Laporan Praktikum Genetika ENZYME-LINK ENZYME-LINKED ED IMMUNO IMMUNOSORBEN SORBENT T ASSAY ASSAY (ELISA)
Widya Setyaningtyas*, Haniyya, I. Sobari, K.S. Juarna, N. Restiana, Nuruliawati, A. Nurfitriana, R. Arita Universitas Indonesia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Departemen Biologi Mei 2012
Abstrak Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) merupakan metode uji imunologi berdasarkan reaksi spesisfik
antara antigen dan amtibodi. ELISA digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen dan antibodi pada suatu sampel. Prinsip kerja ELISA adalah reaksi spesifik antara antigen dan antibodi dengan menggunakan enzim sebagai penanda reaksi. Antigen merupakan makromolekul yang dapat menginduksi pembentukan antibodi. Antibodi adalah protein yang diproduksi oleh sistem imun akibat keberadaan antigen. Pemanfataan ELISA adalah untuk mengidentifikasi keberadaan antigen dan antibodi, menghitung konsentrasi antigen dan antibodi, serta sebagai alat diagnostik suatu penyakit. Hasil praktikum adalah didapatkan nilai kuantitatif dan kualitatif dari suatu sampel protein.
Kata kunci: ELISA; antigen; antibodi
keberadaan protein (Albala & Smith 2003: 132). ELISA
1. Pendahuluan
juga digunakan untuk menentukan keberadaan antigen Tujuan dilakukannya praktikum ELISA adalah untuk memahami prinsip kerja ELISA, mengetahui
dan jumlah antigen dalam suatu sampel (Ausubel dkk. 2003: 1647).
konsentrasi antigen atau antibodi dalam sampel. Selain
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
itu juga untuk menentukan suatu sampel negatif negatif atau
adalah metode untuk mendeteksi serta menghitung
positif mengidap suatu penyakit tertentu berdasarkan
konsentrasi antibodi atau antigen sampel secara spesifik
teknik ELISA. Latar belakang dilakukannya praktikum
(Ravichandra 2010: 337).
dengan
menggunakan
metode
enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) adalah untuk mendeteksi
*) Kelompok 2A
Protein pada sampel yang
telah dipisahkan berdasarkan berat molekulnya dengan teknik SDS-PAGE, sulit untuk dipastikan jumlah relatif
1
protein tersebut. Teknik ELISA digunakan untuk
126). Sandwich ELISA atau ELISA lapis ganda
menghitung serta memastikan konsentrasi dari protein
dicirikan
dari suatu sampel (Miller 2006: 43).
diikatkan pada fase padat. Teknik tersebut terdiri dari
oleh
antibodi
penangkap
antigen
yang
dua macam, yaitu direct sandwich ELISA dan indirect
Teknik ELISA didasarkan pada reaksi spesifik memiliki
sandwich ELISA. Antibodi penangkap pertama kali
sensitivitas dan spesifitas tinggi dengan menggunakan
diletakkan ke dalam wells kemudian antigen dari darah
enzim sebagai indikator. Prinsip dasar ELISA adalah
atau urin ditambahkan ke dalam
analisis interaksi antara antigen dan antibodi dengan
berikatan dengan antibodi penangkap. Jika ke dalam
menggunakan enzim sebagai penanda reaksi (Yusrini
wells langsung ditambahkan antibodi detektor yang telah
2005: 16--17). Prinsip kerja ELISA adalah adanya ikatan
dilabel enzim maka disebut dengan direct sandwich
antara
ELISA,
antara
antigen
antigen
dengan
dan
antibodi
antibodi
yang
kompleks
dengan
sedangkan
apabila
wells
ditambahkan
sehingga
antibodi
penambahan substrat tertentu dan enzim peroksida yang
detektor yang tanpa dilabel enzim terlebih dahulu
akan memberikan perubahan warna pada hasil yang
disebut dengan indirect sandwich ELISA (Berg 2002:
positif (Azwar 1985: 2).
1).
ELISA memiliki 3 macam tipe yang terdiri atas
Antigen merupakan substansi makromolekul
direct ELISA, indirect ELISA, dan sandwich ELISA.
yang muncul dalam tubuh atau akibat introduksi dari
Sandwich ELISA dapat dibedakan menjadi 2 jenis yaitu
luar sehingga dapat menginisiasi reaksi imun. Respon
direct sandwich ELISA dan indirect sandwich ELISA
dari reaksi imun terhadap munculnya antigen adalah
(Ausubel dkk. 2003: 1654). Direct ELISA merupakan
memproduksi antibodi dalam jumlah yang efektif untuk
metode ELISA yang paling sederhana. Direct ELISA
menghilangkan antigen dari tubuh (Ahluwalia 2009:
digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen pada
331). Antibodi adalah suatu protein dapat larut yang
sampel. Direct ELISA mendeteksi antigen dengan cara
dihasilkan
mengikat antigen dengan antibodi yang telah dilabel
keberadaan antigen (Sloane 1995: 256).
dengan enzim. Reaksi pengikatan tersebut terjadi secara
merupakan zat yang ada di dalam tubuh dan berasal dari
spesifik (Ausubel dkk. 2003: 1658). Direct ELISA
luar tubuh (sel asing) yang dapat memulai reaksi
memerlukan antibodi yang khas untuk antigen yang
kekebalan. Antigen ada pada permukaan sel darah merah
dideteksi. Kelemahan utama dari direct ELISA adalah
dan sel darah putih yang penting dalam sistem imun
tidak fleksibel. Enzim yang digunakan untuk amplifikasi
tubuh (Ahluwalia 2009: 331). Antibodi berfungsi
reaksi diikatkan secara kovalen pada antibodi yang
mengikat antigen pada organisme penginvasi, dan
langsung berikatan dengan antigen (Akin 2006: 125).
mencetuskan
Indirect ELISA banyak digunakan untuk mengukur
kemudian
konsentrasi antibodi.
Enzim diikatkan pada antibodi
Antibodi memberi tanda pada organisme asing tersebut
sekunder yang berikatan dengan antibodi primer.
sehingga dapat dihancurkan oleh sel fagositik (Marks
Antigen dan antibodi sekunder biasanya dibuat konstan
dkk . 1996: 89).
dan yang berubah adalah antibodi primer (Akin 2006:
2
sistem
imun
proses
menjadi
di tidak
sebagai
mana aktif
respon
organisme atau
terhadap Antigen
tersebut
dihancurkan.
Aplikasi dari ELISA salah satunya adalah clinical laboratory.
ditambahkan ke dalam wells agar reaksi enzimatik
Uji clinical laboratory umumnya
berhenti sehingga berubah warna menjadi kuning.
digunakan untuk mendeteksi protein dari patogen, atau
Ketujuh, optical density (OD) diukur dengan ELISA
“marker” yang mengindikasi adanya infeksi atau
reader , sehingga didapatkan konsentrasi antigen atau
penyakit. Aplikasi umum dari ELISA dalam uji infeksi
antibodi.
adalah identifikasi antibodi patogen spesifik dalam serum (Walker & Rapley 2005: 419).
Aplikasi dari
ELISA lainnya yaitu untuk mendeteksi infeksi virus HIV
3. Hasil dan Pembahasan
(Nicholl 2008: 228). blocking
Pemberian
antigen yang tidak spesifik (Walker 2002: 1086). Washing buffer adalah larutan buffer yang berfungsi
Alat yang digunakan dalam praktikum ELISA
untuk menghilangkan antigen dan antibodi yang tidak
antara lain 96 well plate, multichannel pipet, tips, ELISA
berikatan. Larutan yang dapat menjadi washing buffer
reader , dan ELISA washer . Bahan yang digunakan pada
antara lain tris-buffered saline (TBS) atau phosphate
praktikum ELISA adalah washing buffer , blocking antigen,
penangkap
0.2
sampai
(antibodi
10
monoklonal
atau
buffer
antibodi
enzim phosphatase
dan
75
saline
(PBS).
Antibodi
monoklonal
atau
poliklonal dapat digunakan sebagai antibodi penangkap
antibodi
pada tipe sandwich ELISA. Antibodi monoklonal
poliklonal), 50 antibodi detektor yang telah dilabel dengan
untuk
menjaga pH dan menghindari ikatan antibodi dengan
2. Metodologi
buffer ,
buffer berfungsi
mempunyai monospesifitas yang memungkinkan hasil
substrat
deteksi yang baik dan perbedaaan kuantitas yang kecil
chromogenic. Substrat chromogenic dapat berupa 4-
pada konsentrasi antigen. Antibodi poliklonal digunakan
methylumbelliferyl phosphate (MUP) atau p-nitrophenyl
untuk menarik sebanyak
phosphate (NPP).
mungkin antigen (Noonan
2012: 1). Inkubasi dilakukan agar antibodi dan antigen
Cara kerja pada praktikum ELISA adalah
dapat saling berikatan dengan sempurna. Penambahan
pertama wells ELISA (96 polystryrene well plate)
asam H2SO4 bertujuan untuk menghentikan reaksi
dilapisi dengan antibodi penangkap, dan diinkubasi
enzimatis (Ausubel
selama satu malam. Kedua, blocking buffer dimasukkan
chromogenic substrate TMB akan
ke dalam wells kemudian antigen juga dimasukkan ke dalam wells tersebut.
dkk. 2003: 1661). Pemberian
menyebabkan
substrat terwarnai sehingga mengekspresikan besarnya
Ketiga, antibodi detektor yang
nilai OD (Walker 2002: 1087).
telah tertaut enzim HRP ( Horse Radish Peroxides) Pengamatan
dimasukkan ke dalam wells. Keempat, yaitu proses pencucian (washing).
TMB
(3,3’,5,5’
ELISA
dilakukan
secara
kuantitatif maupun kualitatif. Hasil ELISA secara
Kelima, chromogenic substrate
tetramethylbenzidine)
hasil
kuantitatif dapat diamati dari nilai optical density (OD)
dimasukkan, hidrogen
yang diukur dengan menggunakan ELISA reader
peroksida yang berwarna biru. Keenam, asam H2SO4
(Miller 2006: 7). Hasil kuantitatif adalah data ELISA
sehingga
substrat
teroksidasi
menjadi
3
dapat diinterpretasikan dalam perbandingan dengan
Prinsip kerja ELISA didasarkan pada reaksi
kurva standar (purifikasi antigen) agar dapat secara tepat
antara antigen dan antibodi secara spesifik, dengan
digunakan untuk menghitung konsentrasi antigen dalam
menggunakan
berbagai sampel (Sylvest 2010: 1). Hasil ELISA secara
Konsentrasi antigen dalam suatu sampel dapat diketahui
kualitatif dapat diamati dengan adanya perubahan warna
dengan menggunakan kurva standar dan perhitungan
menjadi kuning pada reaksi pengujian jika sampel yang
persamaan linear. Untuk menentukan sampel negatif
diuji mengandung virus.
atau
Semakin tinggi intensitas
enzim
positif
sebagai
menderita teknik
suatu
ELISA
penanda
penyakit
yaitu
reaksi.
tertentu
warna yang terbentuk, maka semakin tinggi pula
berdasarkan
dengan
cara
konsentrasi virus pada sampel tersebut (Miller 2006: 8).
membandingkan nilai sampel rasio dengan kiteria
Semi-kuantitatif adalah data ELISA dapat digunakan
masing-masing sampel positif dan negatif. Sampel
untuk membandingkan tingkat relatif dari antigen di
dengan rasio yang bernilai kurang dari 0,5 bernilai
dalam sampel uji karena intensitas sinyal akan bervariasi
negatif, sedangkan sampel yang bernilai positif memiliki
secara langsung terhadap konsentrasi antigen. Data
nilai minimal 0,5.
ELISA biasanya digambarkan dengan nilai optical density (OD) dan konsentrasi log untuk menghasilkan
Daftar Pustaka
kurva sigmodial. Hal ini dapat dilakukan dengan menggambar grafik langsung atau dengan software
Ahluwalia, K. B. 2009. Genetics. 2nd ed. New Age
curve fitting yang biasanya ada pada ELISA reader
International Ltd., New Delhi: xvi + 444 hlm.
(Sylvest 2010: 2).
Akin, H. M. 2006. Virologi tumbuhan. Kanisius,
Persamaan linear dari kurva standar pada lampiran
Yogyakarta: 191 hlm.
soal adalah y = 0,0019x + 0,0457. Nilai sampel rasio
Albala, J. S. & I. H. Smith. 2003. Protein Arrays,
didapatkan dari perhitungan nilai OD sampel dibagi
Biochips, and Proteomics: The next phase of
dengan nilai OD cut off (nilai minimum sampel
genomic discovery. Marcel dekker, Inc., USA: xiv
dikatakan positif) yaitu sebesar 0.2. Kriteria sampel
+ 407 hlm.
negatif apabila nilai sampel rasio 0.5. Kriteria sampel
Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore,
positif apabila nilai sampel rasio 0.5. Sampel rasio
J.G. Seidman, J.A. Smith & K. Struhl. 2003.
dengan OD value 0,050 adalah 0,25, sehingga sampel
Current Protocols in Molecular Biology. John
dinyatakan negatif menderita penyakit demam berdarah.
Wiley & Sons, Inc., USA: xii + 4384 hlm. Azwar, I. G. M. 1985. Kemungkinan Penggunaan
Sampel dengan OD value 0,0487 bernilai 0,2435, sampel dinyatakan negatif menderita penyakit demam
Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
berdarah. Sampel terakhir memiliki OD value 1,563
Dalam Diagnosa Serologis Brucellosis: 10 hlm.
yang bernilai 7,815 dinyatakan positif menderita demam
http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/12345
berdarah.
6789/39637/B85igm_abstract.pdf?sequence=2. 19
4. Kesimpulan
Mei 2012, pk. 17.04.
4
Berg, J. M. 2002. Indirect ELISA and Sandwich ELISA:
learner oleh James Veldman. EGC, Jakarta: x +
1 hlm.
389 hlm.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22420/
Sylvest, L. 2010. An Introduction to ELISA: 1 hl m.
20 Mei 2012 15.40.
http://www.abdserotec.com/resources/elisa-
Marks, D. B., A. D. Marks & C. M. Smith. 1996. Basic
technical-resources-and-troubleshooting/an-
medical biochemistry: a clinical approach. Terj.
dari Biokimia
kedokteran
dasar:
introduction-to-elisa.html 19Mei 2012 20.43.
sebuah
Walker, J. M. & R. Rapley. 2005. Medical biomethods
pendekatan klinis oleh B.U. Pendit. EGC,
handbook . Humana Press Inc., New Jersey: 644
Jakarta: ix + 770 hlm.
hlm.
Miller, D. C. 2006. Mechanism(s) of enhanced vascular
Walker, J. M. 2002. The protein protocols handbook .
cell response to polymeric biomaterials with
2nd ed. Humana Press Inc., New Jersey: 1146
nano-structured
Information
surface
and
features.
Learning
ProQuest
Company,
hlm.
Ann
Yusrini, H. 2005. Teknik analisis kandungan aflatoksin
Arbor: 84 hlm.
B1
Nicholl, D.S.T. 2008. An Introduction to Genetic
secara
elisa
pada
pakan
20
hlm.
http://pustaka.litbang.deptan.go.id/publikasi/bt1
rd
Engineering, 3 ed. Cambridge University Press,
01055.pdf, 19Mei 2012. Pk. 08.15.
London: xii + 302 hlm. Noonan, M. 2012. Overview of ELISA: 1 hlm.
Sylvest, L. 2010. An Introduction to ELISA: 1 hl m.
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=F88
http://www.abdserotec.com/resources/elisa-
ADEC9-1B43-4585-922E-836FE09D8403 20
technical-resources-and-troubleshooting/an-
Mei 2012 19.21.
introduction-to-elisa.html 20 Mei 2012 pk 20.43.
Ravichandra, N. G. 2010. Methods and techniques in plant
nematology.
PHI
Learning
Private
Limited, New Delhi: 616 hlm. Sloane, E. 1995. Anatomi dan fisiologi untuk pemula. Terj. dari Anatomy and physiology: an easy
5
LAMPIRAN
1. Tugas Latihan saat Praktikum ELISA
Tabel data: Konsentrasi NS1
OD value
(pg/ml) 0
0.075
7.8
0.127
15.6
0.173
31.2
0.274
62.5
0.489
125
0.846
250
1.594
500
2.831
1. Kurva standar dan persamaan linearnya
Kurva Standar 3.5
y = 0.005x + 0.112 R² = 0.997
3 2.5
e u l a 2 V D1.5 O
Series1 Linear (Series1)
1
0.5 0 0
200
400
600
Konsentrasi NS1
2. Konsentrasi antigen NS1 pada sampel yang diketahui memiliki OD value 0,785 Dik. y = 0,785 y = 0,0056x + 0,1124 0,785 = 0,0056x + 0,1124 0,785 - 0,1124 = 0,0056x
6
0,6726 = 0,0056x
x
=
= 120, 107 pg/ml
3. Sample ratio ODvalue sampel = 0,785 ODvalue cut off = 0,2 Kriteria sampel negatif : sample ratio < 0,5 Kriteria sampel positif : sample ratio 0,5 Jawab: Sample ratio =
=
= 3,925 > 0,5
Sampel dinyatakan positif.
7
2. Tugas Latihan untuk Laporan Tabel data: Konsentrasi NS1
OD value
(pg/ml) 0
0.067
7.8
0.094
15.6
0.092
31.2
0.100
62.5
0.124
125
0.235
250
0.546
500
1.013
1. Kurva standar dan persamaan linearnya
Kurva Standar 1.2 y = 0.0019x + 0.0457 R² = 0.991
1 e 0.8 u l a 0.6 V D O0.4
Series1 Linear (Series1)
0.2 0 0
200
400
600
Konsentrasi Anti-NS1 (pg/ml)
2. Konsentrasi antigen NS1 pada sampel yang diketahui memiliki ODvalue: a.
0,050 y = 0,0019x + 0,0457 0,050 = 0,0019x + 0,0457 0,050 - 0,0457 = 0,0019x 0,0043 = 0,0019x
x
=
= 2,26 pg/ml
8
b. 0,487 y = 0,0019x + 0,0457 0,487 = 0,0019x + 0,0457 0,487 - 0,0457 = 0,0019x 0,4413 = 0,0019x
x c.
=
= 232,26 pg/ml
1,563 y = 0,0019x + 0,0457 1,563 = 0,0019x + 0,0457 1,563 - 0,0457 = 0,0019x 1,5173 = 0,0019x
x
=
= 798, 57 pg/ml
3. Sample ratio ODvalue cut off = 0,2 Kriteria sampel negatif : sample ratio < 0,5 Kriteria sampel positif : sample ratio 0,5
a.
ODvalue sampel = 0,050 Sample ratio =
=
= 0,25 < 0,5
Sampel yang dihasilkan bernilai negatif menderita demam berdarah.
b. ODvalue sampel = 0,0487 Sample ratio =
=
= 0,2435 < 0,5
Sampel yang dihasilkan bernilai negatif menderita demam berdarah.
c. ODvalue sampel = 1,563 Sample ratio =
=
= 7,815 > 0,5
Sampel yang dihasilkan bernilai positif menderita demam berdarah.
9
10
