BAB I PENDAHULUAN 1. Latar Belakang HIV/AIDS termasuk jajaran penyakit yang mempunyai tingkat penularan yang sangat tinggi. Hal ini terjadi karena seringkali seseorang tidak menyadari bahwa dirinya telah terinfeksi HIV, sehingga menjadi sumber penularan bagi orang lain. Sampai saat ini diperkirakan terdapat sekitar ! juta orang lebih yang terinfeksi HIV di seluruh dunia. "ntuk Indonesia sendiri diperkirakan orang yang terinfeksi HIV men#apai $%%.%%% sampai %%.%%% orang yang dari tahun ke tahun akan terus bertambah. Seseorang Seseo rang terke terkena na HIV bias biasanya anya dike diketahu tahuii jika telah terja terjadi di Sindr Sindrom om Defi Defisien siensi si Imun Dapat Dapatan an &AIDS' yang ditandai antara lain penurunan berat badan, diare berkepanjangan, Sarkoma (aposi, dan beberapa gejala lainnya. )erkembangnya teknologi pemeriksaan saat ini mengijinkan kita untuk mendeteksi HIV lebih dini.
Pemeriksaan Laboratorium yang paling umum dilakukan sebagai skrining pertama kali dalam dala m mela melakuka kukan n peme pemeriksa riksaan an An Anti ti HIV (mer (merupa upakan kan peme pemeriksa riksaan an anti bod body) y) yait yaitu u deng dengan an metode ELISA. *n+im-inked immune sorbent assay &*-ISA' atau dalam bahasa indonesiany indonesianyaa disebut sebagai uji penentuan kadar immunosorben tauten+im, merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibody dan antigen. ada awalnya, teknik *-ISA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibody dalam suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibody Ig, Ig0, dan IgA pada saat terjadi infeksi &pada tubuh manusia khususnya, misalya pada saat terkena 1irus HIV'. 2amun seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan,teknik *-ISA juga diaplikasikan dalam bidang patologi tumbuhan, kedokteran, dll.
2. Rumusan Masalah . $. )agaimana sejarah penemuan teknik *-ISA3 . . )agaimana prinsip dasar teknik *-ISA3 . 4. Apa saja alat dan bahan yang dibutuhkan dalam teknik *-ISA3 . 5. Apa saja kelebihan dan kelemahan teknik *-ISA3 . 6. Apa saja ma#amma#am teknik *-ISA3 . 7. )agaimana langakah kerja teknik *-ISA3
BAB II ISI 1. Sejarah Penemuan 8eknik 8e knik *-ISA pertama kali diperkenalkan pada tahun $9:$ oleh eter erlmann dan *1a *ng1all. ereka er eka men menggu ggunak nakan an tek teknik nik **-ISA ISA ini dal dalam am bid bidang ang imu imunol nolog ogii &*-ISA &*-ISA kon kon1en 1ensio sional nal'' unt untuk uk menganali menga nalisis sis inte interaksi raksi antara antig antigen en dan antib antibodi odi di dalam suatu sampe sampel, l, diman dimanaa inte interaksi raksi tersebut tersebut ditandai dengan menggunakan suatu en+im yang berfungsi sebagai pelopor/ reporter/ signal. Dalam perk perkemban embangan gan selan selanjutny jutnya, a, selain selain digu digunaka nakan n sebagai sebagai uji kual kualitat itatif if untuk untuk menge mengetahu tahuii keberadaan keber adaan suat suatu u anti antibodi bodi atau antig antigen en deng dengan an mengg menggunak unakan an anti antibodi bodi atau antig antigen en spes spesifik ifik,, tekni teknik k *-ISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kada antibodi atau antigen yang diujii denga diuj dengan n mengg menggunaka unakan n alat bantu erupa spektrofotom spektrofotometer eter atau dengan #ara menet menetukan ukan jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu kur1a standard an kadar antibodi atau antigen yang tidak diketahui dapat ditentukan.
2. Prinsi Dasar Dasa r !eknik !eknik ELISA rinsip dasar dari teknik teknik *-ISA ini se#ara simple dapat dijabarkan sebagai berikut ; ertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa mi#rotiter. enempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua #ara, yaitu penempelan se#ara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan mi#rotiter, dan penempelan se#ara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji &#ara ini digunakan pada
teknik *-ISA sandwi#h'. Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan
suatu en+im signal &disesuaikan dengan sampel <= bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik' tersebut, but, sehi sehingga ngga dapat terja terjadi di inte interaksi raksi antara anti antibodi bodi dengan di#ampurkan ke atas permukaan terse antigen yang bersesuaian. (emudian ke atas permukaan tersebut di#ampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan en+im signal. ada saat substrat tersebut tersebut di#ampurkan ke permukaan, en+im yang bertaut dengan deng an antib antibodi odi atau antigen spesifik yang berin berinterak teraksi si denga dengan n anti antibodi bodi atau anti antigen gen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. da *-ISA floures#ense misalnya, en+im yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran floures#ense.
". #ele$ihan %n #elemahan !eknik !eknik ELISA 8eknik 8e knik *-ISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain ; •
8eknik 8ek nik pengerjaan relatif sederhana
•
>elatif ekonomis &karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi'
•
Hasil memiliki tingkat sensiti1itas yang #ukup tinggi.
•
Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah &hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik'
•
Dapat digunakan dalam banyak ma#a m pengujian. Sedangkan kekurangan dari teknik *-ISA antara lain ;
•
?enis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik *-ISA ini hanya jenis antibodi monoklonal &antibodi yang hanya mengenali satu antigen'
•
Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik *-ISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
•
ada beberapa ma#am teknik *-ISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang menunjukka menun jukkan n respo respons ns posi positif tif yang diseb disebabkan abkan inefe inefekti1 kti1itas itas dari larut larutan an blo#k blo#king ing sehi sehingga ngga antib antibodi odi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut en+im signal dan menimbulkan signal.
•
>eaksi antara en+im signal dan substrat berlangsung relatif #epat, sehingga pemba#aan harus dilakukan dengan den gan #ep #epat at &pa &pada da per perkem kemban bangan ganny nya, a, hal ini dap dapat at dia diatas tasii den dengan gan mem member berika ikan n lar laruta utan n un untuk tuk menghentikan reaksi'.
&. Alat %an Bahan 'ang 'ang Digunakan Alat paling utama yang digunakan dalam teknik *-ISA adalah mi#rotiter. i#rotiter ini berupa suatu papan plastik dengan #ekungan sebanyak 97 buah &! #ekungan ke arah bawah dan $ #ekungan ke samping'. i#rotiter ini terbuat dari bahan plistirena. @ekungan dari mi#rotiter memiliki tinggi sekitar $ #m dan diameter %,: #m. # m. Selain itu, alat dan bahan lain yang umum digunakan dalam teknik *-ISA antara lain ;
•
Antigen yang dimurnikan &jika sampel yang akan dideteksi atau dikuantifikasikan berupa antibodi'.
•
-arutan standard &kontrol positif dan negatif'.
•
Sampel yang ingin dites.
•
@airan pen#u#i &buffer'.
•
Antibodi atau antigen yang tertaut dengan en+im signal.
•
Substrat yang bersifat spesifik terhadap en+im signal.
•
*-ISA reader &spektrofotometer' untuk pengukuran kuantitatif.
(. Ma)am*ma)am !eknik ELISA Se#ara umum, teknik *-ISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik *-ISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigenen+im atau konjugat antibodien+im, dan teknik *-ISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi &primer dan sekunder'. ada teknik *-ISA nonkompetitif, antibody keduaa &sek kedu &sekunder under'' akan diko dikonjug njugasik asikan an deng dengan an en+im yang berfu berfungsi ngsi sebagai sign signal. al. 8e 8eknik knik *-IS *-ISA A nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik *-ISA sandwi#h. Dewasa ini, teknik *-ISA telah berkembang menjadi berbagia ma#am jenis teknik. erkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik *-ISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. )erikut ini adalah beberapa ma#am teknik *-ISA yang relatif sering digunakan, antara lain ;
(. 1. ELISA Dire)t 8ekni 8e knik k *-ISA *-ISA in inii merupa merupakan kan tekn teknik ik *-ISA *-ISA yan yang g paling paling sede sederha rhana. na. 8ek 8eknik nik ini ini serin seringka gkali li digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel *-ISA dire#t menggunakan suatu antibody spesifik &monoklonal' untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji. ada *-ISA dire# dire#t, t, pertam pertamaa mi#ro mi#rotiter titer diis diisii deng dengan an sampe sampell yang menga mengandun ndung g anti antigen gen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dindingdinding lubang mi#rotiter, kemudi kem udian an mi# mi#rot rotite iterr di dibil bilas as unt untuk uk mem membua buang ng an antig tigen en yan yang g tid tidak ak men menemp empel el pda din dindin ding g lub lubang ang mi#rotiter. -alu antibodi yang telah ditautkan dengan en+im signal dimasukkan ke dalam lubanglubang mi#rot mi# rotite iterr seh sehing ingga ga dap dapat at ber berint intera eraks ksii den dengan gan ant antige igen n yan yang g dii diingi ngink nkan, an, yan yang g dil dilanj anjut utkan kan den dengan gan membilas membi las mi#ro mi#rotite titerr untu untuk k membu membuang ang anti antibody body tertaut en+im signl yang tida tidak k berin berinterak teraksi si deng dengan an antigen. -alu, ke dalam lubanglubang mi#rotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan en+im signal, sehingga en+im yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi. endeteksian interaksi inte raksi anta antara ra anti antibodi bodi deng dengan an anti antigen gen terse tersebut but selan selanjutny jutnyaa dapa dapatt dihi dihitung tung deng dengan an mengg menggunak unakan an kolorimetri, #hemilumines#ent, atau fluores#ent endpoint. *-ISA dire#t memiliki beberapa kelemahan, antara lain ; •
Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan en+im.
•
enautan en+im signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
•
8idak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan en+im &label' dari antibodi pada per#obaan yang berbeda.
•
Amplifikasi signal hanya sedikit.
•
-arutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk uji *-ISA dire#t. Sedangkan kelebihan dari *-ISA dire#t antara lain ;
•
etodologi yang #epat karena hanya menggunakan $ jenis antibody.
•
(emungkinan terjadinya kegagalan dalam uji *-ISA akibat reaksi silang dengan antibody lain &antibody sekunder' dapat diminimalisasi.
(. 2. ELISA In%ire)t 8eknik *-ISA indire#t ini pada dasarnya juga merupakan teknik *-ISA yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik *-ISA indire#t yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibody. *-ISA indire#t menggunakan suatu antigen spesifik &monoklonal' serta antibody sekunder spesifik tertaut en+im signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji. ada *-ISA indire#t, pertama mo#rotiter diisi dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapal menempel pada bagian dinding lubang mi#rotiter. Selanjutnya mi#rotiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang mi#rotiter. (emudian larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang lubnag mi#rotiter, sehingga terjadi terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan. Selanjutnya mi#rotiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. -alu ke dalam lubang mi#rotiter dimasukkan larutan yang berisi antibody sekunder spesifik tertaut en+im signal, sehingga pada lubang mi#rotiter tersebut terjadi interaksi antara antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder spesifik tertaut en+im signal. Selanjutnya mi#rotiter dibilas lagi untuk membuang antibody sekunder tertaut en+im signal yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. (emudian pada tahap akhir *-ISA indire#t, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan en+im signal, lalu en+im yag tertaut dengan antibody sekunder speifik yang telah berinteraksi dengan antibody yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. *-ISA indire#t memiliki beberapa kelemahan, antara lain ; •
embutuhkan waktu pengujian yang relati1e lebih lama daripada *-ISA dire#t karena *-ISA indire#t membutuhkan kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder tertaut en+im signal, sedangkan pada *-ISA dire#t hanya membutuhkan $ kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody spesifik tertaut en+im signal. Sedangkan kelebihan dari *-ISA indire#t antara lain ;
•
8erdapat berbagai ma#am 1ariasi antibody sekunder yang terjual se#ar komersial di pasar.
•
Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan &target' tidak terpengaruh oleh penautan en+im signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda.
•
8ingkat sensiti1itas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.
(. ". ELISA San%+i)h 8eknik *-ISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut en+im signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. ada dasarnya, prinsip kerja dari *-ISA sandwi#h mirip dengan *-ISA dire#t, hanya saja pada *-ISA sandwi#h, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. 2amun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut en+im signal, maka teknik *-ISA sandwi#h ini #enderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal sisi antigeni# &sisi interaksi dengan antibodi' atau antigen yang bersifat multi1alent seperti polisakarida atau protein. ada *-ISA sandwi#h, antibody primer seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi. Dalam pengaplikasiannya, *-ISA sandwi#h lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multi1alent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan *-ISA sandwi#h memiliki tingkat sensiti1itas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody. ada *-ISA sandwi#h, pertama mi#rotiter diisi dengan larutan yang mengandung antibody penangkap, sehingga antibody penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang mi#rotiter. Selanjutnya mi#rotiter dibilas untuk membuang antibody penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang mi#rotiter. (emudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubanglubang mi#rotiter, sehingga terjadi interaksi antara antibody penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, mi#rotiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak bereaksi dengan antigen penangkap. -alu, kedalam lubang mi#rotiter dimasukkan larutan yang berisi antibody dete#tor sehingga pada lubang mi#rotiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody dete#tor. Selanjutnya mi#rotiter dibilas lagi untuk membuang antibody dete#tor yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. (emudian pada tahap akhir *-ISA indire#t, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan en+im signal, lalu en+im yang tertaut pada antibody dete#tor yang telh berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Dalam *-ISA sandwi#h, terdapat beberapa faktor yng mempengaruhi tingkat sensiti1itas dari hasil pengujian, antara lain ; •
)anyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dindingdinding mi#rotiter.
•
A1initas dari antibody penangkap dan antibody dete#tor terhadap antigen sebenarnya, teknik *-ISA sandwi#h ini merupakan pengembangan dari teknik *-ISA terdahulu, yaitu *-ISA dire#t. (elebihan teknik *-ISA sandwi#h ini pada dasarnya berada pada tingkat sensiti1itasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody dete#tor. 2amun demikian, teknik *-ISA sandwi#h ini juga memiliki
kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multi1alent serta sulitnya men#ari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigeni# yang berbeda &epitopnya harus berbeda'.
(. &. ELISA Bi,tin Sterta-i%in /enis ELISA M,%ern0 ada perkembangan selanjutnya, teknik *-ISA sandwi#h ini juga dikembangkan untuk mendeteksi antibody dengan tingkat sensiti1itas relatif lebih tinggi. 8eknik ini dikenal sebagai teknik *-ISA penangkap antibody, dimana prinsip kerjanya sama dengan *-ISA sandwi#h, hanya saja yang digunakan dalam teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen dete#tor &antigen bertaut en+im signal, bersifat opsional apabila antibody yang diinginkan tidak bertaut dengan en+im signal'. @ontoh dari aplikasi teknik ini adalah teknik *-ISA untuk mendeteksi 1itamin biotin yang bertaut dengan suatu antibody a1idin dengan mengubah antibody a1idin menjadi antibody strepta1idin, dimana satu molekul strepta1idin dapat mengikat empat molekul biotin &pengembangan dari *-ISA indire#t', sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat interaksi antara biotin dengan en+im yang menjadi semakin banyak.
(. (. ELISA #,metiti 8eknik *-ISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik *-ISA terdahulu.rinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu #ompetitor ke dalam lubang mikrotiter.8eknik *-ISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau antibody. ada pendeteksian antigen, pertama mikrotiter diisi antibody spesifik yang dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik bertaut en+im signal, sehingga antibody spesifiktersebut dapat menempel pada bagian dindingdinding lubangmikrotiter. -alu larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan en+im signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubanglubang mikrotiter sehingga terjadi kompetisi antaraantigen spesifik bertaut en+im signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antibody spesifik yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antigen spesifik tertaut en+im signal atau antigen yang tidak berinteraksi dengan antibody spesifik. -alu kedalam lubanglubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan en+im signal yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga en+im yang tertaut dengan antigen yang telah berinteraksi dengan antibody spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. ada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signak yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen spesifik tertaut en+im signal dan berinteraksi dengan antibody spesifik. Sedangkan pada pendeteksian antibody, pertama mikrotiter diisi antigen spesifik yang dapat berinteraksi dengan anti bodi yang diinginkan maupun antibody spesifik tertaut en+im signal, sehingga
antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dindingdinding mikrotiter, kemudian mikrotiter dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dindingdinding mikrotiter. -alu larutan yang mengandung antibody spesifik yang telah ditautkan dengan en+im signal dan larutan sampel yang mengandung antibody yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubanglubang mikrotiter, sehingga terjadi kompetisi antara antibody spesifik tertaut en+im signal dengan antibody yang diinginkan untuk dapatberinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas mikrotiter untuk membuang antibody spesifik tertaut en+im signal atau antibody yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. -alu, kedalam lubanglubang mikrotiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan en+im signal yang tertaut pada antibody spesifik, sehingga en+im yang tertaut dengan antibody yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. ada proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang berarti antibody yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antibody spesifik tertaut en+im signal dan berinteraksi dengan antigen spesifik. (elebihan dari teknik *-ISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensiti1itas tinggi akibat sifat spesitifitas dari antibody dan antigen.
(. . ELISA Multile3 8eknik *-ISA merupakan pengembangan teknik *-ISA yang ditujukan untuk pengujian se#ara simultan,sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik *-ISA terdahulu.
. 4,nt,h Langkah #erja !eknik ELISA )erikut ini adalah #ontoh langkah kerja beberapa ma#am teknik *-ISA, yaitu; Pen%eteksian anti$,%5 %engan ELISA in%ire)t6
$.
elapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 4%7% menit.
.
embilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
4.
elapisi sisisisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik &seperti larutan susu bubuk'
5.
embilas protein yang tidak melekat.
6.
enambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan membiarkan antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen.
7.
embilas antibody yang tidak terikat.
:.
enambahkan antiIg yang akan berikatan pada daerah # pada antibody yang spesifik &sebagai #ontoh, antirantai gamma manusia yang berikatan dengan Ig0 manusia'. Daerah # pada antiIg akan berikatan se#ara ko1alen dengan en+im.
!.
embilas kompleks antibodyen+im yang tidak terikat.
9.
enambahkan substrat #hromogeni#; substrat yang tidak berwarna yang terikat ke en+im akan dikon1ersi menjadi produk.
$%.
Inkubasi sampai mun#ul warna, dan
$$.
"kur dengan spe#trometer. ?ka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar kadar antibody spesifik dalam sampel. Pen%eteksian antigen %engan ELISA san%+i)h6
$.
elapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 4%7% menit.
.
embilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer
4.
elapisi sisisisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik &seperti larutan susu bubuk'
5.
embilas protein yang tidak melekat.
6.
enambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
7.
embilas antigen yang tidak terikat.
:.
enambahkan antibody yang telah terlabeli dengan en+im dan bersifat spesifik untuk epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwi#h.
!.
embilas antibodyen+im yang tidak terikat.
9.
enambahkan substrat #hromogeni#; substrat yang tidak berwarna yang terikat ke en+im akan dikon1ersi menjadi produk.
$%. Inkubasi sampai mun#ul warna. $$. "kur dengan spektrofotometer. ?ika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin besar kadarantigen spesifi dalam sampel.
7. Alikasi !eknik ELISA )erikut ini adalah beberapa ontoh aplikasi teknik *-ISA, antara lain; a.
b.
emeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi 1irus; •
HIV$ dan HIV &keberadaan antibody antiHIV'
•
Hepatitis @ &presen#e of antibodies'
•
Hepatitis ) &test untuk keberadaan antibody dan antigen 1irus'
•
H8-V$ dan &keberadaan entibodi'
engukuran le1el hormone •
h@0 &sebagai tes kehamilan'
#.
•
-H & menentukan waktu o1ulasi'
•
8SH, 84dan 85 &untuk fungsi thyroid'
endeteksian Infeksi •
Agen penularan se#ara seksual, HIV, Syphilis dan @hlamydia
•
Hepatitis ) dan @
•
8oBoplasma 0ondii
d. endeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah. e. endeteksian keberadaan +at obatobatab terlarabg, seperti •
@o#ain
•
Cpium
•
9tetrahydro#annabiol, #ampuran aktif pada marijuana.
8. 4,nt,h Alikasi ELISA6 !es #ehamilan Menggunakan H,rm,n h49 ada hari kesepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sperma pada saluran Tuba fallopi,sel telur akan bergerak menuju >ahim dan melekat pada dinding >ahim tersebut. Sejak saat itulah plasenta akan mengalami perkembangan dan h@0 mulai diproduksi. Human @horioni# gonadotropin &h@0' pada dasarnya merupakan hormone glikoprotein yang diproduksi oleh sel normal trofoblat pada plasenta selama kehamilan yang dapat ditemukan dalam darah dan air seni. h@0 terdiri dari subunit polipeptida yang terikat se#ara nonko1alen dengan berat molekul total 49 kD. Subunit rantai identi# dengan subunit rantai dari h-H &human -uteini+ing Hormone', hSH &human olli#le Stimulating Hormone' dan h8SH &human 8hyreoidea Stimulating Hormone'. Subunit bertanggung jawab pada efek hormonal molekul h@0. engukuran h@0 yang sempurna dan keberadaan subunit memberi hasil yang sama pada darah dan urin, tapi tidak pada subunit . roduksi hormone h@0 akan bertambah banyak selama trimester pertama, dimana le1el h@0 yang sempurna mempunyai rentang dari %%%% mI"/ml sampai 6%%%% mI"/ml &$ ng < $6 mI"'. (eberadaan h@0 sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama keterlambatan haid, yaitu kirakira hari keenam sejak pelekatan janin pada dinding >ahim. (adar hormone tersebut akan terus menerus bertambah hingga minggu ke $5$7 kehamilan, terhitung sejak hari terakhir menstruasi. Sebagian besar ibu hamil akan mengalami penambahan kadar hormone h@0 sebanyak dua kali lipat setiap 4 hari.
eningkatan kadar hormone ini biasanya ditandai dengan mual dan pusing yang
sering dialami oleh para ibu hamil. Selanjutnya kadar h@0 akan menurun terus se#ara perlahan, dan hamper men#apai kadar normal beberapa saat setelah persalinan. engetesan dapat dilakukan pada saat wanita mengalami keterlambatan siklus haid atau kirakira : hari setalah berhubungan.Sampel yang sigunakan pada umumnya adalah urin. )iasanya dianjurkan menggunkan air seni yang keluar pertama kali setelah bangun pagi, karena pada saat tersebut konsentrasi hormone h@0 relatif tinggi. Sebenarnya uji darah pada tes kehamilan yang dilakukan di laboratorium juga memiliki prinsip kerja yang relatif
sama, yait mendekati kadar h@0. 2amun, tes darah mempunyai kelebihan berupa kemampuan untuk mendeteksi usia janin bertumbuh di dalam >ahim seorang ibu. Perkiraan #a%ar h49 %alam Darah #ehamilan !rimester ke%ua
(urang dari 6 I"/erempuan yang tidak hamil dan lakilaki
(international
units
per liter) 5! hari setelah haid terakhir
6$%% I"/-
56 minggu &$ bulan' setelah haid II
terakhir
bu
67 minggu setelah haid terakhir
hamil;
6%6%% I"/$%%$%.%%% I"/-
$5$7 minggu &5 bulan' setelah haid terakhir kehamilan trimester ketiga
erempuan pas#a menopause
$.%%%:%.%%% I"/$.%%%6%.%%% I"/(urang dari $% I"/-
(euntungan test kehamilan dengan menggunakan uji kadar hormone h@0 antara lain; •
Analisa yang hemat dan efektif dengan kualitas tinggi dan harganya memadai.
•
*fisien dan fleksibel; sampel yang berbeda dapat dianalisa se#ara stimulant dengan jumlah #ekungan uji yang fleksibel.
•
Spesifik; sepasang antibody mempunyai selekti1itas tinggi se#ara spesifik berikatan dengan h@0.
•
rosedur yang sederhana. Dalam pengaplikasian teknik *-ISA, serum h@0 selain dapat digunakan sebagaitest kehamilan untuk mengetahui keberadaan janin dalam >ahim,juga dapat digunakan untuk berbagai uji kehamilan lainnya, antara lain; •
rediksi kehamilan yang multiple/ lebih dari $.
•
Diagnosis kehamilan yang abnormal.
•
enentuan fase kehamilan/ masa kehamilan.
•
Diagnosis diferensial pada infertilitas/ ketidaksuburan pada wanita atau pria.
•
In1ertigasi lanjut setelah terapi untuk tumor trofoblastik.
Alat tes h@0 yang menggunakan teknik *-ISA tersedia dalam bentuk di pasaran, yaitu; •
)erupa alat yang digunakan dengan #ara memaparkannya pada aliran urin saat pertama berkemih di pagi hari selama beberapa saat. ?enis alat ini sangat umum digunakan, karena dijual bebas di apotek, dan penggunaannya mudah. )erikutini adalah #ara kerjanya;
$.
ada saat alat tes mulai bekerja, akan mun#ul garis pada jedela berbentuk lingkaran &?endela #ontrol'.Dimana garis tersebut merupakan garis konttrol yang menunjukkan bahwa tes bekerja se#ara benar.
.
?endela berbentuk persegi akan menunjukkan hasil tes. Apabila garis mun#ul pada jendela berbentuk persegi &jendela hasil' maka alat tes telah mendeteksi adanya hormone h@0 dan mununjukkan adanya kehamilan.
Hasil negatif; un#ulnya satu garis pada jendela konttrol &berbentuk lingkaran' menandakan bahwa anda
tidak hamil dan tes telah dilakukan dengan benar. Hasil positif; un#ul garis pada jendela #ontrol &berbentuk lingkaran' dan jendela hasil &berbentuk
persegi' menandakan anda hamil Hasil 8idak Valid; Apabila garis pada jendela #ontrol tidak mun#ul berarti tes tidak dilakukan dengan benar. •
)erupa alat digunakan dengan #ara membubuhi beberapa tetes serum pada mikrotiter. )erikut ini adalah #ara kerjanya;
$.
engandalkan antibody h@0 yang terimbolisasi pada media padat yang berikatan dengan h@0 yang bebas dari sampel &urin'
.
Antibodi kelin#i anti h@0 berkonjungsi dengan horseladish peroBidase &H>' sebagai larutan konjugasi antibodyen+im.
4.
Sampel tes dibiarkan untuk bereaksi simultan dengan antibody, menghasilkan h@0 antara fase padat denga antibodyen+im.
5.
Setelah inkubasi, #ekungan dibilas untuk membilas antibodyen+im yang tidak terikat. (emudian substrat H>, 8), ditambahkan untuk menghasilkan warna biru.
6.
erkembangan warna dihentikan dengan penambahan stop solution yang akan mengubah warna kuning.
7.
(onsentrasi h@0 se#ara langsung proporsional terhadap intensitas warna yang dihasilkan dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer.
BAB III PENU!UP 1. #esimulan ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay ), tes ini mendeteksi antibodi yang dibuat tubuh terhadap irus HIV. Antibodi tersebut biasanya diproduksi mulai minggu ke !, atau bahkan setelah minggu ke "! setelah terpapar irus HIV. #erena alasan inilah maka para ahli mengan$urkan pemeriksaan ELISA dilakukan setelah minggu ke "! sesudah melakukan aktiitas seksual berisiko tinggi atau tertusuk $arum suntik yang terkontaminasi. %es ELISA dapat dilakukan dengan sampel darah ena, air liur, atau air ken&ing. Hasil positi' pada ELISA belum memastikan baha orang yang diperiksa telah terin'eksi HIV. asih diperlukan pemeriksaan lain, yaitu *estern +lot atau IA, untuk mengkon'irmasi hasil pemeriksaan ELISA ini. -adi alaupun ELISA menun$ukkan hasil positi', masih ada dua kemungkinan, orang tersebut sebenarnya tidak terin'eksi HIV atau betulbetul telah terin'eksi HIV.
BAB I PENDAHULUAN A. Latar +elakang ELISA sebagai salah satu metode u$i serologis mempunyai satu kelebihan yaitu mampu mendeteksi beberapa $enis antibodi dari " sampel serum (tergantung dari kit ELISA yang digunakan). ELISA $uga memiliki tingkat spesi'ikasi (yaitu kemampuan mendeteksi ayam yang tidak terin'eksi atau ayam yang tidak terin'eksi dinyatakan negati') yang tinggi.
Peralatan yang digunakan dalam u$i serologis melalui ELISA salah satunya ialah microreader etode u$i ini banyak digunakan untuk mendeteksi in'eksi irus (I+ atau I+/) maupun bakteri, seperti Salmonella sp. dan Pasteurella multocida. ELISA $uga merupakan metode u$i serologis yang &epat untuk mengu$i sampel dalam $umlah besar. 0amun peralatannya, seperti reader, washer dan komputer relati' mahal.
+. 1umusan asalah •
Apa de'inisi tes ELISA 2
•
Apa $enis 3 $enis tes ELISA 2
•
+agaimana mekanisme ker$a tes ELISA 2
•
+agaimana &ara ker$a tes ELISA 2
•
Apa guna dari tes ELISA 2
4. %u$uan •
engetahui pengertian u$i serologis dengan metode ELISA
•
engetahui guna dari tes ELISA
•
engetahui $enis$enis tes ELISA
•
engetahui prosedur ker$a dari tes ELISA
•
engetahui mekanisme ker$a dari tes ELISA +A+ II PE+AHASA0 A. /EI0ISI ELISA (singkatan bahasa Inggris5 Enzyme-linked immunosorbent assay ) atau 6penetapan kadar imunosorben tauten7im6 merupakan u$i serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. 8$i ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik penger$aan yang relati' sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitiitas yang &ukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun "9:"
oleh
Peter
Perlmann
dan
Ea
Engall
untuk
menganalisis
adanya
interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan en7imsebagai pelapor (reporter label ). 8mumnya ELISA dibedakan men$adi dua $enis, yaitu competitive assay yang menggunakan kon$ugat
antigen3en7im
menggunakan
dua
atau
antibodi.
kon$ugat Pada
antobodi3en7im,
ELISA non-competitive
dan non-competitive assay ,
antibodi
assay yang kedua
akan
dikon$ugasikan dengan en7im sebagai indikator. %eknik kedua ini seringkali disebut sebagai ;Sandwich; ELISA. 8$i ini dilakukan pada plate 9<well berbahan polistirena. 8ntuk melakukan teknik ;Sandi&h; ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi5 ". Well dilapisi atau ditempeli antigen. !. Sampel (antibodi) yang ingin diu$i ditambahkan. =. /itambahkan
antibodi kedua
yang dikon$ugasikan dengan en7im
tertentu seperti
peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya. >. /imasukkan substrat en7im yang dapat menimbulkan arna tertentu saat bereaksi. ?. Intensitas
arna
&uran
diukur
dengan spektro'otometer yang
disebut ELISA
reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (@/). /engan menghitung ratarata kontrol negati' yang digunakan, didapatkan nilai cut-o untuk menentukan hasil positi' negati' suatu sampel. Hasil @/ yang berada di baah nilai cut-o merupakan hasil negati', dan demikian $uga sebaliknya. 8$i ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang besar ter$adinya hasil alse positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain.!B Hasil berupa alse ne!ative dapat ter$adi apabila u$i ini dilakukan pada window period , yaitu
aktu pembentukan antibodi terhadap suatu irus baru dimulai sehingga $umlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi. =B
+. -E0IS %ES ELISA ".
Indirect ELISA %ahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah5
")
Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan &ara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kura standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diu$i.
!)
Suatu larutan pekat dari protein non-interactin! , seperti bovine serum albumin (+SA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. %ahap ini dikenal sebagai blockin! , karena protein serum memblok adsorpsi nonspesi'ik dari protein lain ke plate.
=)
Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam bu''er yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. #arena imobilisasi antigen dalam tahap ini ter$adi karena adsorpsi nonspesi'ik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
>)
Plate di&u&i, dan antibodi pendeteksi yang spesi'ik untuk antigen yang diu$i dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
?) Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkon$ugasi men$adi en7im dengan substrat spesi'ik. %ahap ini bisa dileati $ika antibodi pendeteksi berkon$ugasi dengan en7im. <)
Plate di&u&i untuk membuang kelebihan kon$ugat en7imantibodi yang tidak terikat.
:)
/imasukkan substrat yang akan diubah oleh en7im untuk mendapatkan sinyal kromogenikC 'luorogenikC elektrokimia.
D)
Hasil dikuanti'ikasi dengan spektro'otometer, spektro'luorometer atau alat optikC elektrokimia lainnya. En7im bertindak sebagai ampli'ier, bahkan $ika hanya sedikit antibodi terikat en7im yang tetap terikat, molekul en7im akan memproduksi berbagai molekul sinyal. #erugian utama dari metodeindirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya nonspesi'ik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang ke&il dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.
!. Sandwich ELISA
%ahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut5 ". /isiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkapF !. Semua non spesi'ik bindin! sites pada permukaan diblokir =. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate >. Plate di&u&i untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat ?. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan se&ara spesi'ik dengan antigen <. Antibodi sekunder yang berikatan dengan en7im dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer :. Plate di&u&i, sehingga kon$ugat antibodien7im yang tidak terikat dapat dibuang D. /itambahkan reagen yang dapat diubah oleh en7im men$adi sinyal berarnaC ber'luoresensiC elektrokimia 9. /iukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen #euntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya mengu$i sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat se&ara selekti' antigen yang dikehendaki. %anpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua $enis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap se&ara kompetiti' oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.
=. ELISA kompetiti' %ahapan penger$aan ELISA kompetiti' berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu5 ". Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya !. #omplek antigenantibodi ini selan$utnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen =. Plate di&u&i, sehingga kelebihan antibodi ter&u&i (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi >. /itambahkan antibodi sekunder yang spesi'ik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan en7im ?. Substrat ditambahkan, en7im akan mengubah substrat men$adi sinyal kromogenikC 'luoresensi. /alam ELISA kompetiti', semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal,semakin lemah sinyal yang dihasilkan.
4. E#A0ISE #E1-A
ELISA (singkatan bahasa Inggris5 Enzyme-linked immunosorbent assay ) atau 6penetapan kadar
imunosorben tauten7im6 merupakan u$i serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. 8$i ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik penger$aan yang relati' sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitiitas yang &ukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun "9:" oleh Peter Perlmann dan Ea Engall untuk menganalisis adanya interaksi antigen denganantibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan en7im sebagai pelapor (reporter label )."B 8mumnya ELISA dibedakan men$adi dua $enis, yaitu competitive assay yang menggunakan kon$ugat antigen3en7im atau kon$ugat antobodi3en7im, dan non-competitive assay yang menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay , antibodi kedua akan dikon$ugasikan dengan en7im sebagai indikator. %eknik kedua ini seringkali disebut sebagai ;Sandwich; ELISA. 8$i ini dilakukan pada plate 9<well berbahan polistirena. 8ntuk melakukan teknik ;Sandi&h; ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi5 ". Well dilapisi atau ditempeli antigen. !. Sampel (antibodi) yang ingin diu$i ditambahkan.
=. /itambahkan antibodi kedua yang dikon$ugasikan dengan en7im tertentu seperti peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel sebelumnya. >. /imasukkan substrat en7im yang dapat menimbulkan arna tertentu saat bereaksi. ?. Intensitas arna &uran diukur dengan spektro'otometer yang disebut ELISA reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (@/). /engan menghitung ratarata kontrol negati' yang digunakan, didapatkan nilai cut-o untuk menentukan hasil positi' negati' suatu sampel. Hasil @/ yang berada di baah nilai cut-o merupakan hasil negati', dan demikian $uga sebaliknya. 8$i ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang besar ter$adinya hasil alse positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain.!B Hasil berupa alse ne!ative dapat ter$adi apabila u$i ini dilakukan pada window period , yaitu aktu pembentukan antibodi terhadap suatu irus baru dimulai sehingga $umlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.
En:5me*Linke% Immune*S,r$ent Assa5 atau ELISA atau yang sering sebut uji kekebalan en+imatis. *-ISA relatif murah dan lebih aman dibanding >IA &radio Immuno Assay' yang menggunakan bahan radiokatif dan dapat dikerjakan di laboratorium ke#il tanpa alat peme#ah radioaktif gamma. etode *-ISA &en+ymlinked immunosorbent assay' metode dalam penelitian dengan )erdasarkan ; Ikatan spesifik antara antigen &Ag' antibody&Ab'.
*-ISA dipakai untuk pengujian semua antigen, hapten atau antibody. aling banyak dipakai di laboratorium klinis, misalnya uji immunoglobulin 0 dan *, hormone seperti insulin, esterogen dan gonadotrofin.
Anti$,%5 5aitu Antibodi disekresi oleh Sel lasma &Sel )', )iasanya digunakan monoklonal Antibody karena lebih spesifik untuk epitop tertentu daripada poli#lonal antibodi. Dapat dibeli terpisah atau dalam paket *-ISA (it, biasanya diproduksi dengan #ara induksi respon imun humoral pada hewan #oba & rat, mouse' dengan #ara injeksi Antigen berulang, dilakukan ekstraksi sel dan purifikasi Ab. Dapat juga diekstraksi dari manusia yang telah diimunisasi dengan Ag tertentu.
8erdapat 8eknik etode *-ISA !eknik #ualitati adalah )erdasarkan bahwa tiap antibodi berikatan pada antigen yang spesifik. !eknik kuantitati berdasarkan jumlah ikatan antigenantibodi yang ditentukan dengan nilai absorbansi. 8eknik ini menggabungkan spesifitas antibody dengan kepekaan uji en+ymatis dengan spektrofotometer biasa atau antigen dilekatkan pada en+yme yang mudah ditera.
1. 2. 3. 4.
Be$eraa t5e ELISA , sebagai berikut ; Dire)t ELISA , biasanya digunakan dengan kompetisi dan Inhibisi *-ISA. Digunakan untuk deteksi antigen. In%ire)t ELISA, antigen terikat pada plate. Digunakan untuk deteksi antibody. San%+i)h ELISA , antibodi terikat pada late. Digunakan untuk deteksi antigen. 4ature ELISA , antihuman antibodi terikat pada late. Digunakan untuk deteksi antibody.
*-ISA dapat dipakai untuk pengujian antigen lewat #ara persaingan &kompetitip' atau #ara antibody ganda &double antibody'. @ara ersaingan. @ampuran dari antigen yang dilekatkan pada en+im yang diketahui jumlahnya dengan antigen tanpa en+im yang belum diketahui jumlahnya, direaksikan dengan antibody yang dilekatkan pada permukaan padat. Setelah reaksi selesai membentuk kompleks lalu di#u#i, kemudian ditambahkan substrat yang #o#ok untuk en+im dan akti1itas en+im diukur. Sejumlah antigen yang belum diketahui jenisnya direaksikan dengan antibody tertentu yang dilekatkan pada permukaan padat, di#u#i dan direaksikan dengan antibody beren+im. Setelah di#u#i lagi, ditambahkan substrat en+im khusus. Akti1itas en+im yang diuji dengan #ara biasa menunjukkan jumlah antigen yang ada. Antiserum yang di#urigai, direaksikan dengan antigen khusus yang dilekatkan pada bahan padat,kemudian di#u#i. Selanjutnya direaksikan dengan antibody yang bersifat antiimmunoglobulin beren+im yang akan melekat pada antibody yang tadi tererap dari anti serum mulamula. (ompleks yang terjadi di#u#i, ditambahkan substrat, akti1itas en+im sesuai jumlah antibody pada serum mulamula.
1.
2. 3. 4.
)eberapa bahan yang digunakan dalam teknik *-ISA, yaitu ; )ahan padat yang dipakai dalam *-ISA termasuk selulosa, deBtran berangkai silang, polia#rilamide, polistiren dan polipropilen. )entuknya dapat berupa butiran, lempeng atau tabung. Antigen dapat dilekatkan se#ara adsorpsi pasif atau diikat se#ara ko1alen dengan sianobenbromida. *n+im dipilih yang akti1itasnya tinggi misalnya fosfatse alkalis dan peroksidase. )ahan pengabung yang sering dipakai adalah glutaraldehide. Substrat paling baik jika stabil, aman dan murah. Substrat tidak berwarna yang menjadi berwarna karena perubahan oleh en+im. isalnya ; pnitrofenilfosfat berubah menjadi p
• • • • • • • •
• • • •
nitrofenol berwarna kuning oleh en+im fosfatase alkalis. Substrat lain, misalnya diamino ben+idine,6aminosalisilat, Cfenilendiamin dipakai untuk en+im peroksidase. Material %alam met,%e ELISA Antigen ono#lonal Ab i#roplate )lo#king )uffer Serum sample @onjugate &se#ondary Ab E *n+yme' Subtrate Stop Sol. Alat 5ang %igunakan %alam met,%e ELISA 97Fells i#roplate i#ropipettes ulti#hannel pipette *lisa test kit arameters utama ; Solid phase &mi#roplate' $ rea#tant Separation bound G free reagent @olor de1elopment en+yme
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Serologi adalah ilmu yang mempelajari prosedurprosedur diagnostik dan eksperimental yang berhubungan dengan imunologi dan menyangkut reaksireaksi serum.8estes serologi ini digunakan untuk Identifikasi mikroorganisme mikroorganisme, dan menunjukan antibodi didalam serum dari hospes pada penyakitpenyakit tertentu dimana penyebab penyakit tidak dapat diisolasi, penemuan spesifik antibodi adalah penting sekali untuk membantu diagnosa. Salah satu teknik serologi yang bersifat lebih sensitif dibandingkan dua metode serologi yang diuraikan terlebih dahulu. *n+yme linked immunisorbent assay, disingkat *-ISA. etode pengujian ini mulai berkembang sejak tahun $9:$. *-ISA merupakan suatu metode pengujian serologi yang melekatkan kompleks ikatan antara antibodi dengan antigen di dalam sumuran plate *-ISA yang terbuat dari bahan plastik &Dijkstra et al. $99!'. *-ISA telah banyak mengalami peubahan sejak pertama kali teknik ini dipublikasikan #iri utama teknik ini adalah dipakai indikator en+im untuk reaksi imunilogi. *-ISA telah berkembang sampai pada tingkatan yang sangat sulit untuk membuat generasi tentang kemampuan kinerja berbagai konfigrasi. (onfigurasi yang paling umum mengunakan substrat padat. *-ISA singkatan dari *n+im-inked Immunosorbent Assay.J Ini adalah tes immuno#hemi#al #epat yang melibatkan sebuah en+im &protein yang mengkatalisis suatu reaksi biokimia'. ?uga melibatkan antibodi atau antigen &kekebalan molekul'. 8es *-ISA digunakan untuk mendeteksi +at yang memiliki sifat antigenik, terutama protein
&sebagai lawan dari molekul ke#il dan ion seperti glukosa dan kalium. )eberapa di antaranya adalah hormon, bakteri antigen dan antibodi.
Diposkan oleh Ka@k di %9.49 8idak ada komentar; -ink ke posting ini -abel; *-ISA
Selasa, !< ei !GG9
VARIASI SOMAKLONAL +A+ I PE0/AH8L8A0 A. Latar +elakang Penyediaan bibit dalam pengembangan suatu tanaman atau dalam suatu proses produksi merupakan salah satu aspek yang sangat penting. Proses prosuksi skala besar seperti perkebunan akan memerlukan bibit dalam $umlah besar, bibit dari arietas unggul, seragam, bebasdari hama dan penyakit, serta penyediannya kontinyu. +ibit dari suatu arietas unggul yang dihasilkan pemulia tanaman $umlahnya sangat terbatas, sedangkan bibit yang dibutuhkan sangat banyak. +eberapa tanaman holtikultura, tanaman pangan, maupun kehutanan banyak yang sulit diperbanyak dengan &ara konensional baik se&ara egetatie maupun generatie. Selain itu bila diperbanyak dengan &ara &angkok, stek, atau penempelan mata tunas memerlukan bahan tanaman yang sangat b esar untuk mendapatkan bibit dalam $umlah besar. /engan berkembangnya teknik kultur $aringan, kendala dalam multiplikasi untuk beberapa $enis tanaman dapat diatasi. %eknik kultur $aringan ini pada mulanya ditu$ukan untuk membuktikan kebenaran toeri totipotensi, yang selan$utnya berkembang untuk penelitian dibidang 'isiologi tanaman, dan biokimia. Pada hakekatnya teori totipotensi ini tidak salah tetapi pada kenyataannya telah dapat dibuktikan adanya penyimpangan dari pembelahan sel, dampak yang diperoleh dari ke$adian tersebut adalah ter$adinya ariasi kromosom didalam $enis tanaman yang sama, $umlah khromosom yang berkurang, somati& yang menyusut dan subtitusi khromosom. Akibat dari ke$adianke$adian inilah yang menyebabkan ter$adinya ariasi somaklonal. +. %u$uan Adapun tu$uan dari pembuatan tulisan ini adalah 5 ". enambah ilmu pengetahuan tentang bioteknologi tanaman. !. emahami lebih dalam tentang apa itu Variasi Somaklonal. =. emenuhi tugas dalam mata kuliah bioteknologi tanaman.
+A+ II PE+AHASA0 A. Pengertian #eragaman somaklonal adalah keragaman genetik yang dihasilkan melalui kultur $aringan. #eragaman somaklonal berasal dari keragaman geneti& eksplan dan keragaman geneti& yang ter$adi dalam kultur $aringan, keragaman geneti& pada eksplan disebabkan adanya sel bermutasi, #eragaman geneti& yang ter$adi didalam kultur $aringan disebabkan oleh penggandaan kromosom, perubahan struktur kromosom, perubahan gen maupun perubahan sitoplasma. a. %eknik endapatkan Somaklonal Ada tiga &ara untuk mendapatkan tanaman somaklonal yaitu 5 (") 1egenerasi langsung, (!) #ultur sel tunggal, (=) #ultur protoplasma. ". 1egenerasi langsung /engan regenerasi langsung dimaksudkan baha dari eksplan langsung diregenerasi tunas adenti' dan embrio somati& tanpa melalui sel tunggal. "." 4ara regenerasi langsung
Eksplant %unas adenti' %anaman atau embrio Eksplant #alus %unas adenti' %anaman atau embrio Pada &ara ini pemilihan eksplan dan media memegang peranan penting. Pemilihan eksplan untuk mendapat keragaman geneti& $uga penting didalam proses mor'ogenesis, media terutama untuk menghasilkan tunas atau embrio somati&. Pada tanaman kentang eksplan yang berasal dari daun lebih banyak memberikan keragaman geneti& dari bagian e ksplan lainnya. #eragaman somaklonal dapat ditingkatkan dengan pemberian mutagen pada eksplan, baik se&ara 'isik maupun se&ara kimia. Pemberian mutagen pada eksplan akan menghasilkan mutan utuh ( solid mutan ) sedangkan pemberian mutagen pada kalus akan menghasilkan mutan parsial ( &himeri& mutan ), pemuliaan in itro dengan &ara regenerasi langsung relatie lebih mudah dibandingkan &ara in itro lainnya. 4ara ini dapat dilakukan pada berbagai $enis bunga seperti 5 maar, garbera, dianthus, anthurium, petunia, dll. !. #ultur sel tungal Prosedur seleksi melalui kultur sel dimulai dari penanaman dan pemilihan eksplan, induksi kalus, isolasi sel, penebaran sel, induksi tunas ad enti', dan pemindahan kelapangan, genotip dan umur tanaman untuk di$adikan eksplan sangat menentukan proses selan$utnya ( pembentukan kalus dari regenerasi tunas ). Selain 'a&tor eksplan, 'a&tor media sangat menentukan keberhasilan organogenesis. ulai dari penanaman eksplan sampai perakaran tunas terdapat e nam ma&am media, yang terutama berbeda didalam komposisi JP% . @rganogenesis tidak selalu membentuk tunas adenti' atau embrio somati&, tetapi kadangkadang $uga akar, pada umumnya $ika terbentuk akar sukar untuk berorganogenesis men$adi tunas kembali. Pada kultur sel tunggal, sel yang ditebar itu harus selsel yang mempunyai iabilitas tinggi dan berkemampuan untuk membelah, karena itu sebelum sel ditebar perlu diu$i dengan iabilitas sel (pearnaan dengan /A), seleksi sel dan perhitungan $umlah sel per ml, selsel itu bisa ditebar dengan kepadatan >< K "GG.GGG selCml, menyaring sel adalah untuk memisahkan selsel yang besar yang biasa mempunyai akuola yang besar dan sitoplasma yang sedikit, sel yang demikian tidak mampu untuk membelah membentuk agregat sel. Hanya selsel dengan sitoplasma yang penuh (ukuran sedang) yang mampu membelah dan membentuk agregat dan kalus dan selan$utnya membentuk tunas adenti'. %ekanan seleksi sudah dapat dilakukan mulai dari penebaran sel. %ekanan seleksi pada tingkat sel ini hanya berlaku pada si'atsi'at ketahanan terhadap penyakit, kadar garam yang tinggi dan si'atGsi'at lain yang sudah diekspresikan pada tingkat sel. Seleksi ini sebaiknya dilakukan pada >, karena kalus pada tingkat itu pada umumnnya berasal dari satu sel, seleksi pada tingkat sel perlu diperlakukan lagi pada aktu kalus itu telah men$adi tanaman untuk meyakinkan baha si'at yang ditampilkan pada tingkat sel $uga ditampilkan pada tingkat tanaman. Seleksi dengan mempergunakan kultur sel ini adalah &ara yang diinginkan pada seleksi in itro tanaman bunga. #ultur sel mirip dengan kultur protoplasma tapi $auh lebih sederhana dari kultur protoplasma.
=. #ultur protoplasma #ultur protoplasma merupakan salah satu &ara untuk memperbaiki ma$or gen atau poligen yang de'ekti' pada kultiar yang ada. Si'atsi'at dari ma$or gen itu berupa ketahanan terhadap penyakit, toleransi terhadap stress dan si'atsi'at mor'ologi tertentu. 4ara ini dilakukan untuk memperbaiki si'at beberapa $enis tanaman, terutama pada tanaman kentang, petunia, dan tomat, Si'atsi'at yang diperbaiki pada tanaman kentang berupa ketahanan terhadap penyakit, toleransi terhadap stress, bentuk dan arna kulit umbi serta si'at mor'ologis lainnya. Protoplas adalah sel yang telah dihilangkan dinding sel se&ara ensimatik atau sel telan$ang. Protoplas dipergunakan untuk memperbaiki tanaman melalui kultur protoplas, 'usi protoplas dan trans'ormasi, didalam kultur protoplas yang penting baha dapat diisolasi protoplas yang utuh, protoplas tersebut harus dapat membentuk dinding sel, kemudian membelah membentuk kalus dan meregenerasi tanaman. 8rutan didalam ker$a protoplas adalah 5 ". Penyiapan eksplan !. Isolasi dan puri'ikasi protoplas =. Penebaran protoplas >. 1ebenerasi protoplas kalus ?. 1egenerasi planlet -enis eksplan yang dipergunakan untuk isolasi protoplas dapat berasal dari kultur suspensi, meso'il daun,
kotiledon, hipokotil, tangkai daun, daun bunga, dan serbuk sari. -enis eksplan ini dapat berasal dari in io atau in itro. Pada u mumnya dipergunakan eksplan in itro dari kultur suspense dan kultur tunas. #euntungan dari eksplan in itro adalah 5 ". Eksplan tersebut steril. !. Eksplan in itro dikulturkan dan diinkubasikan pada keadaan optimum untuk menghasilkan protoplas serta proses organogenesis selan$utnya. Isolasi protoplas dan puri'ikasi terdiri dari pelarutan dinding sel se&ara ensimatik dan pemisahan kotoranlain dari protoplasma dengan &ara sentri'us. Sel tanaman terdiri dari selulose dan pe&tin sehingga en7im yang dipakai untuk menghilangkan dinding sel adalah selulose dan pektinase. Larutan yang dipergunakan untuk isolasi selain en7im, $uga terdapat unsure hara dan osmotikum. 8nsur hara untuk mempertahankan iabilitas protoplasma dan osmotikum untuk men&egah pe&ahnya protoplasma. @smotikum umumnya terdiri dari gula (sukrosa, glu&ose dan gula al&ohol). Sesudah isolasi protoplasma dilakukan penge&ekan iabilitas, perhitungan protoplasma dan pengen&eran protoplasma. Viabilitas dilakukan denan &ara mearnai protoplas dengan /A dan di teliti dibaah mikroskop. Perhitungan protoplas dilakukan dengan mempergunakan haemo&ymeter, perlu dilakukan pengen&eran sebab sesudah isolasi itu kepadatan protoplas berkisar antara "GG.GGG dan "GGG.GGG protoplasma. %iga sampai tu$uh hari dalam media tebar, protoplas telah membelah dan membentuk agreat maka selan$utnya akan dipindah se&ara berurutan ke media pkalus, media regenerasi tunas. edia dasar yang dipergunakan untuk media kalus dan tunas adalah S atau senyaa organik S ditambah senyaa organi& dari 0its&h dan 0its&h. #adar su&rose dan JP% berupa 'a&tor penentu didalam proses organogenesis. #adar su&rose yang lebih tinggi dari ! kadangkadang menghambat pertumbuhan pkalus, regenerasi pkalus men$adi tunas sering membutuhkan sitokinin khusus seperti 7eatin dan tidak dapat digantikan oleh +AP atai kinetin. Intensitas &ahaya tinggi (lebih dari >GGG luks) dan suhu sekitar !> dera$at &el&ius merupakan lingkungan inkubasi yang optimum untuk regenerasi pkalus men$adi tunas. 8ntuk regenerasi protoplasma men$adi tunas membutuhkan aktu "!"< minggu tergantung dari $enis tanaman dan genito'nya. %anaman regenerasi dari protoplasma menun$ukkan keragaman geneti& yang &ukup tinggi. 8mumnya keragaman ini dikarenakan perubahan kromosom dan p erubahan gen. #eragaman ini lebih tinggi pada tanaman yang berasal dari protoplasma kultur suspense dari pada tanaman yang berasal dari protoplasma meso'il daun. Protoplasma $uga dapat dipergunakan untuk memproduksi tanaman dengan ploidi yang lebih tinggi dari ploidi asal protoplasma.
+A+ IV PE08%8P A. SIP8LA0 #eragaman somaklonal adalah keragaman genetik yang dihasilkan melalui kultur $aringan. #eragaman somaklonal berasal dari keragaman geneti& eksplan dan keragaman geneti& yang ter$adi dalam kultur $aringan, keragaman geneti& pada eksplan disebabkan adanya sel bermutasi, #eragaman geneti& yang ter$adi didalam kultur $aringan disebabkan oleh penggandaan kromosom. #eragaman somaklonal dapat ditimbulkan dengan pemberian mutagen baik 'isik maupun kimia, mutagen yang diberikan pada kalus akan membentuk mutasi parsial atau mutan &himeri& sedangkan mutagen yang diberikan pada eksplan akan membentuk mutasi utuh atau solid mutan. Ada tiga &ara untuk mendapatkan tanaman somaklonal yaitu 5 ". 1egenerasi langsung !. #ultur sel tunggal =. #ultur protoplasma +. SA1A0 ". Hendaknya mahasisa diberikan ulasan sedikit tentang topik yang akan dibahas.
/A%A1 P8S%A#A *attimena,Ma.dkk."99".+ioteknologi %anaman.Pusat Antar 8niersitas +ioteknologi Institut Pertanian +ogor.+ogor. e.!GGD.-urnal +iogen.Peningkatan #eragaman Menetik elalui Variasi Somaklonal
Pemeriksaan Metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ELISA (singkatan bahasa inggris: Enzyme Linked Immunosorbent Assay ‘) merupakan suatu pemeriksaan untuk menganalisis adana interaksi antigen dengan antib!di di dalam suatu sampel dengan menggunakan en"im sebagai pelap!r ( reporter label).
#et!de ELISA ang paling sering digunakan : 1.
Indirek ELISA
2.
$apture ELISA (Sand%i&h ELISA)
3.
'!mpetiti ELISA
A. Indirek ELISA Antigen dilapisi ke permukaan mikr!titer plate. Antigen dikenali antib!di ang ada dalam sampel (anti b!di primer) dan teradi ikatan . Selanutna anti b!di primer di kenali !leh anti b!di sekunder ang telah terhubung dengan en"m. Substrat bereaksi dengan en"im menghasilkan pr!duk ang ber%arna
*. $apture ELISA (Sand%i&h ELISA) $apture ELISA atau dikenal uga dengan Sand%i&h ELISA merupakan satu tes ang sensiti untuk mengukur pik!gram atau mikr!gram umlah "at (seperti h!rm!n+ sel pemberi tanda kimia+ ineksi+ antigen+ dan sit!kin) ,esain ELISA tipe ini mungkin lebih dibutuhkan dibanding ELISA direk dan indirek karena beberapa alasan. Substansi ang dianalisis mungkin terlalu en&er
untuk
mengikat lempeng mikr! pada p!listern(seperti pr!tein dalam supernatan kultur sel atau tidak mengikat baik dengan plastik(m!lekul an!rganik)
-rinsip : -late dilapisi !leh antib!di penangkap . Sampel ditambahkan+ dan beberapa antigen ang ada berikatan dengan antib!di penangkap. Antib!di pendeteksi berlabel en"im mengenali
dan
berikatan
dengan
antigen.
En"im
bereaksi
dengan
substrat
menghasilkan pr!duk ang ber%arna
Jumat, 08 Juni 2012
**>I(SAA2 *-ISA
Sejarah Sebelum
penembanan
ELISA!
satu"satunya
pili#an
untuk
melaksanakanimmunoassay adala# radioimmunoassay ! teknik menunakan radioakti$ antien atau antibodi berlabel% &alam radioimmunoassay! radioakti'itas memberikan sinyal! yan menunukkan apaka# suatu antien tertentu atau antibodi #adir dalam sampel% Radioimmunoassay pertama kali dielaskan dalam kertas ole# Rosalyn Sussman alo* dan Salomo +erson diterbitkan pada ta#un ,-./% Sebua# mikrobioloi menunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA) immunosorbent! dalam ranka untuk menembankan metode untuk deteksi 0epat antien p12 3IV dalam sampel dara#% Karena radioakti'itas menimbulkan an0aman kese#atan potensial! alternati$ yan lebi# aman itu di0ari% Sebua# alternati$ yan 0o0ok untuk radioimmunoassay akan menanti sinyal non"radioakti$ di tempat sinyal radioakti$% Ketika enzim (sepertiperoksidase ) bereaksi denan substrat yan sesuai (seperti A+4S atau 5!5 6! 7!76"tetramet#ylbenzidine )! peruba#an *arna teradi! yan diunakan sebaai sinyal% Namun! sinyal tersebut #arus dikaitkan denan keberadaan antibodi atau antien! yan menapa enzim #arus di#ubunkan denan antibodi yan sesuai% 8roses men#ubunkan se0ara independen dikembankan ole# Stratis A'rameas dan 9+ 8ier0e%
:.;
Karena itu perlu untuk men#ilankan antibodi
atau antien terikat denan men0u0i! antibodi atau antien #arus tetap ke permukaan *ada#< yaituimmunosorbent tela# #arus dipersiapkan% Sebua# teknik untuk men0apai #al ini diterbitkan ole# =ide dan >erker 8orat# pada ta#un ,-..% :?; 8ada ta#un ,-?,! 8etrus 8erlmann dan E'a En'all di @ni'ersitas Sto0k#olm di S*edia! dan Anton S0#uurs dan +auke 'an =eemen di +elanda mandiri makala# yan disintesis peneta#uan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA ELISA%
ELISA (sinkatan ba#asa InrisB Enzyme"linked immunosorbent assay)atau 6penetapan kadar imunosorben taut"enzim6 merupakan uiserolois yanumum diunakan di berbaai laboratoriumimunoloi% @i ini memiliki beberapakeunulan seperti teknik peneraan yan relati$ seder#ana! ekonomis! danmemiliki sensiti'itas yan 0ukup tini% ELISA diperkenalkan pada ta#un ,-?,ole# 8eter 8erlmann dan E'a En'all untuk menanalisis adanya interaksiantien denanantibodidi dalam suatu sampel denan menunakanenzimsebaai pelapor (reporter label) (LeCuin! 1//7)% 4 ek ni k E LI SA m er up ak an t ek ni k k ua nt it at i$ y an s an a t se ns it i$ ! penunaannya sanay luas! memerlukan peralatan yan sedikit! re a en ya n diperlukan suda# tersedia dan diual se0ara komersial dan sanat muda# didapat%4es ELISA dapat diunakan untuk mendeteksi antien maupun antibodi 8emeriksaan ELISA dapat diunakan untuk mendeteksi antibodi dalam tubu#manusia maupun #e*an% 4erdapat berbaai teknik dalam pemeriksaan ELISA% Met,%e ELISA en:5m*linke% immun,s,r$ent assa50
etode dalam penelitian dengan )erdasarkan ; Ikatan spesifik antara antigen &Ag' antibody&Ab' terdiri dari ; $. 8eknik Lualitatif ; 8iap berikatan pada Ag spesifik . 8eknik Luantitatif ; ?umlah Ikatan AgAb ditentukan dengan nilai absorbansi. Ma)am sistem met,%e 5ang %igunakan %alam elisa 6 Dire#t Indire#t Sandwi#h @apture
METODE PEMERIKSAAN ELISA ELISA diperkenalkan pada tahun $9:$ oleh eter erlmann dan *1a *ng1all untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan en+im sebagai pelapor. tela# diunakan sebaai alat dianostik dalam bidan
medis! patoloi tumbu#an! dan ua berbaai bidan industri% &alam penertian seder#ana! seumla# antien yan tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan! kemudian antibodi spesi$ik di0u0ikan pada permukaan tersebut! se#ina akan berikatan denan antiennya% Antibodi ini terikat denan suatu enzim! dan pada ta#ap terak#ir! ditamba#kan substansi yan dapat diuba# ole# enzim menadi sinyal yan dapat dideteksi% &alam ELISA $luoresensi! saat 0a#aya denan panan elomban tertentu disinarkan pada
suatu sampel! kompleks antienantibodi akan ber$luoresensi se#ina umla# antien pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya $luoresensi% 8enunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi denan spesi$itas untuk antien tertentu% Sampel denan umla# antien yan tidak diketa#ui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempen mikrotiter polistirene)! baik yan non"spesi$ik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesi$ik (melalui penankapan ole# antibodi lain yan spesi$ik untuk antien yan sama! disebut Dsandwich’ ELISA)% Setela# antien diimobilisasi! antibodi pendeteksi ditamba#kan! membentuk kompleks denan antien% Antibodi pendeteksi dapat berikatan ua denan enzim! atau dapat dideteksi se0ara lansun ole# antibodi sekunder yan berikatan denan enzim melalui biokonuasi% &i antara tiap ta#ap! plate #arus di0u0i denan larutan deteren lembut untuk membuan kelebi#an protein atau antibodi yan tidak terikat% Setela# ta#ap pen0u0ian terak#ir! dalam plate ditamba#kan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yan 'isibel! yan menunukkan kuantitas antien dalam sampel% 4eknik ELISA yan lama menunakan substrat kromoenik! meskipun metode"metode terbaru menembankan substrat $luoroenik yan au# lebi# sensiti'e%
Prinsip metode ELISA mereaksikan antibodi dan antien se0ara spesi$ik! perbedaannya ada pada substrat ( zat yan diunakan untuk mendeteksi suatu #asil reaksi ) yan diunakan% 8ada ELISA! #asil reaksi akan memun0ulkan *arna yan bisa diukur denan alat yan disebut olorimetri% 8ada Fluores0en0e! #asil reaksi berupa pendaran 0a#aya yan terba0a ole# $luoresensi! sedankan pada #emilumines0en0e #asil reaksi berupa pendaran kimia*i yan terba0a ole# #emilumines0ent%
Jenis Pemeriksaan ELISA Lanka#"lanka# Gtidak lansunG ELISA menikuti mekanisme di ba*a# iniB " •
•
•
Sebua# solusi bu$$er dari antien yan akan diui untuk ditamba#kan ke setiap sumur dari lempen mikro ! di mana ia diberi *aktu untuk mematu#i plastik melalui interaksi biaya% Sebua# solusi non"protein bereaksi! seperti bo'ine serum albumin atau kasein ! ditamba#kan untuk memblokir setiap permukaan plastik di sumur yan masi# dilapisi ole# antien% Selanutnya antibodi primer ditamba#kan! yan menikat se0ara k#usus ter#adap antien lapisan tes yan baik% Antibodi primer ini ua bisa dalam serum donor akan diui untuk reakti'itas ter#adap antien%
•
•
•
Setela# itu! sebua# antibodi sekunder yan ditamba#kan! yan akan menikat antibodi primer%% Antibodi sekunder ini serin memiliki enzim yan melekat padanya! yan memiliki e$ek yan dapat diabaikan pada si$at penikatan antibodi% Sebua# substrat untuk enzim ini kemudian ditamba#kan% Serinkali! peruba#an *arna substrat ini pada reaksi denan enzim% 8eruba#an *arna menunukkan ba#*a antibodi sekunder tela# terikat antibodi primer! yan sanat menyiratkan ba#*a donor memiliki reaksi kekebalan ter#adap antien ui% 3al ini dapat membantu dalam penaturan klinis! dan dalam R H &% Semakin tini konsentrasi antibodi primer yan #adir dalam serum! semakin kuat peruba#an *arna% Serinkali spektrometer diunakan untuk memberikan nilai kuantitati$ untuk kekuatan *arna%
Enzim bertindak sebaai penuat! ba#kan ika #anya sedikit enzyme"linked tetap terikat antibodi! molekul enzim akan men#asilkan banyak molekul sinyal% &alam keterbatasan akal se#at! enzim dapat terus men#asilkan *arna tanpa batas *aktu! tetapi yan lebi# utama antibodi #adir dalam serum antibodi
donor
lebi#
sekunder
enzim
akan
menikat!
dan
*arna
lebi#
0epat
akan
berkemban%% Kelema#an utama dari ELISA tidak lansun adala# ba#*a metode imobilisasi antien non"spesi$ik! ketika serum diunakan sebaai sumber antien tes! semua protein dalam sampel bisa tetap berpean pada pelat mikro denan baik! konsentrasi beitu ke0il analit dalam serum #arus bersain denan protein serum lainnya ketika menikat ke permukaan baik% Sand*i0# atau lansun ELISA memberikan solusi untuk masala# ini! denan menunakan GmenankapG antibodi spesi$ik untuk antien tes untuk menariknya keluar dari 0ampuran molekul serum itu% ELISA dapat dialankan dalam $ormat kualitati$ atau kuantitati$% 3asil kualitati$ memberikan #asil positi$ atau neati$ seder#ana (ya atau tidak) untuk sampel% uto$$ antara positi$ dan neati$ ditentukan ole# analis dan munkin statistik% &ua atau tia kali standar de'iasi (kesala#an yan melekat dalam tes) serin diunakan untuk membedakan positi$ dari sampel neati$% &alam kuantitati$ ELISA! densitas optik (O&) dari sampel dibandinkan denan kur'a standar! yan biasanya penen0eran serial solusi dikenal"konsentrasi dari molekul taret% Sebaai 0onto#! ika sebua# sampel ui menembalikan O& ,!/! titik pada kur'a standar yan memberi O& J ,!/ #arus dari konsentrasi analit yan sama sebaai sampel Anda% 9ambar untuk #ak tersebut termasuk penunaan antibodi sekunder terkonuasi untuk enzim! meskipun! dalam arti teknis! #al ini tidak diperlukan ika antibodi primer adala# konuasi enzim% Namun! penunaan konuasi antibodi sekunder"men#indari proses yan ma#al untuk men0iptakan enzim"linked antibodi untuk setiap antien yan satu munkin inin mendeteksi% &enan menunakan antibodi enzyme"linked yan menikat *ilaya# F0 dari antibodi lain! antibodi ini enzyme"linked yan sama dapat diunakan dalam berbaai situasi% 4anpa lapisan pertama antibodi GmenankapG! setiap protein dalam sampel (termasuk protein serum) dapat menyerap kompetiti$ ke permukaan pirin! menurunkan umla# antien amobil% 8enunaan antibodi spesi$ik dimurnikan untuk melampirkan antien ke plastik men#ilankan kebutu#an untuk memurnikan antien dari 0ampuran yan rumit
sebelum penukuran! menyeder#anakan ui! dan meninkatkan spesi$isitas dan sensiti'itas penuian tersebut%
DAFTAR PUSTAKA • •
•
#ttpBmoko5,%*ordpress%0om1/,,/.1tinauan"tentan"elisa
; http;//id.sh1oong.#om/eBa#ts#ien#es/bioengineeringandbiote#hnology/$$4!metode elisaen+ymlinkedimmunosorbent/MiB++$dla9Bp@N
ELISA Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatuimmunoassay adalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif atau antibodi. alam radioimmunoassay, radioakti!itas memberikan sinyal, yang menun"ukkanapakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel. #adioimmunoassay pertama kali di"elaskan dalam kertas oleh #osalyn Sussman $alo% dan Salomo &erson diterbitkan pada tahun 1'(). Sebuah mikrobiologi menggunakan en*im suatu Linked tes Assay +ELISAimm unosorbent, dalam rangka untuk mengembangkan metode untuk deteksi epat antigen p2 /I0 dalam sampel darah. arena radioakti!itas menimbulkan anaman kesehatan potensial, alternatif yang lebih aman itu diari. Sebuah alternatif yang ook untuk radioimmunoassay akan mengganti sinyalnon-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. etika en*im +seperti peroksidase bereaksi dengansubstrat yang sesuai +seperti A&S atau 3,3 , 4,4-tetramethylben*idine, perubahan %arna ter"adi, yang digunakan sebagai sinyal. 5amun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengankeberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa en*im harus dihubungkan dengan antibodiyang sesuai. 6roses menghubungkan seara independen dikembangkan oleh Stratis A!rameasdan 7& 6iere. arena itu perlu untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan menui, antibodi atau
antigen harus tetap ke permukaan %adah8. $aitu, immunosorbent telahharus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk menapai hal ini diterbitkan oleh 9ide dan :erker6orath pada tahun 1'((. 6ada tahun 1';1, 6etrus 6erlmann dan E!a Eng!all di
Pengertian ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan $uga berbagai bidang industri. /alam pengertian sederhana, se$umlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesi'ik di&u&ikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu en7im, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh en7im men$adi sinyal yang dapat dideteksi. /alam ELISA 'luoresensi, saat &ahaya dengan pan$ang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigenCantibodi akan ber'luoresensi sehingga $umlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya 'luoresensi. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesi'itas untuk antigen tertentu. Sampel dengan $umlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang nonspesi'ik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesi'ik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesi'ik untuk antigen yang sama, disebut sandwich" ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan $uga dengan en7im, atau dapat dideteksi se&ara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan en7im melalui biokon$ugasi. /i antara tiap tahap, plate harus di&u&i dengan larutan deter$en lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pen&u&ian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat en7imatik untuk memproduksi sinyal yang isibel, yang menun$ukkan kuantitas antigen dalam sampel. %eknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metodemetode terbaru mengembangkan substrat 'luorogenik yang $auh lebih sensiti'.
Aplikasi ELISA ELISA dapat menge!aluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum +seperti dalam tes /I0, dan "uga untuk mendeteksi kehadiran antigen. >etode ini "uga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kaang, %alnut, almond, dan telur. ELISA "uga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk u"i pendugaan epat pada berbagai kelas obat. ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk /I0 karena kepekaan tinggi. alam ELISA, serum seseorang dienerkan )) kali lipat dan diterapkan pada pelat yang antigen /I0 yang terpasang. :ika antibodi terhadap /I0 hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen /I0. 6elat ini kemudian diui untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah ?antibodi sekunder? khusus disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan ke piring, menui diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder seara kimia%i terkait di muka untuk en*im. ?Anti Ig7 manusia? Antibodi 7anda Sand%ih ELISA engan demikian, piring akan berisi en*im sebanding dengan "umlah antibodi sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk en*im diterapkan, dan katalisis oleh en*im mengarah ke perubahan pada %arna atau @uoresensi. /asil ELISA dilaporkan sebagai nomor8 aspek paling kontro!ersial dari tes ini adalah menentukan ?ut-o? titik antara positif dan hasil negatif.Sebuah titik ut-o dapat ditentukan dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal. :ika tes ELISA digunakan untuk skrining obat di tempat ker"a, konsentrasi ut-o, 4) ng = mL, misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi konsentrasi analit standar akan disiapkan. iketahui bah%a menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada sampel dikenal adalah ?positif.? >erekayang menghasilkan sinyal lemah, yang ?negatif.? okter ennis E &id%ell dan Alister 0oller meniptakan tes. egunaan lain dari ELISA meliputiB 1. deteksi antibodi mikobakteri dalam &. 2. deteksi rota!irus dalam tin"a. 3. deteksi penanda hepatitis & dalam serum. . deteksi enterotoksin E. oli dalam tin"a.
Tipe-tipe ELISA Ada beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikutB
1.
Indiret ELISA
2.
Sand%ih ELISA
3.
Competiti!e ELISA
1. Indiret ELISA
+7ambar >ekanisme Indirect ELISA
ahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalahB a)
Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan &ara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kura standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diu$i.
b)
Suatu larutan pekat dari protein non-interactin! , seperti bovine serum albumin (+SA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. %ahap ini dikenal sebagaiblockin! , karena protein serum memblok adsorpsi nonspesi'ik dari protein lain ke plate.
&)
Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam bu''er yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. #arena imobilisasi antigen dalam tahap ini ter$adi karena adsorpsi nonspesi'ik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.
d)
Plate di&u&i, dan antibodi pendeteksi yang spesi'ik untuk antigen yang diu$i dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.
e)
Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkon$ugasi men$adi en7im dengan substrat spesi'ik. %ahap ini bisa dileati $ika antibodi pendeteksi berkon$ugasi dengan en7im.
')
Plate di&u&i untuk membuang kelebihan kon$ugat en7imantibodi yang tidak terikat.
g)
/imasukkan substrat yang akan diubah oleh en7im untuk mendapatkan sinyal kromogenikC 'luorogenikC elektrokimia.
h)
Hasil dikuanti'ikasi dengan spektro'otometer, spektro'luorometer atau alat optikC elektrokimia lainnya. En7im bertindak sebagai ampli'ier, bahkan $ika hanya sedikit antibodi terikat en7im yang tetap terikat, molekul en7im akan memproduksi berbagai molekul sinyal. #erugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya nonspesi'ik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang ke&il dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.
!. Sand"i# ELISA
ahapan dalam Sand%ih ELISA adalah sebagai berikutB a
isiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi Dpenangkap
b
Semua non spesiFk binding sites pada permukaan diblokir
Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
d
6late diui untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
e
Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan seara spesiFk dengan antigen
f
g h
Antibodi sekunder yang berikatan dengan en*im dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer 6late diui, sehingga kon"ugat antibodi-en*im yang tidak terikat dapat dibuang itambahkan reagen yang dapat diubah oleh en*im men"adi sinyal ber%arna= ber@uoresensi= elektrokimia
i
iukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen euntungan utama dari metode sand%ih ELISA adalah kemampuannya mengu"i sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat seara selektif antigen yang dikehendaki. anpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua "enis protein pada sampel +termasuk protein serum dapat diserap seara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. 6rinsip ker"a sand%ih ELISA dapat dilihat pada skema berikut iniB
$. %ompetiti&e ELISA ahapan penger"aan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaituB
a
Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b
omplek antigen-antibodi ini selan"utnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen
6late diui, sehingga kelebihan antibodi terui +semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi
d
itambahkan antibodi sekunder yang spesiFk utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan en*im
e
Substrat ditambahkan, en*im akan mengubah substrat men"adi sinyal kromogenik= @uoresensi. alam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. 6rinsip ker"anya dapat dilihat pada gambar berikut iniB
Seara singkat tahapan ker"a dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikutB
'. eberapa dan Portabe ELISA (M * P ELISA) (ELISA +e&erse di makaa# yang diterbitkan)
Sebuah teknik baru +E6 1 '' G' &1 di E6H &uletin 24.)2.2)' 5. 2))'=)'8
euntungan dari teknik ini adalah sebagai berikutB 6ara
ogi!es masing-masing dapat peka terhadap reagen yang berbeda, memungkinkan deteksi simultan dari antibodi yang berbeda dan = atau antigen yang berbeda untuk multi-target tes8
0olume sampel dapat ditingkatkan untuk meningkatkan sensiti!itas tes di klinik
+darah, air liur, urin, makanan +susu urah, telur dikumpulkan dan +air lingkungan sampel8 Satu ogi!e yang tersisa unsensiti*ed untuk mengukur reaksi non-spesiFk sampel8 6enggunaan perlengkapan laboratorium untuk mengeluarkan alikuot sampel,
menui solusi dan reagen dalam miro%ells tidak diperlukan, memfasilitasi pengembangan siap menggunakan laboratorium-kit dan di tempat kit.
,. Materia aam Metode ELISA Antigen >onolonal Ab >iroplate &loking &uer Serum sample Con"ugate +seondary Ab J En*yme Subtrate
