Fundamentos y Tipos de ELISA Autor: Cultek, S.L.U El ELISA es una técnica que se basa en el uso de un antígeno o un anticuerpo marcado con una enzima; al estar uno estos componentes marcado y fij ado a un soporte, se interrumpe la reacción antígeno-anticuerpo, posteriormente se le agrega un sustrato especifico sobre la enzima que producirá un color determinado observable a simple vista o cuantificable por un espectrofotómetro o analizar la reacción antígeno anticuerpo. Existen diversos tipos de ELISA los que se marca el anticuerpo: directo, indirecto, sándwich: Doble, Heterólogo. En cuanto a los pasos generales de un ELISA primero se tapizada el antígeno o anticuerpo, luego luego se agrega
la muestra problema con la mezcla de antígenos o
anticuerpos, se une el antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno ya tapizado, lavado para eliminar el exceso no unido. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima , unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo ,lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no adherida , adición del substrato, unión del substrato a la enzima, para luego obtener la coloración color ELISA directo: En este se fija el antígeno al soporte, se lava para eliminar los no fijados, luego se adicionan los anticuerpos marcados con la enzima para que reacción con el antígeno y que solubilizado el complejo, se lava para eliminar anticuerpos que no reaccionaron y se agrega un sustrato específico para la enzima, al final se observa la coloración. ELISA indirecto: En este la diferencia viene dad que a nivel que el elemento marcado por la enzima es un anti-anticuerpo que va a reaccionar con el anticuerpo, que reacciono junto al antígeno antígeno previamente fijado;
finalmente agrega un sustrato
específico para la enzima, se lava y se observa la coloración. ELISA sándwich doble: Se fija al soporte el anticuerpo específicos del antígeno en el suero problema, posteriormente se añade el suero problema y los antígenos de fijan a los anticuerpo, luego se lava para eliminar elementos no fijados, posteriormente se añaden anticuerpos conjugados con una enzima(de diferente epítopo a los previamente fijados) f ijados) estos e stos reaccionan r eaccionan con los antígenos de la muestra problema que se encuentran fijados a los otros anticuerpos, se lava la muestra y se añade un sustrato a la enzima marcadora y se observa el color visual o por colorimetría, en cuanto al ELISA
sándwich triple la diferencia viene dada por que los segundos anticuerpos que se colocan no son marcados con la enzima, si no que luego se coloca anti-anticuerpos conjugados con la enzima que reaccionaran con los anticuerpo que se colocaron luego, posteriormente se lava y se coloca el sustrato especifico para la enzima. ELISA Competitivo: Fijación de anticuerpos específicos al soporte anticuerpos, adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos (objeto de estudio).Al mismo tiempo, añadir únicamente antígenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima, lavar. Agregar un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son iguales, el antígeno a estudio no tiene nada que ver con los anticuerpos empleados en el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antígeno objeto de estudio, está relacionado con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de absorbancia o densidad óptica, es proporcional a la concentración del antígeno problema. Métodos específicos Para lograr el tapizado de antígenos y anticuerpos de diluye el antígeno o anticuerpo en tampón carbonato (pH 9,6) y se incuba luego durante 3h a 37°C o 16h a 4°C, también de puede incubar a 40-50°C en tampón fosfato (PBS) o en agua fisiológica tamponada pH 7,2-7,4. En cuanto a la solución de lavado se elaborara una solución salina con Tween 20 como agente tensioactivo8, 5gr. De igual forma se debe conjugar la enzima, esta debe de poder unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos, un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente. Las enzimas más utilizadas son las fosfatas alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa.
Métodos de lectura de resultados Colorimetría: En estos ensayos se obtiene un producto de reacción coloreado que absorbe luz, siendo la densidad óptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de producto medido. Para todos los ensayos enzimáticos, la etapa final es la adición del substrato enzimático, este es escogido por su rendimiento en la reacción enzimática. Para ensayos colorimétricos, la tasa de desarrollo de color es proporcional, dentro de un cierto rango, a la cantidad de conjugado enzimático presente. Fluorescencia: La fluorescencia es una variación de la colorimetría en este un producto de reacción emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda, siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizado. En comparación con los métodos colorimétricos, los ensayos de fluorescencia son ligeramente más sensibles y, sufren a cambios de pH, temperatura, restos de detergente en el lavado y concentración iónica. Lo que lo hace mas funcional es que amplia el rango de medida en cuanto al obtenido en los ensayos colorimétricos. Luminiscencia: En este proceso la enzima actúa sobre un sustrato generando un producto capaz de emitir fotones en lugar de generar un color visible, este proceso se define como la capacidad de emitir luz por parte una sustancia esta puede ser mediante una reacción química (quimioluminiscencia), mediante una longitud de onda (fotoluminiscencia=
florescencia)
o
mediante
un
producto
al
ser
degradado
(bioluminiscencia). Para poder interpretar los resultados, se puede observar el color a simple vista, pero el ojo humano no es capaz de notar la variación de 0,1 de densidad óptica, por eso se usa el espectrofotómetro para poder así cuantificar los resultados. Es importante resaltar que las soluciones ELISA es un método de inmunodetección que se utiliza para detectar diversas patologías animales y vegetales.
