EXTRACCION Y ANALISIS DE CAROTENOIDES DEL PIMENTÓN (apsicum annuum) VERDE POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y CROMATOGRAFÍA EN CONLUMNA
Introducción Unas de las técnicas cromatografía más sencillas y económicas de separar componentes de interés de una muestra son la cromatografía en capa fina y en columna en esta ocasión estas técnicas se emplearon para la separación de ciertos carotenoides contenidos en el pimentón verde empleando solventes como éter de petróleo y acetato de sodio, obteniendo asi unos resultados satisfactorios.
Objetivos
Objetivo general Separar los componentes de interés (carotenoides) en un muestra de pimentón verde usando técnicas de separaciones cromatografícas sencillas. Objetivos específicos. Determinar qué tipos de carotenoides tiene el pimentón verde usando rf obtenidos y comparándolos con los de referencia. Desarrollar habilidades en el manejo de las técnicas cromatograficas empleadas. Entender la importancia de los carotenoides en este tipo de especies vegetales.
Marco Teórico DEFINICION Los carotenoides o tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 átomosde carbono derivados biosintéticamente a partir de dos unidades de geranil-geranilpirofosfato,en su mayoría son solubles en solventes apolares y de coloraciones que oscilanentre el amarillo (por ejemplo el ß-caroteno) y el rojo (por ejemplo el licopeno). CLASIFICACION Y NOMENCLATURA Los carotenoides se clasifican en dos grupos: carotenos y xantofilas. Los carotenos solo contienen carbono e hidrógeno (por ejemplo el ß-caroteno, el licopeno, etc.), mientras que las xantofilas contienen además oxígeno (por ejemplo la luteína). A los carotenoides generalmente se les denomina con nombres comúnes que incluyen las variaciones estructurales de los anillos laterales, en especial la posición del enlace doble. El bcaroteno,hoy es denominado b,b-caroteno, para indicar que los dos anillos de los extremos tienen el enlace doble en la misma posición relativa. El a-caroteno, ahora se denomina b,ecaroteno En general para los carotenos se usa el sufijo caroteno, y para las xantofilas el sufijo ina. DISTRIBUCION Y ESTADO NATURAL Los carotenoides se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal, en bacterias, y muy pocos se han reportado en animales (por ejemplo los colores rojizos de las plumas del flamingo son debidos a la cantaxantina, un carotenoide), y particularmente invertebrados marinos como las esponjas, estrellas de mar, pepinos de mar, erizos de mar, y otros. En los animales superiores el ß-caroteno es un requerimento dietario esencial pues es precursor de la vitamina A.Se conocen más de 600 carotenoides, y se les encuentra en forma libre, como ésteres deácidos grasos o como glicósidos. Sin embargo los glicósidos carotenoides son muy raros, un ejemplo de estos últimos es la crocina. Los carotenoides se encuentran principalmente en partes aéreas de las plantas, especialmente en hojas, tallos y flores, en frutos (por ejemplo tomate, pimentón, etc.), y en menor proporción en raíces (por ejemplo la zanahoria). El caroteno más comúnmente encontrado es el b-caroteno, y normalmente constituye entre el 25-30 % del contenido total de carotenoides en las plantas. La luteína es la xantofila más abundante (40-45 %), pero siempre se encuentra en menor proporción que el b-caroteno1. Los carotenoides junto con los flavonoides y las clorofilas, son los pigmentos vegetales más distribuídos. En especial existen carotenoides que confieren coloraciones amarilla, naranja, roja y violeta a tejidos vegetales y algunos órganos animales. Los flavonoides confieren también coloraciones similares, inclusive coloración azul a muchas flores y frutos, mientras que las clorofilas se reconocen fácilmente por su coloración verde. Existen también vegetales tan conocidos como la remolacha Beta vulgaris, que debe su color característico a pigmentos nitrogenados denominados betacianinas, menos distribuídos que los primeros.
Aislamiento y extracción Debido a que los carotenoides en su mayoría son solubles en solventes apolares como éter etílico, benceno, cloroformo, acetona, acetato de etilo, entre otros; y a que se deben extraer de tejidos frescos, los cuales presentan un alto contenido de agua la cual dificulta una extracción
eficiente, es conveniente eliminar dicho agua. Un procedimiento recomendable es deshidratar los tejidos con etanol o metanol a ebullición seguido de filtración. El tejido deshidratado se puede entonces extraer con un solvente apolar. Una alternativa a este proceso de deshidratación es la liofilización, la cual resulta ventajosa porque se realiza a baja temperatura y al vacío, eliminando la posibilidad de degradación por altas temperaturas y presencia de aire. Si en el extracto existen carotenoides esterificados, estos se pueden hidrolizar disolviendo el extracto en un volumen pequeño de KOH 60% alcohólico. Esta mezcla se deja en la oscuridad durante la noche, con atmósfera de nitrógeno, a temperatura ambiente y con agitación magnética, con lo cual los carotenoides son liberados. Si se desea un proceso más rápido, es aconsejable la ebullición durante 5-10 minutos. Separación Las mezclas de carotenos y las xantofilas mono- y dihidroxiladas pueden separarse agitandouna solución en éter de petróleo con un volumen de metanol al 90%. Las xantofilas dihidroxiladas quedan en la fase metanólica, las monohidroxiladas y los carotenos quedan en la fase etérea. Repitiendo este proceso con la fase etérea se separan en la fase metanólica las xantofilas monohidroxiladas, y en la fase etérea quedan los carotenos. Las xantofilas separadas en las fases metanólicas pueden recuperarse extrayéndolas con éter etílico. Debido a que los extractos de carotenoides generalmente están impurificados por otras sustancias como los esteroles, estos se pueden eliminar dejando el extracto concentrado en solución de éter etílico, tapado y a -10°C durante la noche. De esta manera los esteroles se precipitan y pueden ser retirados por centrifugación o filtración. Una vez obtenido el extracto o los extractos de carotenoides, estos se pueden separar y analizar por cromatografía en capa fina, en papel o en columna. El método más usado es la cromatografía en capa fina con varias clases de fases estacionarias que incluyen: óxido de magnesio activado, sílica gel, hidróxido de calcio y fosfato de magnesio entre otros.
Desarrollo experimental Todo el proceso de de extracción y separación se llevó a cabo en tres fases Primera fase Extracción se tomó un pimentón con una coloración verde de buen tamaño y que estuviera en buenas condiciones luego se procedió a picarlo en finas partes de allí se tomo una muestra de 30 g el cual fueron maceradas esta maceración luego se agregó una mezcla de metanol y diclorometano en una relación de volúmenes 9-1 posteriormente esta mezcla se llevó a un embudo de separación se dejo en reposo por unos minutos luego para su fraccionamiento se agregó una solución salina de cloruro de sodio se formaron dos fases luego se procedió a embazar la fase de interés en este caso el extracto primario la cual se dejó en contacto con el medio ambiente durante una noche. Segunda fase Se procedió a realizar técnica cromatograficas en columna Los solventes utilizados (fase móvil) fueron éter de petróleo, metanol y acetato de etilo. La fase estacionaria se utilizó silica gel.
En primera instancia se procedió con una mezcla de éter de petróleo acetato de etilo en un volumen de 60 ml con una relación 9-1 eter/acetato Separando así tres componentes distintos Luego aumento la polaridad preparando una mezcla de éter de petróleo y acetato de etilo en una relación 4-1 de éter/acetato. Logrando separar así tres componentes mas Posteriormente se procedió a preparar las misma mezcla en una relación 7-3 en volumen de 50 ml logrando separar así dos componentes mas Nuevamente se preparó la misma mezcla en una relación 6-4 Por último se agregó metanol debido a que algunas especies se encontraban muy retenidas logrando separar así dos componentes. En total fueron utilizados 26 viales para la recolección de los eluatos. El tiempo de empleado para esta separación fue 5h aproximadamente Tercera fase Se procedió a realizar la cromatografía en capa fina. De la cromatografía en columna se obtuvieron 10 muestras diferentes el cual se procedieron a separar los carotenoides existentes en dichas muestras. Tomando como referencias las muestras 1, 3 , 5, 9, 12, 15, 18 , 21, 24 25. Análisis de resultados Se utilizaron dos reveladores. Vapor de yodo y luz U.V . Medidas de Rf. Ecuación empleada Rf=
donde X= distancia recorrida por la especie retenida (cm) L= longitud de la placa (cm)
Datos: Longitud de la placa= 3.8 cm Rf obtenidos usando como revelador luz U.V Muestra Nº 3
X=2.3 cm
X= 3.6 cm
Rf=0.60
Rf= 0.94
Muestra Nº12
Muestra Nº 5
X1=2.3 cm
X=2.3 cm
Rf=0.60
Rf=0.60
X2=3cm Rf=0.78
Muestra Nº9
Muestra Nº 15
X=2.4 cm
Rf=0.36
Rf=0.63 Muestra Nº 18 X1=0.6 cm Rf=0.15 X2=2.4 cm Rf=0.63 Muestra Nº 21 X= 2.3 cm Rf= 0.60 Muestra Nº 24 Rf No Identificado Muestra Nº 25 X=1.4 cm
Rf obtenidos empleando como revelador vapores de yodo Muestra Nº 1
Rf= 0.97
X1=2.8 cm
X2=2.7 cm
Rf=0.73
Rf= 0.71
X2=3.7 cm
Muestra Nº 9
Rf=0.97
X=2.6 cm
Muestra Nº5
Rf=0.68
X1=3.7 cm Análisis de resultados. Con los valores de Rf de referencia y comparándolos con los obtenidos experimentalmente pudimos establecer que los posibles tipos de carotenoides presentes son β-caroteno Rf de referencia = 0.74
Se obtuvo un Rf experimental de 0.71 en la muestra Nº 5 usando como revelador vapores de yodo ∞-caroteno Rf de referencia= 0.80 Se obtuvo un Rf experimental de 0.78 en la muestra Nº 12 usando como revelador luz U.V Luteina. Rf de referencia=0.35 Se obtuvo un Rf experimental de 0.36 en la muestra Nº 25 usando como revelador luz U.V Capsantina. Rf de referencia= 0.16 Se obtuvo un Rf experimental de 0.15 en la muestra Nº 18 usando como revelador luz U.V
Conclusión De la anterior practica se pudo establecer los posible carotenoides presentes en el pimentón verde tales carotenoides fueron β-caroteno, ∞-caroteno, Luteina, capsantina. Las medidas Rf obtenidas experimentalmente fueron muy cercanas a los valores Rf de referencia consultado, lo cual indica que la práctica de laboratorio supero los márgenes mínimos de errores, brindando así resultados confiables.
Bibliografía Merck Co Inc reactivos de coloración para cromatografía de capa fina y papel. Robinson T. “The Organic constituensts of Higher plants”, 5th ed. Cordus Press, North Amherst MA U.S.A 1983. Dalmases, P., Bonet J. J., “Tecnicas de Cromatografia Liquido-Solido en Columna” .1984.
Universidad de Córdoba Facultad de Ciencias Básicas Departamento de Química Laboratorio de Análisis de Sustancias Bioactivas
Extracción y Análisis de Carotenoides del Pimentón (apsicum annuum) Verde por Cromatografía en Capa Fina y Cromatografía en Columna.
Ana Milena Borja Cristhian David Rubio José Guillermo Ortiz Jorge Mario Rolon Reinaldo José Pestana
Dr. Gilmar Santa Fe Patiño Profesor
Octubre de 2013 Monteria-Cordoba
