HEMAGLUTINACION INDIRECTA PARA CHAGAS (HAI CHAGAS) La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria producida por el Trypanosoma cruzi . El diagnóstico de laboratorio depende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad. Durante la fase aguda, el diagnóstico se efectúa directamente mediante la comprobación de los parásitos en sangre o por métodos inmunológicos que detecten anticuerpos específicos. Durante la fase crónica, se pueden usar métodos inmunológicos como la reacción de aglutinación de látex, hemaglutinación, aglutinación directa, inmunofluorescencia y últimamente ELISA. FUNDAMENTO DEL METODO La hemaglutinación indirecta (HAI), también llamada hemaglutinación reversa pasiva, se basa en la propiedad que tienen t ienen los anticuerpos (que en este caso cas o son anti-T. cruzi) de producir aglutinación específica en presencia de glóbulos rojos sensibilizados con los correspondientes antígenos. En el suero existen anticuerpos inespecíficos (heterófilos) que son capaces de aglutinar glóbulos rojos de distintas especies. Su presencia se investiga enfrentando el suero con GR no sensibilizados. Los anticuerpos interferentes se eliminan mediante tratamiento con 2-mercaptoetanol. 2 -mercaptoetanol. La enfermedad presenta dos fases, una aguda y una crónica. En la fase aguda, que va del momento de la infección hasta unas 6 semanas después de esta, los pacientes pueden mostrar síntomas inespecíficos, como fiebre o dolores de cabeza. Durante la fase crónica, que puede durar hasta 30 años, aproximadamente el 30% de los pacientes desarrolla complicaciones de tipo cardíaco, que pueden manifestarse en forma de arritmias pr incipalmente. El 10% de los pacientes puede tener complicaciones intestinales, especialmente restreñimiento, neurológicas o mixtas.1 Sin embargo, la fase crónica se caracteriza por la ausencia de síntomas en la gran mayoría de los pacientes. Esto último, sumado al hecho de que los pacientes pueden encontrarse en un lugar no endémico donde la enfermedad es desconocida, representa una dificultad añadida al diagnóstico de la infección. Para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas existen diversos métodos. Algunos de estos se utilizan utilizan mayoritariamente para propósitos de investigación, investigación, mientras que otros se emplean en los laboratorios de diagnóstico habitual. Actualmente, para el diagnóstico de los pacientes, la Organización Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda la realización de dos pruebas basadas en diferentes principios y antígenos, y una tercera en caso de discordancia. En general, los métodos se clasifican en directos o indirectos. Los métodos directos detectan el parásito en la sangre del paciente, suelen denominarse métodos parasitológicos, y la mayoría están basados en la mi croscopía. Así mismo, existen otras técnicas dentro de esta categoría, como el cultivo y el
xenodiagnosis (este último basado en la aplicación de los insectos vivos directamente en la piel de los pacientes), cuya utilización está muy limitada por el alto riesgo de infección del personal sanitario, la incomodidad de los pacientes o su poca practicidad. Los métodos indirectos detectan el ADN del parásito (métodos moleculares, especialmente la reacción en cadena de la polimerasa [PCR]) o los anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en la sangre del paciente (métodos serológicos). El diagnóstico mediante microscopía se basa en la visualización del parásito en la sangre de los pacientes utilizando un microscopio. Existen diferentes variantes, que incluyen métodos de concentración (Strout) y microhematocrito para el diagnóstico en recién nacidos con la recolección de sangre en capilares. La técnica de la PCR es un método de diagnóstico molecular que detecta el ADN del parásito que se encuentra en la sangre de los pacientes. Esta estrategia presenta muchas variantes, cada una de ellas con diferentes grados de sensibilidad y especificidad. 2 En general, es una técnica más sensible que la microscopía, ya que puede detectar pequeñas cantidades de ADN de T. cruzi en la sangre. Sin embargo, su implementación requiere de un laboratorio especializado y actualmente no se ha hecho ninguna validación de esta técnica para su utilización estandarizada en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Las técnicas serológicas incluyen diversos métodos, entre los cuales se incluyen ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), IFI (imnufluorescencia indirecta) y HAI (hemaglutinación indirecta). Todos ellos se basan en la detección de las inmunoglobulinas G (IgG) anti-T. cruzi en la sangre de los pacientes y su reacción colorimétrica visible en el caso de que la sangre de los pacientes contenga los anticuerpos. En la técnica ELISA los antígenos de T. cruzi se adhieren a una placa de plástico con diversos pocillos que se incuban con la sangre de los pacientes, y la coloración de los casos positivos se da mediante una reacción enzimática. La lectura de los resultados se obtiene mediante un equipo especializado que mide la densidad óptica (figura 1).
En el método IFI, basado también en la reacción antígeno-anticuerpo, la coloración se da a través de una sustancia fluorescente y para la lectura de los resultados se requiere de un microscopio de luz ultravioleta (figura 2). En la HAI, se sensibilizan glóbulos rojos con antígeno del parásito, y si las muestras de los pacientes son positivas, estos glóbulos rojos se aglutinan, por lo que los resultados se pueden observar a simple vista.
En contraste con los tres métodos anteriores, que requieren de un mínimo equipamiento y/o personal entrenado, entre los métodos serológicos también se incluyen los test denominados «rápidos». Estos pueden presentar varios formatos, incluyendo el denominado «casete» (figura 3) o en forma de tiras diagnósticas, y que son capaces de proporcionar resultados en menos de 1 hora. Estas pruebas funcionan con una cantidad mínima de sangre (sangre total, plasma o suero) y tienen la ventaja de que no requieren personal entrenado, equipamiento externo (que a su vez precisa electricidad o agua) o refrigeración (figura 4).
OBJETIVOS -
Identificar la presencia de chagas mediante el estudio serológico de hemaglutinación indirecta Conocer y utilizar el método de hemaglutinación indirecta – HAI CHAGAS
REACTIVOS (Se empleara el kit HAI Chagas Polychaco)
Antígeno HAI (1): Suspension estabilizada de hematíes de carnero sensibilizados con antígenos citoplasmáticos de Trypanosoma cruzi Diluyente de muestras (2): Solución isotónica tamponada con fosfatos a Ph 7.5.Agregar 0,5 ml de solución Proteica para 10 ml de Buffer HAI. Mezclar , rotular y fechar (preparado dura 5 dias a 2-10ºC SOLUCION PROTEICA (3): Solucion proteica de albumina bovina al 10 %, estabilizada. Hematies No sensibilizados (4): Suspension al 1% de eritrocitos de carnero no sensibilizados , para control de heterofilia Control positivo (5): Suero inactivado conteniendo anticuerpos contra tripanosoma cruzi. Control positivo (6): Suero no reactivo, inactivado
MUESTRA Recoleccion: El paciente debe estar preferentemente en ayunas. Obtener suero de la manera usual. No usar plasma. Sustancias interferentes conocidas: hemolisis o hiperlipemia producen resultados erróneos. MATERIAL REQUERIDO
Policubetas con pocillos en U ( para eliminar la carga electrostática es pasar un trapo húmedo por la base d ela misma ) Micropipetas automáticas (25 ul) Tubos de ensayo y material volumétrico adecuado Cinta adhesiva
PROCEDIMIENTO -
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Colocar 25 ul de Diluyente de sueros HAI en todos los pocillos a usar de la policubeta Tomar una alícuota de 25 ul de la muestra “suero” y colocar en el primer pocillo y rotarlo por lo menos 10 veces para asegurar una correcta dilución de la muestra. Con una pipeta automática de 25 ul, homogeneizar por cargas y descarga. Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilución ½), pasando los microdilutores al pocillo siguiente (dilución ¼ ) y asi sucesivamente hasta la dilución que se desea investigar (por ej. 1/8, 1/16, 1/32)
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Transferir 25 ul de pocillo a pocillo hasta la dislucion que se desea investigar Descartar los últimos 25 ul Colocar en los pocillos conteniendo las diluciones 1/ 2 y 1/4 , la cantidad de 25 ul de globulos rojos no sensibilizados para control de heterofilia En el resto de los pocillos, agregar 25 ul de Antigeno HAI Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta Dejar en reposo, a resguardo de vibraciones durante 90 min. Leer a partir de los 90 min, se puede aumentar la nitidez de la apreciación leyendo sobre un espejo , iluminando la placa desde arriba e interpretando un papel blanco
Interpretación de los resultados No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón o pequeño anillo de bordes regulares. Reactivo: formación de una película o manto que cubre el 50% o más del fondo de los pocillos, hasta el último posillo, informándose con el título en dilución (ejemplo Positivo dil.1:64) LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Vibraciones accidentales durante el reposo necesario para el desarrollo de la reacción. - Sueros envejecidos o congelados y descongelados repetidamente. - Contaminaciones accidentales de los reactivos o del material empleado en el ensayo. - Exceso o defecto de Diluyente de Sueros HAI en los pocillos de la policubeta. - Diluyente de Sueros HAI que tenga más de 5 días de preparación. - En poblaciones endémicas, empleando el método de HAI, el 98% de los títulos menores a 1/8 y el 95% de los títulos mayores o iguales a 1/8 fueron confirmados por los métodos tomados como referencia. - En poblaciones no endémicas, el 100% de los individuos sanos presentó títulos menores a 1/8 determinados por HAI. - En el 100% de los individuos con serología positiva confirmada por los métodos tomados como referencia y con parasitosis demostrada por xenodiagnóstico y/o hemocultivo, se observaron títulos mayores o iguales a 1/32 determinados con Chagatest HAI. - Policubetas rayadas por uso reiterado. No se aconseja reutilizar pocillos. - Falta de homogeneización de los reactivos antes de su uso. Conclusiones Muchos de los pacientes de la enfermedad de Chagas en países endémicos se encuentran en zonas de acceso geográfico reducido y sin servicios básicos como electricidad o agua. Por esta razón, es necesario el diagnóstico mediante los test de diagnóstico rápido, que no requieren equipamiento especializado ni personal entrenado.
RESULTADOS
Bibliografía -http://amf-semfyc.com/web/article_ver.php?id=1409 -http://cate-serolog.blogspot.com/2008/07/chagas.html Abbas A., Lichtman A., Pober J.: Inmunología Celular y Molecular 5ª edición. Ed. McGraw Hill – Interamericana. España 2004. Signatura Topográfica 616.079 Ab19 c.4 - Rojas W.: Inmunología 13ª edición. Investigaciones biológicas. Colombia 2004. Signatura Topográfica 616.079 R63 - Requeiro J., Lopez: Inmunología, Biología y Patología del Sistema Inmune Editorial Panamericana. 1996 - Russel T.: Inmunología 2ª edición. 1999
CUESTIONARIO 1. Mencione las características clínicas que presenta una persona que padece Chagas R.2. Mencione otras pruebas de laboratorio que sean capaces de identificar la enfermedad de Chagas R.3. Esquematice el tipo de reacción que sucede en caso de positividad y negatividad en la prueba de HAI-Chagas
R.4¿Cuáles son las ventajas y desventajas del test de HAI-Chagas? R.5. Describa las características principales del agente de la enfermedad de Chagas R.6.¿ Que significado tiene el informe de laboratorio Positivo dilución 1:32 y Positivo dilución 1:1024?
R.7.Describa las complicaciones que padecen las personas enfermas de Chagas R.-
