec*laes medios &M' / con la elaci#n nit#+eno aminonit#+eno total &ANTN' =*e se eco+en en la Ta)la 4 &ni+$ts 1985),
TABLA II:
C+(+#'(;)#"+) ' %+) ')3'"') 3(&$"+) '* %+ 9"(4%")") ' 3(&#';*+).
Pote!nas
M
ANTN
Q 48888
8,82
Poteosas
7888 > 28888
8,82
Pe.tonas
2888 > J888
8,2 > 8,7
Pe.tidos
488 788
8,7 > 8,3
7 > 488
8,3 > 8,
Amino 6cidos
La $id#lisis .oteica se ealiza nomalmente en *n eacto0 con contol de a+itaci#n0 ."0 tem.eat*a / tiem.o del .oceso, El s*stato se dis*el%e o es*s.ende en a+*a $asta =*e el ." / la tem.eat*a se esta)ilizan a contin*aci#n se a+e+a la .oteasa dando inicio a la $id#lisis, A medida =*e esta .o+esa se .od*ce *na dismin*ci#n del ." de)ido a la ot*a de los enlaces .e.tidicos, En los casos de $id#lisis enzim6tica el ." de)e se mantenido en el #.timo de la enzima mediante la adici#n de )ase dil*ida, Paa finaliza la $id#lisis .oteica la enzima .*ede se inacti%ada con calo0 mediante *na dismin*ci#n de ." o con *na com)inaci#n de am)os, O tam)i
2.2.. DETERMINACIÓN DEL GRADO DE HIDROLISIS El +ado de $idolisis &G"' definido como el .ocenta5e de li+aciones .<.ticas cli%adas0 se6 calc*lado .o el mNissen &23J',
1. 3H stat Las condiciones de eacci#n .aa la o)tenci#n de los $idolisados .oteicos de amaanto &"PA' con la enzima Alcalasa 40L &No%oz/mes' f*eonH elaci#n EHS &2H780 ..'0 ." 308 / J8KC .aa las s*s.ensiones de concentado .oteico de amaanto &CPA'0 con 28B de m*esta &.%', La enzima Alcalasa f*e adicionada des.*stat 0 *tilizando el tit*lado a*tom6tico Metle Toledo modelo DL 47 &Sc$ezen)ac$0 Sitzeland' / el ." f*e mantenido constante .o la adici#n cont!n*a de NaO" 2N, El +ado de $id#lisis &G"' f*e calc*lado de ac*edo con Adle>Nissen &23J', Al alcanza 24B de +ado de $id#lisis &G"'0 la eacci#n f*e inte*m.ida .o el calentamiento a 8?C .o 28 min0 centif*+ada &2788 - g 28 min42?C' / el so)enadante0 conteniendo la .ote!na $idolisada0 f*e con+elada / liofilizada,
El m
%GH =
β x Νb x 1 x 1 x 100 ΜΡ x α x Η tot
D&*': βH Cons*mo de la )ase
N)H Nomalidad de la )ase αH Gado de disociaci#n de los +*.os aminos
MPH Masa de la .ote!na "totH N1meo total de li+aciones .<.ticas en el s*stato, El +ado de disociaci#n de los +*.os aminos & α'0 es e-.esado comoH
α
=
10 pΗ − pΚ 1 + 10 pΗ − pΚ
2./ JUSTIFICACION E IMPORTANCIA En este ta)a5o se desci)i6n las t
En la ind*stia alimentaia se *tilizan act*almente concentados / aislados .oteicos de so/a0 de $*e%o / de s*eo de lec$e con la finalidad de a*menta el %alo n*ticional de los alimentos / tam)i
la
sal*d0
=*e
son
los
llamados
alimentos
f*ncionales,
2. FORMULACION DEL PROBLEMA C#mo infl*/e el efecto de la Dosis de la Enzima Poteol!tica en la "id#lisis de la Pote!na de la Anc$o%eta & Engraulis ringens )V
2.5 HIPOTESIS La Dosis de la Enzima Poteol!tica om.e la cadena la+a de mol
INDICADORES • Tem.eat*a
;, Inde.endiente
• Concentaci#n S*stato • Concentaci#n Enzima • Acidez
;, De.endiente
• ." • Com.osici#n W*!mica &.ote!nas0 6cidos +asos'
2.7 OBETIVOS A. OBEJTIVO GENERALES • E%al*a el efecto de la dosis de enzima .oteol!tica en la $idolisis de
.ote!na de la Anc$o%eta
B. OBJETIVOS ESPECIFICOS
E%al*a el +ado de $id#lisis,
E%al*a las caacte!sticas eol#+icas de la $id#lisis,
E%al*a / analiza amino6cidos,
2. MATERIALES Y METODOS •
M+#'("+ P("8+: Anc$o%eta
•
R'+#",&): Enzima Poteol!tica
•
E$"3&) 6 M+#'("+%') Fementado
•
I*)#($8'*#&)
(alanza
Tem#meto
Refact#meto
Relo5 o conometo
." > meto
;iscos!meto
Se *tiliza mateia .ima totalmente fesca / *n .oceso enzim6tico =*e cola)oa con la *.t*a cel*la / .o lo tanto0 con la sol*)ilizacion de las .ote!nas en medio ac*oso, Estas 1ltimas son inacti%adas l*e+o del .oceso .aa detene la eacci#n de $id#lisis,
III. DISEO DE CONTRASTACION /.1 DESCRIPCION DEL MODELO TECNOLOGICO o
M+#'("+ P("8+: La anc$o%eta se ece.ciona6 .e%ia ins.ecci#n0 se .esa / almacena $asta el momento de ela)oaci#n, Es con%eniente *sa anc$o%eta en )*en estado o+anol<.tico,
o
D'),")'(+& 6 ')+'@+&:
A=*! se ealiza *n lim.ieza +eneal0 con el .e%io etio de ca)eza0 cola0 %!sceas / etiando la .ate es=*el
L+,+&: Con a+*a .ota)le0 .aa elimina las .at!c*las e-taas ad$eidas a la cane &san+*aza'
o
C&"*+&: Se sancoc$a la cane $asta =*e a .*nto de e)*llici#n del l!=*ido0 manteniendo .o 28 min*tos
o
L"$+&: La anc$o%eta cocida0 se lic*o con la finalidad de o)tene *n .*l.eado de la cane,
o
H"(4%")") P(&#'"+: Se lle%e el .*l.eado a *n )ioecto a *na dil*ci#n de 2H0 l*e+o se a+e+a la enzima .oteolitica este .oceso se ealiza a *na tem.eat*a de 78?C J8?C0 $asta lle+a a *n ." constante &ne*to'
/.2 DISEO EPERIMENTAL La e-.eimentaci#n foma .ate nat*al de la ma/o!a de las in%esti+aciones cient!ficas e ind*stiales0 en m*c$as de las c*ales los es*ltados del .oceso de inte
OPTIMIZACIÓN Las %aia)les de contol m6s im.otantes en la eacci#n enzim6tica sonH tem.eat*a0 ."0 la nat*aleza de la .ote!na *tilizada como s*stato0 acti%idad es.ec!fica / concentaci#n de enzima, La elecci#n adec*ada de la .oteasa .aa *na $id#lisis en .atic*la e=*iee de *na in%esti+aci#n sistem6tica0 donde de)en se est*diadas las condiciones #.timas de acci#n de la .oteasa so)e el s*stato, Adem6s0 se de)e toma en c*enta s* accesi)ilidad comecial0 )a5o costo0 es.ecificidad en el om.imiento de enlaces .e.t!dicos / las caacte!sticas del s*stato, Po e5em.lo0 el te5ido
m*sc*la de .escado se caacteiza .o se ico com.*esto nito+enado0 efle5ado en *n ." ma/o de 7,7 .o%ocado .o l tansfomaci#n del +l*co+eno m*sc*la en acido l6ctico, Po lo tanto0 seia desea)le lle%a la $id#lisis sin a5*stes d6sticos de ."0 esto se lo+a con .oteasas c*/a acti%idad .oteolitica se de en condiciones ne*tas o li+eamente alcalinas, Paa la o.timizaci#n de las condiciones de *na eacci#n de $id#lisis0 es necesaio defini el efecto de las %aia)les de contol so)e las %aia)les de es.*esta del .ocesoH .ocenta5e de enlaces .e.tidicos $idolizados o +ado de $id#lisis &G"'0 cantidad de $idolizado o)tenido o .ocenta5e de Nit#+eno Rec*.eado &NR' / el Pefil de Pesos Molec*laes de las facciones .e.tidicas o)tenidas &PPM'
ANALISIS FISICO ?UIMICOS Ente los an6lisis de la mateia .ima / .od*cto final tenemosH
+ H$8'+. Pesa 28 +amos de m*esta en *na .laca .eti .aa l*e+o colocala en la est*fa .o 4 $oas a 287 KC0 *na %ez c*m.lido el tiem.o se etia la m*esta de la est*fa / se de5a enfia en el desecado .o 8 min*tos / .aa l*e+o se .esado, % H
=
100 *
W 1
−
W 2
M 0
DondeH 2 X Masa del eci.iente m6s la m*esta $1meda en +amos 4 X Masa del eci.iente m6s la m*esta seca en +amos M8 X Masa de la m*esta en +amos b)
3H. Cali)a el ." > meto antes de .ocede a la e%al*aci#n0 coloca 7 ml de m*esta a se e%al*ada en *n %aso de .eci.itaci#n0 / coloca los electodos / .ocede a $ace la lect*a,
IV. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1.
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