QUÍMICA ANALÍTICA II
GUÍA DE ESTUDIO
CROMATOGRAFÍA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA FAC. DE CIENCIAS BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
- 2017 -
1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA 1) Realice una clasificación general de los diferentes mecanismos de separación cromatográficos, indique la naturaleza del las fases y el tipo de interacción que tiene lugar en cada caso. Dé algunos ejemplos de los métodos comprendidos
1.1 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS 1) a- Dibuje un diagrama de bloques e identifique los componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento. b- Explique la diferencia en realizar una cromatografía líquida en modo isocrático y en gradiente de elución. Indique las ventajas y desventajas de cada modo de trabajo. 2) Indicar si las siguientes aseveraciones son verdaderas (V) o falsas (F). a- En una cromatografía líquida de adsorción la fase móvil es relativamente no polar. b- Las moléculas de baja polaridad se separan fácilmente en una cromatografía de reparto de fase normal. c- El tiempo de retención de los solutos en cromatografía de exclusión puede modificarse cambiando la polaridad de la fase móvil. d- En cromatografía de fase reversa la fase móvil es más polar que la fase estacionaria. e- La posición de las bandas de los compuestos en un cromatograma es función de sus constantes termodinámicas f- La modificación de parámetros cinéticos impacta en el ancho de las bandas del cromatograma y no en su posición. 3) Discutir el impacto de las siguientes situaciones en el desarrollo del análisis cromatográfico : a) El analista utiliza una fase móvil a la que no desgasificó suficientemente por lo tanto sigue teniendo burbujas. Justifique su respuesta, incluyendo los distintos modos de desgasificación. b) El analista inyecta una muestra de suero (matriz compleja) y no utiliza una columna guarda. c) El analista realiza una cromatografía usando como fase móvil metanol:buffer acetato de sodio/ácido acético pH=5. Cuando finaliza el trabajo, lava la columna durante una hora directamente con metanol. ¿Qué problema puede acarrear este procedimiento? Discuta las condiciones óptimas de lavado y guardado de una columna. 4) Si el tiempo de retención de un componente A es mucho mayor que el de un componente B, qué conclusión obtiene acerca de la naturaleza de los analitos en: a- Una cromatografía de permeación en gel? b- Una cromatografía de fase reversa. Justifique 5) Una mezcla de cafeína y fosfato de piridoxal (vitamina B6) se separa en una columna C18 con una fase móvil metanol:agua 30:70 (v/v). En estas condiciones indicar: a- El orden de elución, sabiendo que el fosfato de piridoxal es más polar que la cafeína (ver estructuras químicas). b- Si el tiempo de retención del analito más retenido fuera muy alto (factor de capacidad mucho mayor a 5), cómo procedería para disminuirlo si dispone solamente de esa columna?
1
c- Discuta los ítems a y b si se hubiera resuelto la mezcla con una cromatografía de fase normal d- ¿Qué término de Van Deemter incide más en el valor H en una cromatografía líquida de alto rendimiento con fase estacionaria líquida?
Cafeína
Fosfato de piridoxal
6) Una mezcla conocida de los compuestos C y D produce los siguientes resultados en HPLC: Compuesto
Concentración (mg mL-1 ) en la mezcla
Área del pico (cm 2 )
C
1.03
10.86
D
1.16
4.37
Se prepara una solución mezclando 12.49 mg de D más 10,00 mL de una solución que sólo contiene 2 C y se diluye a 25,00 mL. La áreas de los picos son de 5.97 y 6.38 cm para C y D respectivamente. Hallar la concentración de C (mg mL-1) en el problema.
7) Para cuáles de los siguientes casos aplicar HPLC será una buena opción de análisis: 1) Estudio de la composición del humo del cigarrillo 2) Determinación de ácido ascórbico (vitamina C) en tabletas 3) Determinación de cafeína en bebidas 4) Determinación de azúcares 8) En un análisis por HPLC con detección UV, en columna de 15 cm, se analizan múltiples contaminantes. Dos de ellos (carbaril y 1-naftol) registran tiempos de retención de 3,4 y 3,8 minutos, con ancho de base de 0,4 minutos en ambas bandas. El pico de un compuesto no retenido ocurre a 1 minuto de la inyección. Calcular: - los factores de retención (k’), indicando qué miden y justificar si en este caso sus valores son adecuados. - el factor de separación (α) indicando qué mide este parámetro. - el número promedio de platos teóricos. - la altura promedio del plato (en mm). - la resolución entre ambos picos, justificando si la separación es o no completa . 9) Los siguientes datos corresponden a una cromatografía L-L de fase ligada (250 mm de empaque) Compuesto Tiempo de retención (min) Ancho de base (min) compuesto no retenido 0.5 sacarina 3.8 0.2 cafeína 5.9 0.7
2
Calcular el número promedio de platos teóricos (N), la altura promedio del plato (H) y la resolución para dichos compuestos indicando si se separan.
10) Se desea corroborar el contenido del antiinflamatorio piroxicam en un comprimido (valor nominal: 10 mg por comprimido). Para ello, se pesan 12.9 mg del comprimido (peso promedio del comprimido 632 mg), se agrega HCl metanólico, se filtra y se enrasa con HCl metanólico en matraz de 5.00 mL. Se inyectan 25 L de esta solución en el cromatógrafo (HPLC con detector fluorescente) y se obtiene una señal cuya altura equivale a 3.08 unidades de fluorescencia. Se prepara también un testigo disolviendo 6.8 mg de patrón en 25.00 mL de HCl metanólico. Se toman 10.00 mL de esta solución y se diluyen a 50.00 mL con HCl metanólico. Se inyectan en el cromatógrafo 25 L de este testigo produciendo una señal de 4.10 unidades de fluorescencia. Calcular el contenido de antiinflamatorio en el comprimido 11) a- Realice una clasificación de tipos de resinas de intercambio iónico, indicando grupo iónico fijo y contra ión (ión intercambiado). b- Indicar los efectos de aumentar el entrecruzamiento en las columnas de intercambio iónico.
1.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES 1) a- Dibuje un diagrama de bloques e identifique los componentes fundamentales de un cromatógrafo de gases. b- ¿En qué casos es conveniente derivatizar un analito antes de realizar un análisis por CG? c- Justifique en qué casos es conveniente trabajar en condiciones isotérmicas y qué significa hacerlo en gradiente de temperaturas. Compare ambos procedimientos, indicando cuándo se eligen y qué ventajas y desventajas poseen. d- Describir los distintos tipos de columnas utilizadas en cromatografía de gases, indicando en cada caso la disposición de la fase estacionaria dentro de la columna. e- Comparar las propiedades de una columna tubular abierta con las de una columna empaquetada . f - ¿Qué ventajas tiene una fase estacionaria ligada en CG? g-¿Porqué el detector de conductividad térmica responde a todos los analitos excepto al gas portador? 2) Los siguientes datos fueron obtenidos por medio de un cromatograma gas líquido, en una columna de 1.50 m., cuya fase estacionaria es de escualeno (no polar). Compuesto no retenido benceno (PE 80 °C) hexano (PE 68 °C)
t r (min) 3 10 11
w (min) –
1.1 1.4
Calcular: a- El tiempo de retención corregido (tr ') para cada compuesto. b- El número promedio de platos (N prom.). c- La resolución (R) entre ambos picos y decir si se logra la separación.
3
d- En base a los datos obtenidos grafique un cromatograma, respetando las escalas. Considere que el hexano es el compuesto que está en mayor concentración. e- ¿Cómo se puede mejorar la resolución entre dos picos próximos en CG? 3) Los siguientes tiempos de retención y ancho de picos fueron observados en una columna gaslíquido de 1,50 m, rellena con FE muy polar, de composición química del tipo del etilen glicol. Compuesto no retenido hexano (PE 68 °C) 1-metiletil metanoato (PE 68 °C)
t r (min) 0.40 4.60 5.00
w (min) 0.35 0.37
Calcular: a- El factor de capacidad (k') para cada sustrato. b- El factor de selectividad ( α). c- La altura equivalente del plato teórico (AEPT o H).
4) Para determinar la op de una CGL, se procede a inyectar alícuotas iguales de una misma muestra, a distintas velocidades de flujo cada vez y se registra en cada caso el tiempo de retención (t r ) y los anchos de pico (w). Los datos obtenidos son los siguientes: Alícuota 1 2 3 4 5 6 7
t r (min) 5.53 8.58 11.33 11.64 11.92 12.16 6.9
w (min) 0.70 0.85 0.80 0.85 0.90 1.00 0.70
(cm/seg) 5 10 20 30 40 50 70
a- Con esta información dibuje la curva de Van Deemter, indicando en la gráfica la op y la Hmin. La longitud de la columna es de 90 cm. b- ¿Qué proceso dispersivo está incluido en cada término de la ecuación de Van Deemter? c- ¿Por qué la difusión longitudinal (término B) es un problema más serio en CG que en CL? d- ¿El término A de Van Deemter se presenta en una columna capilar abierta? Justifique. 5) Se desea determinar la concentración de etanol en sangre mediante un método cromatográfico utilizando patrón interno. Para ello se procesan, de la misma manera, una serie de soluciones acuosas patrón de etanol y una muestra de suero: una alícuota de 0.01 mL de cada solución se diluyen con 0.1 mL de una solución patrón de 2-propanol 0.1mg/mL. Se inyectan 0.1 l de cada solución en un CG provisto de un detector FID (ionización de llama), un integrador y una columna PEG-400 (polietilenglicol) a 80 °C. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Patrones de etanol (mg/mL) 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 Muestra de sangre
Medida del integrador Pico del etanol Pico del propanol 5518 12754 7563 11893 10350 12084 13935 12870 15628 12314 9862 12604
4
a- Construir el gráfico de calibración correspondiente y a partir de este gráfico determinar la concentración de etanol en la muestra de sangre. b- ¿Qué ventajas tiene emplear las áreas integradas de los picos en vez de sus alturas para realizar la cuantificación?
RESPUESTAS 1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA 1) MECANISMO DE SAPARACIÓN
NATURALEZA DE LA FASE F. MÓVIL
INTERACCIÓN
F. ESTACIONARIA
Partición Adsorción
Líquida o gaseosa Líquida convencional y fase ligada Solubilidad Líquida o gaseosa Sólida Fuerzas de Van der Waals y enlaces hidrógeno Intercambio iónico Líquida Resina Fuerzas electrostáticas Exclusión molecular Líquida Gel poroso Tamizado Afinidad Líquida Sólido Reacción especifica Ejemplos de métodos: Partición. Planar (papel, HPTLC) – Columna (LLC clásica, HPLC, GLC) Adsorción. Planar (TLC, HPTLC) – Columna (LSC clásica, HPLC, GSC) Intercambio iónico. Columna (IEC) Exclusión molecular. Columna (SEC) Afinidad. Columna (AC)
1.1 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS 1) a) Buscar información en la bibliografía sugerida y clases de teoría b) En la cromatografía líquida en modo isocrático la composición de la fase móvil se mantiene constante durante todo el desarrollo cromatográfico. En el modo gradiente de elución la composición de la fase móvil se modifica en forma continua o escalonada con el fin de optimizar las separaciones. Se selecciona el modo isocrático si los tiempos de retención son tales que garantizan valores adecuados de k ’ y α. Este modo es más sencillo de implementar porque requiere equipamiento más simple (bomba isocrática) y, en general, es menos contaminante porque limita el uso de solventes orgánicos. Como desventaja, no es útil en sistemas que incluyen compuestos con polaridades muy disímiles (algunos compuestos saldrían cercanos a la inyección y otros saldrían a tiempos experimentales impracticables). Trabajar con gradiente de elución tiene la ventaja de resolver exitosamente y en tiempos apropiados sistemas constituidos por analitos de distinta polaridad, pero posee la desventaja de requerir un instrumental más sofisticado (necesita al menos
5
una bomba binaria). Por otro lado, al poder combinar distintos solventes orgánicos y/o aumentar su proporción durante el desarrollo cromatográfico aumenta, en general, la generación de desechos tóxicos, considerándose menos "verde".
2) a- Verdadero. La fase móvil debe ser relativamente no polar. b- Falso. Las moléculas de baja polaridad se separan mejor por cromatografía de fase reversa. Al elegir una columna para una separación cromatográfica de reparto, la polaridad de la fase estacionaria debe ser similar a la de los analitos, y para la elución se utiliza una fase móvil con una polaridad considerablemente distinta (pero que disuelva los analitos). c- Falso. En cromatografía de exclusión, un cambio en la polaridad de la fase móvil no tiene efecto significativo sobre los tiempos de retención ya que la retención está determinada por el tamaño y la forma de la molécula en relación con el tamaño y forma de los poros de la fase estacionaria. En este caso la fase móvil es no-interactiva. d- Verdadero. e- Verdadero f- Verdadero 3) a) Las burbujas pueden obstruir el sistema aumentando la presión. Además, al llegar al detector pueden dar alteraciones en la línea de base y a veces altos registros de absorbancia cuando se utiliza un detector UV-visible. b) Distintos componentes del suero como las proteínas pueden obturar los tubos del sistema aumentando la presión y también dañar la columna . c) En presencia de metanol precipitarán los iones del buffer, formando sales que quedarán depositadas en la tubería. El analista debe lavar primero con agua calidad HPLC y luego con metanol hasta estabilizar la presión habitual de la columna para el flujo de trabajo . 4) a- En permeación en gel: A es de menor tamaño que B. b- En fase reversa: A es menos polar que B. 5) a- El fosfato de piridoxal es más polar que la cafeína y saldrá antes. b- Aumentando el poder de elución de la fase móvil, aumentando la proporción de metanol y disminuyendo la de agua. c y d . Para reflexionar y discutir en clase (ver teoría) 6) En cromatografía en columna, en general, ocurren fluctuaciones relativas al instrumental utilizado y al método; como consecuencia de esto, la respuesta del detector no es reproducible para la misma cantidad de un compuesto dado. Para subsanar el inconveniente se inyecta junto con el analito un patrón interno y se mide, empíricamente, el factor de respuesta ( F ); el procedimiento se basa en que ambas señales responderán proporcionalmente, independizándose de estas variaciones. Cálculo de F CC / CD = F AC / AD
6
F = CC . AD / CD . AC = 4.37 cm2 x 1.03 mg.mL-1 / 10.86 cm2 x 1.16 mg.mL-1 = 0.357
Cálculo de C en la solución problema Para conocer la concentración de D: 25.00 mL de solución --------- 12.49 mg de D 1.00 mL --------- x = 0.499 mg -1 2 2 -1 C = F CD AC / AD = 0.357 x 0.499 mg.mL x 5.97 cm / 6.38 cm = 0.167 mg.mL 1.00 m L -------- 0.167 mg 25.00 mL ------- x = 4.17 mg 10.00 mL -------- 4.17 mg 1.00 mL ---------- x = 0.417 mg
→
C =
0.417 mg mL-1
7) 1) La composición corresponde a una mezcla de hidrocarburos y sería un claro caso para GC que dará una rápida, fácil y económica separación respecto de HPLC. 2) La determinación puede hacerse por HPLC pero resulta más fácil determinar vitamina C por volumetría y por métodos electroquímicos. 3) La cafeína debe ser separada de colorantes, aditivos y otros componentes presentes en las bebidas y HPLC es la técnica adecuada de elección. 4) Los azúcares pueden ser determinados por GC o HPLC; pero la última es la técnica de elección ya que los azúcares no son volátiles y deben ser derivatizados con trimetilsilano si se elige CG haciendo más complicada la determinación. 8) k ’ carbaril = 2.4 k ’ naftol = 2.8 α=1.16 N carbari= 1156 N naftol= 1444 N prom= 1300 H prom = 0.11 mm Rs = 1 9) N prom= 3456
H prom = 0.007 cm R = 4.6
10) 10.0 mg de piroxicam por comprimido 11) aTipo de resina Grupo iónico fijo catiónica fuerte catiónica débil aniónica fuerte aniónica débil
sulfonato ( SO3-) carboxilato( COO-) amonio cuaternario ( N(CH3)3+) amonio secundario ( NH.CH3)
Contraión catión catión anión anión
b- Remitirse a la bibliografía sugerida y clases de teoría.
7
1.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES 1) a- Consultar la bibliografía sugerida y clases de teoría. b- En cromatografía de gases es necesario derivatizar algunos compuestos, principalmente los que tienen grupos funcionales polares. Es decir, transformarlos en un producto similar pero con propiedades adecuadas con el fin de mejorar su volatilidad, su estabilidad térmica y en algunos casos la sensibilidad en la detección. c- Trabajar en condiciones isotérmicas significa trabajar a una única temperatura durante todo el desarrollo cromatográfico, mientras que hacerlo en gradiente de temperatura implica un aumento de temperatura programado y generalmente en rampa durante la separación cromatográfica. Trabajar a a una única temperatura implica un proceso más simple y se elige cuando los analitos salen a tiempos de retención razonables y con una buena resolución. Trabajar en gradiente es más complejo pero puede ser la solución a cromatogramas que presentan bandas no resueltas en condiciones isotérmicas, o una gran amplitud en los tiempos de retención. Recordar que los tiempos de retención deben ser tales que aseguren razonables valores de las constantes termodinámicas factor de capacidad y factor de selectividad. d- Ver bibliografía e- Las columnas tubulares abiertas se caracterizan por: mayor resolución, debido a que la longitud de la columna es mayor; menor tiempo de análisis, debido a que al contener menos fase estacionaria retienen menos a los solutos; mayor sensibilidad, por las características que le son propias. Tienen menor capacidad de muestra, es decir, se puede aplicar menos muestra que a una columna empacada f- Reduce la tendencia de la fase estacionaria a sangrar cuando la columna es expuesta a elevadas temperaturas. g- El detector de conductividad térmica “compara” la conductividad térmica del eluato con la del gas portador. 2) a- tr ' = tr - tm tr '(Benceno) = 10 min - 3 min = 7 min tr '(Hexano) = 11 min - 3 min = 8 min b- N = 16 (tr /w)2 N (Benceno)= 16 (10/1.1)2 = 1322 N (Hexano) = 16 (11/1.4)2 = 988 N prom = (1322 + 988) / 2 = 1155 c- R = 2 (tr(H) - tr(B)) / (W(B) + W(H)) R = 2 ( 11 min - 10 min ) / ( 1.1 min + 1.4 min) = 0.8 Para una separación completa R debe ser mayor o igual a 1.5. En este caso la separación no es completa. d-
8
tr
señal
tr A ()
Z
A
10
3
B
11
ti m e po
e- Para mejorar la resolución entre dos bandas cromatográficas se debe aumentar la separación entre bandas (Δtr ) y disminuir su ancho. La separación se puede lograr modificando las variables termodinámicas (K, k y α) modificando fase móvil, fase estacionaria y /o temperatura. Las bandas se afinan modificando las variables que permiten disminuir H y aumentar el N (ver ecuación de van Deemter modificada. Es decir, usar una columna de menor diámetro, una fase estacionaria con menor espesor- película de fase estacionaria más delgada, partículas de fase estacionaria muy pequeñas, etc.) 3) a- k' = (tr - tm) / tm k'hexano = (4.60 min. - 0.40 min.) / 0.40 min. = 10.5 k'm-e-metanoato = (5 min. - 0.40 min.) / 0.40 min. = 11.5 b- = k'(y) / k'(x) = k'(m-e-metanoato) / k'(hexano) = 11.5 / 10.5 = 1.09 c- Nhexano = 16 (4.60 min. / 0.355 min.) 2 = 2687 Nm-e-metanoato = 16 (5.00 min. / 0.372 min.) 2 = 2890 N prom = 2788 H = L / N prom H = 150 cm / 2788 = 0.054 cm 4) a- N = 16 ( tr / w )2
H = L/N
9
Alicuota 1 2 3 4 5 6 7
N 998 1630 3209 3000 2807 2366 1555
H 0.090 0.055 0.028 0.029 0.032 0.038 0.058
0,1
0,08
) 0,06 m c ( H0,04
H min 0,02
0 0
15
µop
30
45
60
75
cm/seg
b- A: difusión en remolino, B: difusión longitudinal, C: resistencia a la transferencia de masa transversal del analito en la fase móvil y entre las fases móvil y estacionaria. c- Porque los coeficientes de difusión de los analitos son más grandes en fase gaseosa que en líquida. d. No. Porque no tiene empaque y por lo tanto no existe factor de empaque y entonces no se considera A que está relacionado con este parámetro. 5) ay = 0.8316x + 0.028 1.4
2
R = 0.9986
H O1.2 p o r 1 P a 0.8 e r a / H0.6 O t 0.4 E a 0.2 e r a
0
0
0.5
1
1.5
2
[EtOH] ]
R = 0.91 mg/mL
b- Si varían ligeramente las condiciones de una columna, el t r de un compuesto y la altura del pico pueden modificarse. Pero el ancho y la altura varían simultáneamente y el área correspondiente se mantiene constante.
10
PREGUNTAS Y CUESTIONES ADICIONALES 1) Dibujar el cromatograma para una sustancia X y marcar los siguientes parámetros: – tiempo muerto – tiempo de retención del compuesto X – tiempo de retención corregido del compuesto X Definir cada uno de los parámetros anteriores e indicar qué representan 2) Indicar qué parámetros termodinámicos se relacionan con la posición de las bandas en un cromatograma, definir cada uno ellos y justificar cuáles son las variables que los modifican y que el analista puede cambiar para lograr mejores separaciones. 3) Definir los parámetros cromatográficos número (N) y altura (H) de platos teóricos. Indicar con qué característica del pico cromatográfico se relacionan y justificar a través de qué variables pueden ser modificados dichos parámetros para lograr mejores separaciones . 4) Dibujar, en un mismo gráfico, cada uno de los términos dispersivos de la ecuación de Van Deemter modificada y la curva resultante. Indicar la condición óptima de trabajo. 5) Explicar la relación entre la altura del plato (H) y la difusión en remolino (término A) de un compuesto en una cromatografía en columna. Indicar cómo se genera dicha difusión, su relación con la velocidad lineal de la fase móvil y en qué tipos de columnas cromatograficas está ausente. Justificar. 6) Explicar la relación entre la altura del plato (H) y la difusión longitudinal (término B) de un compuesto en una cromatografía en columna. Indicar cómo se genera dicha difusión, su relación con la velocidad lineal de la fase móvil y en qué tipo de cromatografía es más importante. Justificar. 7) Explicar en qué consiste efectuar una curva de calibración con patrón interno en método cromatográfico y las ventajas de este procedimiento. 8) Justificar: – qué tipo de especies se separan con HPLC y no con CG – qué tipo de especies se separan con exclusión molecular – qué tipo de especies se separan con intercambio iónico 9) En cromatografía líquida: definir los conceptos de fase normal y fase reversa. Ejemplos. 10) Describir el fundamento de separación en una cromatografía líquida de reparto, indicando la naturaleza de la fase estacionaria y las fuerzas de interacción involucradas entre el analito y las fases. Indique qué mide el parámetro índice de polaridad (P’).
11
11) En una cromatografía líquida de adsorción: definir la naturaleza de fase móvil y estacionaria (ejemplos de cada una de ellas). Describir el fundamento de la separación y fuerzas que intervienen. Indicar qué mide el parámetro de fuerza del solvente ( o). Justifique si la fase móvil es o no interactiva. 12) Describir las diferencias entre una cromatografía líquida convencional y una de fase ligada, y mencionar al menos 3 ventajas de la fase ligada respecto a la cromatografía convencional. 13) En una cromatografía líquida de intercambio iónico, defina la naturaleza de la fase móvil y de la fase estacionaria (ejemplos de cada una de ellas). Describa el fundamento de la separación y fuerzas que intervienen. Justifique si la fase móvil es o no interactiva. 14) Describir las características generales de las columnas cromatográficas usualmente empleadas en HPLC y los distintos tipos de rellenos.
12
CROMATOGRAFIA PLANAR La cromatografía plana tiene dos modalidades: capa delgada y papel. En la primera, la separación se produce sobre un sólido finamente dividido que se ha fijado sobre una superficie plana. La sustancia que más se utiliza como adsorbente es el gel de sílice que puede funcionar a veces como soporte para el agua u otros disolventes polares en las separaciones líquido – líquido. Pero si se seca en una estufa, la capa de gel de sílice pierde la humedad, su superficie resulta predominantemente sólida y sirve como adsorbente en las separaciones líquido – sólido. En el caso de cromatografía en papel se utilizan papeles de alta pureza y características reproducibles de porosidad y grosor. Estos papeles contienen suficiente agua retenida, de manera que la cromatografía de papel se puede clasificar como una cromatografía de tipo líquido – líquido. Es posible hacer que otros líquidos reemplacen al agua, proporcionando un tipo diferente de fase estacionaria y originando una cromatografía en papel de fase reversa en donde la fase móvil sea un solvente polar. También existen en el comercio papeles que tienen un adsorbente o una resina de intercambio iónico que permite realizar cromatografía en papel de adsorción o de intercambio iónico, respectivamente. La siguiente figura es el esquema de una placa de cromatografía en capa delgada donde se indican las distancias recorridas por uno de los sustratos (a) y por el solvente (b) a partir de la línea de siembra.
Frente del
b
a
Origen o línea de siembra
13
CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA La fase estacionaria está constituida por una capa de adsorbente finamente dividido extendido sobre una placa de vidrio o de plástico. El sustrato a analizar se siembra cerca del borde inferior de la placa, la cual se sumerge en una cámara que contiene el disolvente de desarrollo, que a la vez puede ser el revelador, y que constituye la fase móvil. El solvente asciende por capilaridad, arrastrando al sustrato. Antes de que el líquido llegue al borde superior se retira la placa y se marca la posición alcanzada por el frente de solvente. Se señala la posición de la mancha y se calcula el parámetro R f . R f = distancia recorrida por el sustrato/ distancia recorrida por el frente de solvente Mecanismo de separación propuesto En cromatografía de adsorción, la placa con la fase estacionaria adherida (sílica gel o alúmina) se coloca en estufa a 110 a 120ºC para eliminar el agua que pueda estar retenida en el sólido. Este paso se conoce como 'activación' y habilita la capa para una separación líquido - sólido. Cuando la placa se recubre con celulosa en polvo, la fase estacionaria está constituida por el agua retenida en las fibras de celulosa. La separación que tiene lugar es líquido - líquido, y el mecanismo corresponde a la cromatografía de partición. Consideraciones sobre la fase estacionaria Adsorbentes La adsorción es el proceso por el cual un sólido atrae y retiene moléculas en su superficie. El mecanismo involucrado es físico; no existen reacciones químicas. La actividad del adsorbente se determina por su área superficial, naturaleza química y el arreglo geométrico de los átomos de su superficie. Depende de la producción de sitios activos. En función de estos sitios, los adsorbentes se clasifican en débiles, medianos y fuertes. El material adsorbente debe ser insoluble en el solvente cromatográfico. Por ejemplo, si se quiere analizar una solución acuosa de K + y Na+ por TLC, no debe usarse sacarosa como adsorbente, porque se disolvería en el disolvente. El adsorbente no debe reaccionar con el disolvente y menos aún con los solutos a separar. Si las fuerzas físicas de unión entre el soluto y el adsorbente son muy importantes, el soluto no se desplazará del punto de siembra, y por el contrario, si son muy débiles, correrá junto al frente de disolvente. Los adsorbentes más utilizados son : SILICAGEL: Su actividad se debe a los grupos silanol (Si-OH) OH O
Si
O
O ALÚMINA: Su actividad depende de los átomos de O 2 y de Al. O O O O Al
O
Al
O
14
CELULOSA: Se usa sólo cuando los compuestos a separar se unen muy fuertemente a la alúmina o al silicagel (compuestos muy hidrofílicos).
Fase móvil La función de la fase móvil es desplazar al soluto de la fase estacionaria, de manera de correrlo a través de la placa. Ayuda a separar una mezcla de solutos de modo que cada uno quede detenido en distintos puntos de la placa. La efectividad de un solvente de desplazar al soluto del adsorbente se denomina “poder de elución”. Está asociado con la función llamada parámetro de fuerza del disolvente o coeficiente
eluotrópico que es la energía de adsorción por unidad de área de un adsorbente patrón. Así, un mayor coeficiente eluotrópico, , implica una interacción más fuerte del disolvente con la superficie del adsorbente y las moléculas de soluto son desplazadas hacia mayores R f . La fuerza de los solventes da lugar a una serie eluotrópica. Cuando se cambia el adsorbente, el coeficiente eluotrópico del solvente cambia también. El coeficiente eluotrópico se define en términos de atracción solvente/ adsorbente. Existe un equilibrio entre solvente, soluto (muestra) y adsorbente, en donde el solvente compite con el soluto por los sitios activos de la fase estacionaria. Pero no solamente debe tenerse en cuenta la relación entre el tipo de adsorbente usado y el disolvente o mezclas de disolventes que determinan el coeficiente eluotrópico, sino también la relación entre la naturaleza química del soluto o muestra y la del disolvente. Todo ello contribuye a la determinación del R f y a la calidad de la resolución en la separación de los componentes de la muestra. Puede ocurrir que dos disolventes diferentes tengan, para el adsorbente dado, el mismo coeficiente eluotrópico, pero los valores de R f y la resolución serán mejores en un caso que en otro, considerando la naturaleza química de los constituyentes de la muestra y su relación con el disolvente. Se elige en este caso el disolvente que de mejores Rf y resolucion es. Muestra La interacción de la muestra y el absorbente se puede establecer de diferentes modos: mediante fuerzas de Van der Waals para moléculas neutras; unión dipolo para solutos que tiene un grupo polar C-Cl o C-NO2, siendo esta interacción más importante en la alúmina; puente hidrógeno entre el soluto y la sílice en la que los grupos silanos actúan como dador o aceptor de protones; o por una unión química más que física, de tipo covalente. Se denomina quimiosorción. Se presenta para algunos ácidos carboxílicos y cetonas. Cantidad de muestra Conviene siempre sembrar poca cantidad de muestra. Cuando se usa mucha cantidad de muestra surge un efecto denominado 'en cola'. Es preferible secar entre aplicación y aplicación para eliminar el exceso de solvente, de lo contrario aparecen anillos de muestra. Resolución Rs = X / 0.5 (d1 + d2) donde X es la distancia entre dos manchas, y d1 y d2 sus diámetros promedios .
15
Se considera una buena separación cuando Rs es igual a 1. La resolución se puede modificar aumentando X, respetando el pero cambiando la naturaleza del o de los solventes, o disminuyendo d colocando menos cantidad de muestra.
Visualización Métodos no destructivos: - Radiación visible. - Radiación ultravioleta (en algunos casos puede ser destructiva, por ejemplo ciertas vitaminas sufren variación fotoquímica). - Vapor de iodo (en algunos casos puede ser destructivo porque reacciona químicamente con la muestra). - Agua (salvo para ciertos ésteres que son hidrolizados). Métodos destructivos: El revelador reacciona con la muestra para dar productos coloreados (aminoácidos con ninhidrina), H 2SO4.
16
