UNIVERSIDAD ANDRES BELLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR BIO-131
GUÍA Nº 6: MITOSIS, MEIOSIS Y FECUNDACIÓN
INTRODUCCIÓN Tal como enuncia la Teoría Celular “todos los organismos están compuestos de células, y todas las células provienen de una célula preexistente”. La capacidad de reproducirse es una propiedad fundamental de la célula, la cual está finamente regulada, de modo que la información genética se conserve y se mantenga un equilibrio y una continuidad genealógica entre las células preexistentes y las células nuevas. Objetivo General del laboratorio: Reconocer las diferentes etapas de la división celular, señalando las características más relevantes de cada fase; reconocer los procesos de gametogénesis, identificando los diferentes tipos celulares involucrados e identificar óvulos recién fecundados, a través de la observación de la reacción cortical del óvulo.
CICLO CELULAR Así como los seres superiores cumplen con un ciclo de vida en el que nacen, crecen, se reproducen y mueren, las células en crecimiento pasan por el llamado Ciclo Celular. Éste comprende dos etapas fundamentales, la interfase y la división propiamente tal, que ocurre por los procesos de mitosis o meiosis (Fig. 1). La interfase es el período más largo del ciclo celular y corresponde al tiempo que toma una célula entre una división mitótica y la siguiente, o sea que puede entenderse como un período en el cual la célula se prepara para dividirse. Durante este tiempo, la célula aumenta lentamente su tamaño y duplica su material genético en una secuencia ordenada de eventos que pueden subdividirse en tres etapas principales, G1, S y G2. Después de una división celular, las células hijas resultantes comienzan la interfase de un nuevo ciclo celular en la etapa G1. Durante esta etapa la célula retoma su actividad biosintética que durante la mitosis es muy baja, llevándola nuevamente a sus niveles normales. Luego pasa a la fase S. Esta es una etapa de síntesis, en la cual la célula sintetiza ADN y termina cuando el contenido de ADN se ha duplicado y los cromosomas se han replicado. La etapa siguiente es G2, en ella la célula se prepara para su división mediante un período de rápido crecimiento y un punto de control que determina si el ADN necesita ser reparado por daños desde la última división, por lo que la división no continúa mientras no se complete la reparación del ADN; si el daño en el ADN es muy extenso, la célula entra en un proceso de “apoptosis” o muerte celular programada.
Después de esta serie de etapas la célula se encuentra lista para una nueva división, entrando en la fase M (mitosis).
FIGURA 1: Ciclo celular completo.
MITOSIS Durante la mitosis una célula se divide y da origen a dos células hijas genéticamente iguales entre sí. Lo que ocurre con el material genético es una separación equitativa de dos conjuntos cromosómicos iguales entre sí y al de la célula original. Esto es posible gracias a que en la fase S de la interfase el material genético y las proteínas que constituyen la cromatina han sido duplicados. La mitosis completa de una célula demora aproximadamente una hora, durante la cual ocurren muchos eventos diferentes, los que se han agrupado en 4 etapas (Fig. 3): 1. Profase: Dentro del núcleo la cromatina se condensa para formar los cromosomas. Al principio estos se ven como filamentos largos y finos, pero al término de la profase son más cortos y gruesos, ubicándose cerca de la envoltura nuclear. Los centríolos se han duplicado y se encuentran en polos opuestos de la célula. Finalmente, la envoltura nuclear se rompe y la profase termina. 2. Metafase: Los cromosomas condensados al máximo se ubican en el centro o ecuador de la célula gracias a la ayuda del huso mitótico, que es un complejo conjunto de microtúbulos que se orientan de polo a polo de la célula cerca de los centríolos. Los microtúbulos se unen a los cromosomas al insertarse en el cinetocoro de cada centrómero. Durante la metafase cada cromosoma está compuesto por dos cromátidas, cada una de las cuales posee un cinetocoro (Fig. 2).
FIGURA 2: Esquema de un cromosoma metafásico. 3. Anafase: La característica principal de esta etapa es el movimiento de los cromosomas hacia los polos de la célula. Esto ocurre gracias al acortamiento de los microtúbulos del huso mitótico. 4. Telofase: Sobre los cromosomas que están en los polos de la célula se forma la envoltura nuclear. Los cromosomas se condensan y el núcleo aumenta de tamaño por hidratación y descondensación de la cromatina. El núcleo resultante es esférico y en él se puede observar el nucléolo. Citodiéresis: En células animales esta etapa ocurre por un estrangulamiento del sector del citoplasma que se encuentra entre los dos núcleos nuevos gracias a una gran concentración local de microfilamentos, lo que implica un gasto de energía. En células vegetales existe la pared celular, y esta etapa ocurre por la formación de un tabique entre los dos núcleos nuevos. El tabique se forma por vesículas del sistema de Golgi, y finalmente se forman las dos membranas plasmáticas a cada lado del tabique, quedando completa la división celular.
FIGURA 3: Esquema general de la mitosis. MEIOSIS En todos los ciclos de reproducción sexual la nueva generación de individuos se origina por la fusión de dos células haploides que provienen de los organismos progenitores. Estas células son los gametos, y se obtienen mediante el proceso de Citodiéresis que ocurre en todos los organismos con reproducción sexual. La meiosis implica la producción de células haploides, las que se mantienen como tales hasta el momento de la fecundación, en el que los gametos se fusionan y el nuevo organismo obtiene un estado diploide. La meiosis ocurre sólo en las células germinales de las gónadas y da como resultado gametos, ya sean óvulos o espermios, según el sexo del organismo. La meiosis implica una etapa de duplicación del ADN, y dos divisiones celulares sucesivas para formar así cuatro células haploides que contienen la mitad del material genético original a partir de cada célula que entra en este proceso. Los eventos más destacados de la meiosis son: duplicación del ADN nuclear, apareamiento de los cromosomas homólogos, dos divisiones celulares sucesivas y, finalmente, la formación de células hijas haploides. Durante este proceso hay una activa transcripción y síntesis de proteínas celulares, produciéndose una gran variabilidad genética que se obtiene gracias a los fenómenos de “crossing-over” y permutación de los cromosomas, lo que asegura una muy baja posibilidad de obtener gametos genéticamente iguales. Lo anterior es una ventaja al momento de adaptarse a un medio dinámico en constante cambio y otorga la individualidad de los organismos. Un núcleo diploide contiene dos juegos de cromosomas muy similares entre sí, cada una de las cuales proviene de uno de los padres. Estas dos versiones de cada cromosoma son los llamados cromosomas homólogos. Cuando los cromosomas se duplican por replicación de ADN, las copias del cromosoma replicado en un principio permanecen fuertemente asociadas y se llaman cromátidas hermanas. En una división meiótica (Fig. 6) en que las células que se forman son haploides, cada célula hija debe contener sólo un miembro de cada cromosoma homólogo, el de origen materno o el de origen paterno, obteniéndose así sólo la mitad del número original de cromosomas. Después de la replicación del ADN, cada par de cromosomas duplicados se empareja con su homólogo y forman una estructura llamada “bivalente” que posee cuatro cromátidas. Cuando la primera división celular ocurre, cada célula hija contiene dos copias de uno de los cromosomas homólogos. En la segunda división celular los cromosomas no se duplican; sólo se ubican en el centro de la célula en el huso mitótico y las cromátidas hermanas se dividen como en una mitosis normal.
La meiosis se divide en varias etapas, éstas se nombran de la misma forma que las etapas de la mitosis, pero se les agrega un número I o II según se trate de la primera o segunda división celular, así, la meiosis se divide en: I.
Profase I: Esta es la primera etapa de la meiosis y también es la de mayor duración. En ella ocurre el proceso de “crossing-over” en el que los cromosomas homólogos intercambian parte de su ADN por un proceso denominado recombinación genética. Esto cambia el contenido del ADN de los gametos respecto al del organismo progenitor y ocurre cuando los cromosomas homólogos se encuentran muy juntos. Los lugares en los que ocurre recombinación se llaman quiasmas.
La profase está dividida en 5 etapas. En el Leptoteno cada cromosoma se condensa, permaneciendo unido por sus extremos a la envoltura nuclear. Los cromosomas ya se han replicado y consisten en dos cromátidas hermanas que se encuentran muy juntas. En el Cigoteno los cromosomas homólogos comienzan a aparearse por sus extremos en puntos muy cercanos a la envoltura nuclear. Luego, como en una especie de cierre, los cromosomas continúan apareándose para alinearse en toda su extensión, quedado los genes homólogos enfrentados. Esta estructura se llama complejo sinaptonémico (Fig. 4), donde los cromosomas homólogos así apareados son un bivalente que en realidad es una tétrada ya que cada uno de los dos cromosomas está duplicado.
FIGURA 4: Complejo Sinaptonémico.
En el Paquiteno, que puede durar varios días, ocurren las recombinaciones en que se intercambia el material genético de cada cromosoma con su homólogo. En el Diploteno los cromosomas homólogos se desaparean, el complejo sinaptonémico se deshace y los cromosomas homólogos quedan separados, aunque permanecen unidos a
través de los quiasmas. En esta etapa los cromosomas se descondensan y ocurre síntesis de ARN. En la Diacinesis la síntesis de ARN cesa, los cromosomas se condensan intensamente y se sueltan de la envoltura nuclear que comienza a desaparecer. Los cromosomas homólogos siguen unidos a través de los quiasmas (Fig. 5) en los lugares donde ha ocurrido recombinación.
FIGURA 5: Quiasmas.
En este punto termina la Profase I y comienzan las etapas de división celular propiamente tal: II.
Metafase II: En esta etapa desaparecen los quiasmas. Los centríolos se encuentran duplicados y se mueven hacia los polos de la célula. Se organiza el huso mitótico y los cromosomas se ubican por pares homólogos en el centro de la célula, de modo que cada cromosoma de un par homólogo se orienta hacia un polo diferente de la célula, sin importar si es paterno o materno, lo que genera diferentes distribuciones posibles de cromosomas, aumentándose la variabilidad genética del proceso.
III.
Anafase II: Los cromosomas migran hacia polos opuestos de la célula, segregándose los cromosomas homólogos en los extremos opuestos de ella, gracias a la aldepolimerización y polimerización de los microtúbulos del huso mitótico.
IV.
Telofase II: Alrededor de los cromosomas en cada extremo de la célula se reconstituye la envoltura nuclear. La cromatina se descondensa y, casi simultáneamente, ocurre la división del citoplasma o citodiéresis.
Después de la primera división cada célula resultante tiene la mitad del número de cromosomas original, pero cada cromosoma se encuentra duplicado y compuesto por dos cromátidas hermanas. Ahora comienza la segunda división celular, sin que se produzca una nueva duplicación del ADN. V.
Profase II: La cromatina se condensa nuevamente en cromosomas y la envoltura nuclear desaparece.
VI.
Metafase II: Los cromosomas se ubican en el centro de la célula y el huso mitótico se une a ellos de modo que cada cromátida hermana se orienta hacia un polo distinto de la célula.
VII. VIII.
Anafase II: Cada cromátida hermana migra hacia un polo distinto de la célula. Telofase II: Alrededor de los cromosomas en cada polo de la célula se reconstituye la envoltura nuclear, se descondensan los cromosomas y ocurre la división del citoplasma.
Cada célula resultante después de la segunda división meiótica es haploide, ya que tiene sólo la mitad de los cromosomas originales de la especie, y cada cromosoma tiene sólo una cromátida.
FIGURA 6: La meiosis. FECUNDACIÓN En el proceso de fecundación (Fig. 7) los gametos haploides se fusionan para dar origen a un nuevo organismo diploide. Cuando esto ocurre, el óvulo se activa para comenzar el desarrollo del nuevo individuo y los núcleos de ambos gametos se fusionan para formar el genoma del nuevo organismo.
FIGURA 7: Esquema del proceso de fertilización. La fecundación es un proceso especie-específico, lo que quiere decir que los espermios y óvulos de cada especie se reconocen entre sí a través de moléculas especiales de adhesión, lo que impide que espermios de una especie fertilice óvulos de una especie diferente. Aunque muchos espermios ataquen a un mismo óvulo (Fig. 8), un óvulo sólo puede ser fecundado por un espermio. La poliespermia se encuentra bloqueada gracias a una despolarización rápida de la membrana del óvulo, el cambio de las cargas a través de la membrana impide que un segundo espermio pueda fusionarse. Esto es importante, porque si más de un espermio inyecta su núcleo en un óvulo se forma más de un huso mitótico y la segregación de los cromosomas durante la división celular es anormal, resultando en embriones alterados o no viables.
FIGURA 8: Microfotografía electrónica de un óvulo rodeado de espermios. La fertilización comienza cuando la cabeza de un espermio contacta la cubierta gelatinosa de un óvulo. Esto gatilla en el espermio la llamada reacción del acrosoma, en la que el contenido de la vesícula del acrosoma se libera al medio externo. Este proceso consiste en enzimas hidrolíticas que ayudan al espermio a penetrar la cubierta del óvulo y así llegar a la capa vitelina, proteínas que ayudan a la unión del acrosoma a esa capa, y enzimas hidrolíticas que ayudan a penetrar a través de la capa vitelina para llegar a la membrana plasmática. Cuando las dos membranas plasmáticas entran en contacto se fusionan, y así se produce la entrada del núcleo del espermio hacia el interior del óvulo. Una vez fertilizado el óvulo pasa a llamarse cigoto. Una vez que los dos pro-núcleos se encuentran en el interior del óvulo, deben migrar para encontrarse y poder fusionarse. Este movimiento se realiza por medio del citoesqueleto. Los cromosomas se juntan cuando las envolturas nucleares desaparecen en preparación a la primera división celular, dando término al proceso de fecundación y comenzando el desarrollo embrionario.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS A) Observación microscópica del proceso de fecundación in vitro de un enquinodermo típico Tetrapygus niger (Molina) (Echinodermata) o de un bivalvo típico Mytilus chilensis (Hupé) (Mytilidae). Los equinodermos (Echinodermata: Echinoidea) son organismos invertebrados exclusivamente marinos, de cuerpo relativamente esférico y de simetría radial pentamérica. La característica principal de este grupo de animales es la presencia de un esqueleto formado por capas calcáreas que pueden articularse entre sí o presentarse fusionadas, formando una concha esquelética rígida. En la forma típica el esqueleto posee tubérculos o espinas que se proyectan dando a la superficie un aspecto rugoso o espinoso. (Fig. 9).
FIGURA 9: Esquema de la morfología externa e interna de un equinodermo tipo.
Por otra parte, los bivalvos se caracterizan por presentar una concha dura en la que el carbonato cálcico es el componente principal. La clase Bivalva, comprende quizás las formas más populares como lo son las ostras, los mejillones (choritos), las almejas, las arcas o pepitonas y las vieiras o pectínidos. Todas se caracterizan por tener el cuerpo comprimido por dos valvas unidas dorsalmente por medio de un gozne o ligamento, un pie muscular característico y una cavidad que encierran los órganos, agrupados en una masa visceral rodeada por un manto, el cual secreta la concha calcárea externa. Dentro de los bivalvos existen especies que desarrollaron diversas especializaciones, permitiéndoles vivir en distintos ambientes, ya sea en forma libre o fija a sustratos duros por una estructura llamada biso (Fig. 10).
FIGURA 10: Esquema de la morfología externa e interna de un bivalvo tipo.
ACTIVIDAD PRÁCTICA N° 1: Con el objeto de obtener especímenes de erizo negro o chorito adecuados para nuestro trabajo práctico, se escogieron ejemplares vivos y se mantuvieron en un acuario con agua de mar filtrada, suministrando una adecuada oxigenación del medio con una bomba de aire. En los erizos regulares se observan cinco gónadas suspendidas a lo largo de los interambulacros en el lado interno del caparazón. De cada gónada parte un gonoducto corto que se extiende aboralmente abriéndose a un gonoporo localizado sobre una de las cinco placas genitales. Una forma de detectar el sexo de los individuos es mediante el color de las gónadas (amarillas en los machos y rojizas en las hembras), ya que estos animales no presentan dimorfismo sexual externo. Para tener acceso a las gónadas hay que realizar cortes de las placas córneas mediante un bisturí o una tijera fina en el extremo aboral, teniendo especial cuidado en no romper las estructuras internas. En los choritos las gónadas están compuestas por conductos ciliados ramificados desde donde se abren numerosos sacos o folículos, se encuentran rodeando el intestino y están muy próximas, siendo a veces muy difícil separarlas. Cuando las gónadas o el tejido gonadal han alcanzado la plena madurez, son fáciles de ver y ocupan gran parte del cuerpo blando del animal. Los gonoductos que transportan los gametos hasta la cavidad corporal se desarrollan, aumentan de tamaño y se pueden observar a simple vista. El color es la característica que permite diferenciar a machos de hembras, siendo las gónadas de los primeros de color amarillo y en el caso de las hembras de color café oscuro. •
Una vez identificadas las gónadas se toma una muestra de gametos masculinos de los ejemplares con gónadas amarillas, presionado suavemente sobre la gónada hasta poder aspirar con una pipeta Pasteur la solución líquida que se libera. Este procedimiento permite obtener espermatozoides maduros, los cuales una vez
obtenidos deben ser depositados en un vaso precipitado pequeño. mismo procedimiento con los ejemplares de gónadas rojas o (hembras), se obtienen óvulos maduros, los que al igual que en el deben ser depositados en un vaso precipitado pequeño para observación al microscopio.
Repitiendo el café oscuras caso anterior, su posterior
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Ya obtenidos los gametos se debe adicionar a cada vaso precipitado 2 ml de agua de mar filtrada, con el objeto de resuspender las células y evitar que se deshidraten.
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Una gota de la solución que contiene a los gametos de ambos sexos deben ser depositada, utilizando un gotario, en ambos extremos de un portaobjetos excavado rotulado, identificando claramente que extremo es el que contiene cada muestra.
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En el centro del mismo portaobjetos debe ser depositada una gota de la solución que contiene gametos femeninos y sobre ésta una de gametos masculinos, procurándose así el contacto entre ellos y la posterior fecundación.
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Antes de llevar la muestra al microscopio deposite sobre las muestras un cubreobjeto y aplicando sus conocimientos de microscopía, observe la muestra con los objetivos 4X, 10X y 40X.
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Describa brevemente sus observaciones, caracterizando la estructura de los gametos y su comportamiento en cada una de las muestras.
B) Observación microscópica de preparaciones permanentes de tejidos vegetales en distintas etapas de la mitosis. ACTIVIDAD PRÁCTICA N°2: •
Aplicando sus conocimientos de microscopía observe la preparación de mitosis en raíz de células vegetales de Allium cepa (L.).
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Identifique en el tejido observado células que se encuentren en distintas etapas de la mitosis, indique sus características principales realizando un dibujo simple, esquemático y claro.
C) Observación microscópica de una preparación permanente de tejidos en meiosis. ACTIVIDAD PRÁCTICA N°3: •
Aplicando sus conocimientos de microscopía observe la preparación de gametogénesis femenina y masculina en tejido ovárico y testicular de Rattus norvegicus (Berkenhout), respectivamente.
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Identifique en la preparación observada células en distintas etapas de maduración, describiendo sus características principales en un dibujo simple, esquemático y claro.
D) Observación microscópica de preparaciones permanentes de gametos masculinos. ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº4: • Observe detalladamente la morfología de las células espermatozoides de Bos taurus (Linnaeus) y Rattus norvegicus (Berkenhout). Realice un esquema de sus estructuras características.
BIBLIOGRAFÍA Biología Celular y Molecular. De Robertis y de Robertis. 11 ed., 2da impresión, 1998, Ed. El Ateneo, Bs. Aires. Elementos de Biología Celular y Genética. Parte 3. Transmisión de la Información y Reproducción. Varios Autores.1ª ed., 1985, Departamento de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Molecular Biology of the Cell. Alberts, Bray, Lewis, Raff Roberts & Watson. 3th ed., 1994, Garland Publishing Inc., New York & London. Zoología de los Invertebrados. Barnes, R., 2ª edición, 1969, Ed. Interamericana, México. Histología humana. Stevens, Alan. 3ª ed., 2006. Histología [recurso electrónico]: Texto y atlas color con biología celular y molecular. Ross, Michael H. 5a. ed.; 2007.
