EXTRACCIÓN DEL ADN
I.
OBJETIVO
II.
Examinar un extracto crudo de ADN de células animales y confirmar su estructura fibrilar.
INTRODUCCIÓN
Hay 2 tipos de ácidos nucleicos (AN): el ácido desoxirribonucleico desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN), y están presentes en todas las células. Su función biológica no quedó plenamente demostrada hasta que Avery y sus colaboradores demostraron en 1944 que el ADN era la molécula portadora portadora de la información genética.
Los ácidos nucleicos son polímeros lineales de una unidad repetitiva llamada nucleótido (Figura de la derecha), cada nucleótido está formado, mediante un enlace éster, por un ác. fosfórico y un nucleósido(zona sombreada de la figura), este último se constituye por la unión de una pentosa (la (la D-ribosa o la 2-desoxi-D-ribosa), 2-desoxi-D-ribosa), y una base nitrogenada (purina o pirimidina).
Las bases nitrogenadas pueden ser purinas: ADENINA y GUANINA, las bases pirimidínicas son: CITOCINA, TIMINA y URACILO. La timina solo puede formar ADN y el uracilo solo está presente en el ARN.
El ADN lo aisló por primera vez, durante el invierno de 1869, el médico suizo Friedrich Miescher mientras trabajaba en la Universidad de Tubinga. Miescher realizaba experimentos acerca de la composición química del pus de vendas quirúrgicas desechadas cuando notó un precipitado de una sustancia desconocida que caracterizó químicamente más tarde. Lo llamó nucleína, debido a que lo había extraído a partir de núcleos celulares. Se necesitaron casi 70 años de investigación para poder identificar los componentes y la estructura de los ácidos nucleicos. El acido ribonucleico (ARN) y el acido desoxirribonucleico (ADN) son macromoléculas que intervienen en el almacenamiento y en la transferencia de la información genética. Son componentes fundamentales de la célula y constituyen, en conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco. Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando nucleoproteínas, ya que suelen unirse a determinados tipos de estas como las histonas. Hay 2 clases de proteínas de unión del ADN. Las histonas son la principal clase de proteínas de unión al ADN involucradas en mantener la estructura compacta de la cromatina. Hay 5 diferentes proteínas de histona identificadas como HI, H2A, H2B, H3 y H4. La otra clase de proteínas de unión al ADN es un diverso grupo de proteínas llamadas simplemente, proteínas no histonas. Esta clase de proteínas incluyen los distintos factores de transcripción, polimerasas, receptores hormonales y otras enzimas nucleares. En cualquier célula dada hay más de 1000 diferentes tipos de proteínas no histonas unidas al ADN. Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN. El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el núcleo, mitocondrias y cloroplastos, mientras que en el ADN se sitúa fundamentalmente en el núcleo de la célula, y también cloroplastos y mitocondrias en pequeñas cantidades. Poseen una importancia
manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a cabo la síntesis de proteínas y, por tanto, de las enzimas necesarios para el funcionamiento celular. Por otra parte, el ADN es el vehículo de la herencia, que se transmite de padres a hijos, de generación en generación. El ADN es la molécula que guarda el código genético de todas las células. Sin importar que el organismo sea multinuclear, eucariota o procariota incluyendo los virus viroides, todos tienen ADN o ARN como material hereditario y como vehículo de su código genético. Dogma central de la Biología
El mensaje genético se encuentra en la/las cadenas de ADN. Para que la célula se divida este ADN debe duplicarse: REPLICACIÓN, repartiéndose entre las células hijas. Durante la interfase el funcionamiento de la célula está dirigido por las proteínas. A partir del ADN se forma una molécula de ARN (TRANSCRIPCIÓN) que sale del núcleo: ARN y es "leído" por el RNAr con la ayuda del RNAt que le provee los aminoácidos para la formación de las proteínas: TRADUCCIÓN.
Esta serie de procesos se conoce como el dogma central de la Biología
III.
MATERIALES: Material biológico:
Hígado de pollo timo o gónadas de choro (el tejido debe ser fresco y conservado en frio). Materiales de laboratorio y reactivos
2 tubos de ensayo grandes 1 vaso de precipitado de 250 ml Embudo Gasa Agitador de vidrio Gradilla Mortero Pipetas Termómetros Probetas Solución salina de NaCl al 0.15M/EDTA 0.1M, ph: 8. Dodecil – hidrogeno – sulfato sódico (SDS) 10% NaCl 5M Solución cloroformo alcohol isoamílico (24:1) Alcohol etílico 96º helado IV.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Homogeneizar 2g de la muestra biológica en una licuadora o mortero en 10ml. de solución salina de NaCl al 0.15M/EDTA 0.1M, pH: 8 .Con ello, se consigue homogeneizar la muestra: las células se rompen y los núcleos quedan sueltos.
2. Transferir el homogeneizado anterior filtrando a una probeta de 100 ml y añadir 2 ml del detergente anonico Dodecil – hidrogeno – sulfato sodico (SDS) 10% Mezclar.
3. Colocar en baño María a 60ºC por 5 min.
4. Añadir 6ml de solución de NaCl 5M Mezclar. 5. Añadir la solución cloroformo alcohol isoamílico (24:1) en un volumen igual a lo obtenido en la etapa anterior. Agitar vigorosamente.
6. Centrifugar a 2500 rpm por 10 min. En este paso estamos aplicando un método físico.
7. Separar el sobrenadante con todo cuidado y colocando en una probeta de 10ml y agregar 2 volúmenes de alcohol 96%. El alcohol debe añadirse lentamente.
8. Observar las hebras de ADN.
V.
RESULTADOS
Se logró observar las hebras del ADN, que con la combinación de diferentes reactivos nos han permitido obtener a tal punto que la célula no haya sido dañada y así poder extraer el ADN dentro del núcleo, mediante el rompimiento de dichas membranas y paredes celulares.
VI.
CUESTIONARIO 1. ¿Con que objetivo se utiliza el CINa/EDTA?
Es romper la envoltura celular y permitir que se libere el ADN a la solución. El EDTA es un agente quelante que actúa removiendo traza de metales necesarios por endonucleasas para actuar. De esta manera se previene que las endonucleasas que están presentes en el citoplasma de la célula actúen degradando el constituyente celular de interés. El EDTA también tiene una función de ser como un anticoagulante para pruebas químicas en sangre. 2. ¿Qué finalidad tiene el uso de SDS y la solución concentrada de NaCl? SDS
Empleado en diversos productos de higiene personal como champú y jabones de baño, mayormente usado como detergente. Se emplea comúnmente en la preparación de proteínas para electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). El SDS actúa rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas, desnaturalizándolas, provocando que estas moléculas proteicas pierdan su conformación nativa.
Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del polipéptido. Además, la cantidad de SDS unido es similar para muchas proteínas: una molécula de SDS por cada dos residuos aminoácidos, correspondiendo a unos 1,4 g SDS/g proteína. Ello proporciona al polipéptido una carga negativa que resulta proporcional a la longitud de la cadena (el número de aminoácidos) y, por tanto, a la masa molecular de la proteína. Este aporte de carga negativa es sustancialmente mayor que la carga original de la proteína. La repulsión electrostática creada por la unión del SDS a la proteína es uno de las causas de que la proteína pierda su conformación nativa, eliminándose de este modo las diferencias en conformación de las diferentes proteínas que han de ser separadas en el gel. Solución concentrada de NaCl
Produce un estallido en los núcleos para así que queden libres las fibras de cromatina. Gracias a ello la célula no se daña ya que se encuentra en un medio isotónico. 3. ¿Qué efecto causa la solución de cloroformo/alcohol isoamílico y el uso de etanol frio en la extracción de ADN?
El cloroformo/alcohol isoamílico extrae las proteínas que componen el ADN y luego el etanol frio 96% precipita la solución del ADN, que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. 4. ¿Cómo se justifica la gran cantidad de ADN presente en la muestra?
Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material genético y poseer baja actividad de desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la macromolécula en pequeños fragmentos.
VII.
Referencias
Curtis, H. Biología. 2002. Genes, Benjamin Lewin, Andrés Aguilera López.