Teknik Analisa
I.
Sejarah Penemuan dan Prinsip Dasar Teknik ELISA Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/ signal. Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simpel dapat dijabarkan sebagai berikut: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas
untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid(biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut „sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif. Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan antibodi atau antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi atau antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer atau dengan cara menentukan jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standar dan kadar antigen atau antibodi yang tidak diketahui dapat ditentukan.
ELISA tradisional secara khusus memiliki reporter dan substrat yang menghasilkan beberapa bentuk perubahan warna yang dapat diamati untuk mengetahui kehadiran antigen atau analyte. Bentuk teknik ELISA terbaru seperti teknik flurogenic,electro chemiluminescent , dan real-time PCR dibuat untuk mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini dapat memberikan berbagai keuntungan diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat multiplexing (Leng et al , 2008).
II.
Kelebihan & Kekurangan Teknik ELISA Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain:
Teknik pengerjaan relatif sederhana. Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi) Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik) Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian. Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain: Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen) Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif cukup mahal. Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal. Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga
pembacaan
harus
dilakukan
dengan
cepat
(pada
perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).
III.
Alat & Bahan Yang Digunakan Bahan Kit ELISA yang terdiri dari :
plate ELISA yang telah dilapisi (coated) dengan antibodi atau antigen
Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa antibodi).
Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau
dikuantifikasi berupa antigen).
Larutan standard (kontrol positif dan negatif).
Sampel yang ingin dites.
standar antibiotik
Konjugate atau enzim penanda
Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal
Larutan pencuci ( Buffer )
Larutan penghenti reaksi (stop solution)
Peralatan - Timbangan - Gelas ukur - Single mikro pipet 5-50 μl, 50-1000 μl - Multi channel mikro pipet 5-50 μl, 50-300 μl - Bak reservoar - Homogenizer/stomacher/mortar, - Sentrifuger atau filter - Penangas air - Inkubator - ELISA Plate washer atau labu semprot - ELISA Plate Reader dengan filter panjang gelombang 400-600 nm untuk pengukuran kuantitatif - Komputer
IV.
Macam-Macam Teknik ELISA
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.
Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
A. Indirect ELISA Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam serum adalah: 1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji. 2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi nonspesifik dari protein lain ke plate. 3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar. 4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking. 5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim. 6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat. 7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8.
Hasil
dikuantifikasi
dengan
Elisa
Reader
/
spektrofotometer,
spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya. Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
B. Sandwich ELISA Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut: 1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi „penangkap‟ 2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir 3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate 4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat 5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen 6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer 7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi‐enzim yang tidak terikat dapat dibuang 8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang microtiter Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).
V.
Contoh Langkah Kerja Teknik ELISA Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:
Standart Operating Procedure (SOP) MicroPlate Reader Instructions (Thermo Multiskan EX) 1. Turn on plate reader (back, right ), and let it warm up for at least 1 min 2. Log on to computer with 3. Click on “Ascent software” icon. 4. When window comes up, click on “measure” in the left side column. 5. Select your filter. 6. Put plate in holder. (Remove lid.) 7. Click on START at the top, middle of the computer screen 8. Data will magically appear on the computer screen. (Remove your plate from its holder.) 9. Now you can copy and paste the data into Excel, then store it appropriately.
10. TURN OFF THE PLATE READER. 11. Log off of the computer. 12. Replace the cover on the plate reader. 13. Admire your data, then turn out the lights on your way out.
Modul Training Elisa Microplate Reader Lab.Biologi FMIPA UNNES Semarang, 11 Nopember 2012 Created by : Enang Kholis Mobile : 0812 8202721 Email :
[email protected]
