EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE GLUCÓGENO EN EL HÍGADO DE CAVIA PORCELLUS
I.
INTRODUCCION
El glucógeno es el polisacárido de reserva más importante en las células animales. Al igual que la amilopectina, el glucógeno es un polímero con subunidades de glucosa unidas por enlaces (α1→4) y ramificaciones del tipo (α1→6 ), pero el glucógeno está más ramificado (una ramificación cada 8 a 12 residuos) y es más compacto que el almidón. El glucógeno es especialmente abundante en el hígado, donde puede llegar a representar el 7% de su peso; también se encuentra en el músculo esquelético. Algunos gránulos de glucógeno contienen también, íntimamente unidos, los enzimas responsables de su síntesis y degradación. Puesto que cada rama de estos termina con un azúcar no reductor (que no posee carbono anomérico libre), estos polímeros tienen tantos extremos no reductores como ramas, pero únicamente un extremo reductor. Cuando el glucógeno se emplea como fuente de energía las unidades de glucosa son eliminadas de una en una a partir de los extremos no reductores. Dada la naturaleza ramificada de la amilopectina y el glucógeno, los enzimas degradativos (que actúan en los extremos no reductores) pueden trabajar simultáneamente en muchos extremos, aumentando la velocidad de conversión del polímero en monosacáridos (Lehninger et al, 2005).
La D- glucosa es el principal combustible de la mayoría de organismos y ocupa una posición central en el metabolismo. Es relativamente rica en energía potencial; su oxidación completa a dióxido de carbono y agua transcurre con una variación de energía libre estándar de -2.840 kJ/mol. Almacenando la glucosa en forma de polímero de elevada masa molecular, una célula puede apilar grandes cantidades de unidades de hexosa al tiempo que mantiene una osmolaridad citosólica relativamente baja. Cuando aumenta de una manera súbita las necesidades energéticas de la célula, la glucosa se puede liberar rápidamente a partir de estos polímeros de almacenamiento intracelular (Lehninger et al, 2005).
En la glucólisis (del griego glykys, que significa “dulce” y lysis, que significa “romper”) lo que sucede es que se degrada una molécula de glucosa en una serie de reacciones catalizadas enzimáticamente, dando dos moléculas de piruvato. Durante la secuencia de reacciones parte de la energía libre cedida por la glucosa se conserva en forma de ATP. La glucólisis fue la primera ruta metabólica elucida y es probablemente la que se conoce mejor, mientras que la gluconeogénesis es la síntesis de la glucosa a partir del piruvato y el lactato.
Para la síntesis de una mol de glucosa son necesarios 4 moles de ATP y 2 moles de GTP (ó ITP) a partir de 2 moles de piruvato y/o lactato. El camino que lleva la glucogénesis es básicamente el inverso del de la glucólisis excepto por 3 pasos específicos entre la glucosa y glucosa-6-fosfato, fructosa-6-fosfato y fructosa-1,6bifosfato, and fosfoenolpiruvato (PEP) y piruvato. Esta tiene su lugar principalmente en el hígado y su misión es proporcionar glucosa para exportarla a otros tejidos cuando se han agotado otras fuentes de glucosa. (Hayashi, 2008)
II. III.
FUNDAMENTO TEORICO OBJETIVOS
IV.
Utiliza las metodologías de bioquímica experimental para la extracción de glucógeno a partir de tejido animal (hígado de cavia porcellus) y realizar su determinación cualitativa. Determinar la función e importancia del glucógeno.
MATERIALES, REACTIVOS y otros A. MATERIALES
Equipo de disección Centrifuga Tubos de centrifuga Balanza Provetas Mortero Pipetas Varilla de vidrio Cronometro
B. REACTIVOS
Etanol absoluto al 96% Acido trocloroacetico al 5% Hielo
C. OTROS
V.
Cavia porcellus
Arena Hielo
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Decapítese un cobayo extráigase el hígado, colocándose inmediatamente en hielo.
2. Una frio, pesar 5 gr de hígado
3. Córtese en trozos pequeños y colocar en un mortero enfriado previamente, conteniendo un volumen (1 ml por grado de tejido) de ATC al 10%.
4. Añadir 2.0 gr de arena lavada 5. Triturar el hígado manteniendo el mortero en hielo.
6. Centrifugar el homogenizado por 5 minutos a 2000 rpm. 7. Vaciar el sobrenadante en una probeta y colectar en vaso ppdo. 8. Enjuagar el mortero con ATC al 5% y centrifugar. 9. Centrifugar el homogenizado por 5 minutos a 2000 rpm. 10. Colectar los sobrenadantes en una probeta 11. Agitar la probeta contenida con sobrenadante con una varilla de vidrio y dejar reposo durante 5 minutos.
12. Agitar la probeta y volver a centrifugar el homogenizado por 5 minutos a 2000 rpm.
13. Descartar los precipitados y separar el sobrenadante en una probeta, agregar ATC 10% hasta volumen total de la probeta.
14. Añádase mientras se agitan al homogenizado 2 volúmenes de alcohol al 95% por cada volumen de extracto.
15. Agítese a la mezcla y dejar en reposo hasta que el precipitado flocule.
16. Si no flocula, añádase una alícuota de NaCl y calentar el recipiente con un poco de agua tibia hasta la obtención de un precipitado.
17. Transfiérase la suspensión a tubos y centrifugar durante 3 minutos a 2000 rpm. Descartar el sobrenadante.
18. Disuelva el precipitado blanco en 5 de agua y repricipitar con dos volúmenes de etanol al 95%.
19. Volver a centrifugar la solución anterior y lave el tubo de centrífuga con 3 ml etanol al 95% dispersando con una varilla de vidrio.
20. Tras la centrifugación, lavar el ppdo. con 3 ml de etanol al 95% y 3 ml de éter etílico.
21. Secar la preparación al ambiente, extendiéndose el precipitado en capa fina en una luna de reloj.
VI.
EXPRESION DE RESULTADOS
VII.
DISCUSIONES La gluconeogénesis es el proceso de síntesis de glucosa o de glucógeno a partir de precursores que no son carbohidratos. Los principales sustratos son los aminoácidos glucogénicos, lactato, glicerol y propionato. El hígado y los riñones son los principales tejidos gluconeogénicos; los riñones pueden contribuir con hasta 40% de la síntesis de glucosa total en el estado de ayuno, y con más durante inanición. Las enzimas gluconeogénicas clave se expresan en el intestino delgado, pero no está claro sí hay producción significativa de glucosa por el intestino en el estado de ayuno. Un aporte de glucosa es necesario, en especial para el sistema nervioso y los eritrocitos. Después de un ayuno durante toda la noche, la glucogenólisis y la gluconeogénesis hacen contribuciones casi iguales a la glucosa en sangre; a medida que las reservas de glucógeno se agotan, la gluconeogénesis se hace progresivamente más importante. La falla en la gluconeogénesis por lo general es mortal. La hipoglucemia causa disfunción cerebral, lo que puede conducirá coma y muerte. La glucosa también tiene importancia en el mantenimiento de la concentración de intermediarios del ciclo del ácido cítrico aun cuando los ácidos grasos son la principal fuente de acetilCoA en los tejidos. Además, la gluconeogénesis elimina lactato producido por los músculos y los eritrocitos, y glicerol producido por el tejido adiposo. En rumiantes, el propionato es un producto del metabolismo de los carbohidratos en el rumen, y es un sustrato importante para la gluconeogénesis. La gluconeogénesis excesiva ocurre en pacientes muy graves en respuesta a lesión e infección, lo que contribuye a la hiperglucemia que se relaciona con mal resultado. La hiperglucemia lleva a cambios de la osmolalidad de los líquidos corporales, flujo sanguíneo alterado acidosis intracelular, y aumento de la producción de radicales superóxido, lo
que da lugar a función alterada del endotelio y del sistema inmunitario, y coagulación sanguínea alterada. La gluconeogénesis excesiva también es un factor contribuidor a la hiperglucemia en la diabetes tipo 2 debido a sensibilidad alterada de la gluconeogénesis a la regulación descendente en respuesta a la insulina.
VIII.
CONCLUSIONES
Se Utilizaron las metodologías de bioquímica experimental (espectrofotometría) para la extracción de glucógeno a partir de tejido animal (hígado de cavia porcellus) y realizamos su determinación cualitativa. Se determinaron las funciones e importancia del glucógeno.
IX. CUESTIONARIO 1. Realice el flujograma de la extracción de glucógeno PESAR LA MUESTRA DE HIGADO
CORTAR LA MUESTRA EN TROZOZ PEQUEÑOS
AGREGAR ÁCIDO TRICLOROACETICO
CORTAR LA MUESTRA EN TROZOS PEQUEÑOS
AGREGARA ARENA LAVADA
TRITURAR LA MUESTRA
CENTRIFUGAR DURANTE 5 MINUTOS
DECANTAR EL LÍQUIDO OPALESCENTE
EJUGAR EL MORTERO Y PILON CON UNA PORCION DE ATC
VERTER EL CONTENIDO EN EL TUBO DE CENTRIFUGA CON RESIDUOS
AGITAL LA MUESTRA Y DEJAR EN REPOSO
CENTRIFUGAR 5 MINUTOS
DECANTAR
AÑADIR ETANOL AL 95% HASTA QUE FLOCULE
CENTRIFUGAR 5 MINUTOS
AÑADIR ETANOL AL 95% HASTA QUE FLOCULE
CENTRIFUGAR 5 MINUTOS
SECAR LA MUESTRA AL AIRE
2. ¿El tipo de dieta, edad, peso, actividad física, estado de ánimo influirá en el nivel de glucógeno hepático? en los estados tanto de alimentación como de ayuno se proporciona un aporte de combustibles metabólicos el sistema nervioso central y los eritrocitos siempre necesitan glucosa. Los eritrocitos carecen de mitocondrias y, por tanto, en todo momento dependen por completo de la glucólisis (anaeróbica) y de la vía de la pentosa fosfato. El cerebro puede metabolizar cuerpos cetónicos para satisfacer alrededor de 20% de sus requerimientos de energía; el resto debe suministrarse mediante glucosa. Los cambios metabólicos que suceden en el estado de ayuno y en la inanición son las consecuencias de la necesidad de preservar la glucosa y las reservas limitadas de glucógeno en el hígado y los músculos para uso por el cerebro y los eritrocitos, y de asegurar el suministro de combustibles metabólicos alternativos para otros tejidos. En el embarazo el feto requiere una cantidad importante de glucosa, al igual que la síntesis de lactosa durante la lactación. un equilibrio de las actividades entre la glucógeno sintasa y La Fosforilasa regula el metabolismo del glucógeno. Al mismo tiempo que la fosforilasa es activada por un aumento de la concentración de cAMP (por medio de la fosforilasa cinasa), la glucógeno sintasa es convertida en la forma inactiva; ambos efectos están mediados por la proteína cinasa dependiente de cAMP (figura 19-8). De este modo, la inhibición de la glucogenólisis aumenta la glucogénesis neta, y la inhibición de la glucogénesis aumenta la glucogenólisis neta. Asimismo, la desfosforilación de la fosforilasa a, fosforilasa cinasa y glucógeno sintasa b es catalizada por una enzima única con especificidad amplia, la proteína fosfatasa-1. A su vez, esta última es inhibida por la proteína cinasa dependiente de cAMP por medio del inhibidor- 1. De este modo, la glucogenólisis puede terminar, y la glucogénesis puede ser estimulada, o viceversa, de manera sincrónica, porque ambos procesos son dependientes de la actividad de la proteína cinasa dependiente de cAMP. Cinasas y fosfatasas separadas pueden fosforilar de manera reversible en más de un sitio tanto la fosforilasa cinasa como la glucógeno sintasa. Estas fosforilaciones secundarias modifican la sensibilidad de los sitios primarios a la fosforilación y desfosforilación (fosforilación de múltiples sitios). Asimismo, permiten que la insulina, por medio de un incremento de la glucosa 6-fosfato, tenga efectos que actúan de manera recíproca a los del cAMP.
3. ¿Cuáles son las diferencias entre glucógeno hepático y glucógeno muscular?
Figura Nº 1. almacenamiento de carbohidratos en un ser humano de 70 kg de peso
Glucógeno muscular Glucógeno muscular es el combustible del músculo y esencial para poder realizar cualquier tipo de activad física. Hay que prestarle especial atención cuando realizas deporte ya que aquí es muy importante mantener los niveles de glucógeno muscular. Su papel en el músculo es proporcionar la fuente primaria de energía al músculo, permitiendo que se contraiga.
Glucógeno hepático Sufre una serie de transformaciones para convertirse en glucosa en sangre mediante adrenalina y glucagón. Ambas hormonas importantísimas en el organismo y la salud. Esta es la principal fuente de glucosa sanguínea cuando estamos alimentándonos. Así que es vital para seguir activos.
4. ¿Qué enfermedades se dan por acumulación de glucógeno? TIPO
NOMBRE
ENZIMA DEFICIENTE
DATOS CLINICOS Hipoglucemia; hipercetonemia; muerte temprana acumulación de glucógeno en el hígado y en células de los túbulos renales; hipoglucemia; acidemia láctica; cetosis; hiperlipidemia como en el tipo Ia; neutropenia y función de neutrófilos alterada que llevan a infecciones recurrentes Acumulación de glucógeno en lisosomas: variante de inicio juvenil, hipotonía muscular, muerte por
0
-
Glucógeno sintasa
Ia
Enfermedad de Von Gierke
Glucosa 6fosfatasa
Ib
-
II
Enfermedad de pompe
transportador de glucosa 6-fosfato del retículo endoplásmico α1 → 4 y α1 →6 glucosidasa (maltosa acida) lisosomal
IIIa
Dextrinosis limite, enfermedad de Forbe o de cori
IIIb
Dextrinosis limite
IV
Enzima desramificadora hepática y muscular
Enzima desramificadora hepática amilopectinosis, Enzima enfermedad ramificadora de andersen
V
Deficiencia de miofosforilasa, síndrome de Mcardle
Fosforilasa muscular
VI
Enfermedad de Hers
Fosforilasa hepática
VII
Enfermedad de tarui
Fosfofructocinasa 1 muscular y de eritrocitos
VIII
Fosforilasa cinasa hepática
IX
Fosforilasa cinasa hepática y muscular
X
proteína cinasa dependiente de caMp
X. 1.
insuficiencia cardiaca hacia los dos años de edad; variante de inicio en el adulto, distrofia muscular Hipoglucemia en ayuno; hepatomegalia durante la lactancia; acumulación de polisacárido ramificado característico (dextrina limite); debilidad muscular como en el tipo IIIa, pero sin debilidad muscular Hepatosplenomegalia; acumulación de polisacárido con pocos puntos de ramificación; muerte por insuficiencia cardiaca o hepática antes de los cinco años de edad poca tolerancia al ejercicio; glucógeno muscular anormalmente alto (2.5 a 4%); lactato en sangre muy bajo después de ejercicio Hepatomegalia; acumulación de glucógeno en el hígado; hipoglucemia leve; por lo general buen pronostico poca tolerancia al ejercicio; glucógeno muscular anormalmente alto (2.5 a 4%); lactato en sangre muy bajo después de ejercicio; anemia hemolítica Hepatomegalia; acumulación de glucógeno en el hígado; hipoglucemia leve; por lo general buen pronostico Hepatomegalia; acumulación de glucógeno en el hígado y el musculo; hipoglucemia leve; por lo general buen pronostico Hepatomegalia; acumulación de glucógeno en el hígado
BIBLIOGRAFIA Principios de Bioquímica 3ª/4ª edición. (2000/2005) David L. Nelson y M. M. Cox. Editorial Omega
Bioquímica: Fundamentos para Medicina y Ciencias de la vida. 1ª Edición, (2008) Müller-Esterl, W. Editorial Reverté. España. 3. Bioquímica. La base molecular de la vida 3ª Edición, (2003). McKee, T., McKee, Jr McGraw Hill Interamericana. Madrid 4. Fundamentos de Bioquímica 2ª Ed. D.Voet, JG Voet, CW Pratt Bioquímica Editorial Médica Panamericana, Madrid, 2007 Bioquímica 3ª Ed. (2002) C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern. Pearson 5. Educación S.A 2.
