Elisa Fundamentos Tipos y Aplicaciones

ELISA: FUNDAMENTOS TIPOS Y APLICACIONES GUSTAVO PANANA ACUÑA DIRECTOR TÉCNICO CENTRO DE DIAGNOSTICO CANTELLA

POR QUE ELISA?

ELISA CONCEPTOS Y FORMATOS DE ENSAYO •

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El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática.  Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un

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ELISA HOMOGÉNEO ELISA HETEROGÉNEO  ELISA DIRECTO  ELISA DE CAPTURA  ELISA COMPETITIVO  ELISA NO COMPETITIVO

METODOLOGÍA DE ELISA Diferentes ELISA  Detección de anticuerpos específicos: ELISA indirecto  ELISA doble sandwich 



Detección de antígenos: ELISA directo competitivo  ELISA sandwich 

PASOS GENERALES DE UN ELISA

Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo

Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o

 Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.

 Adición del anticuerpo secundario marcado con la

Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo

Unión del anticuerpo secundario al antígeno o

PASOS GENERALES DE UN ELISA

Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida

 Adición del substrato

Desarrollo del color

Unión del substrato a la enzima

QUE DETECTA?

Detección de Proteínas o un organismo

Detección de una Molécula pequeña

ELEMENTOS DE UN ELISA 

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Pocillos  Microplacas de poliestireno  Volumen de 350 uL 2   Área interna de 2.5 cm  Formato de 96 pocillos  Adsorción de Antígenos o Anticuerpos  Dilución del antígeno o anticuerpo en buffer carbonato (pH 9.6) e incubación 3h 37°C  Tratamiento a 40-50°C con PBS hasta desecación

ELEMENTOS DE UN ELISA 

Solución de Lavado  Cloruro de Sodio  Tween 20   Agua Destilada  PBS

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Conjugados  ß-galactosidasa  Fosfatasa Alcalina  Peroxidasa

SENSIBILIDAD 



Depende exclusivamente del valor K (constante de equilibrio entre la interacción antígeno-anticuerpo) Con K = 10 12M-1 y 1% CV, la detección más baja posible es de 10-14 M

Como Incrementamos la sensibilidad?  Reducir ruido de fondo, optimizando la union antígeno al pocillo y sesiones de lavado  La baja calidad de los pocillos suele dar señales bajas o bajo nivel de unión con el antígeno  Incorporando técnicas indirectas de marcado   Aumentando los tiempos de incubación hasta el punto de equilibrio de la reacción.

TÉCNICA: MEIA

 APLICACIONES Enfermedades producidas por parásitos  Babesias y tripanosomas  Toxocara canis Toxoplasmosis   Triquinosis Enfermedades producidas por Micoplasmas Enfermedades producidas por bacterias Mycobacterium tuberculosis   Brucelas  Enterotoxinas Vibrio cholerae Estreptococos   Salmonelas Enfermedades producidas por virus  Enfermedad de Aujeszky Enfermedad de Newcstle   Fiebre aftosa  Leucemia felina Peste porcina africana  Peste porcina clásica   Rinotraqueitis infecciosa  Rotavirus   Artritis vírica

Hormonas  Gonadotropina coriónica Progesterona  Testosterona   Hormonas tiroideas Cuantificación de inmunoglobulinas IgG   IgE  IgA  Anticuerpos   Anti-DNA  Factor reumatoide Inmunocomplejos circulantes 

EQUIPOS REQUERIDOS

FASES QUE DEBIÓ PASAR EL KIT ANTES DE PODER SER COMERCIALIZADO O EMPLEADO EN EL LABORATORIO DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DEL ENSAYO

VALIDACIÓN ANALÍTICA

VALIDACIÓN CLÍNICA

VALIDACIÓN DE ELISA En el desarrollo de un nuevo kit estos ensayos incluyen:

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Estudios de estabilidad



  

De las placas, látex etc. sensibilizadas De los conjugados De los sustratos.

Análisis de muestras



  

En paneles caracterizados En poblaciones al azar Establecer efecto de la matriz e interferencias

no específicas.