Evaluación de la calidad y cantidad de ácidos nucleicos a partir de extractos de ADN y ARN de osteoictios

[Escriba el título del documento]

Evaluación de la calidad y cantidad de ácidos nucleicos a partir de extractos de ADN y ARN de osteíctios Rodríguez Castillo, Emanuel

Resumen: La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios en biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. Los métodos de extracción nos permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de cuantificación, calidad entre otros. Se hicieron dos estudios de evaluación, el primero para ADN donde se usaron usaron 3 tipos de muestras: pejerrey fresco y fijado y enlatado de caballa caballa y el segundo para ARN con el uso de tilapia la cual estuvo expuesta a dieta variable. Una previa extracción a base de separadores químicos y físicos y una posterior medición por espectrometría nos permitió determinar la cantidad de g por gramos de tejido en cada caso, un análisis electroforético en gel de agarosa nos permitió comprobar la calidad de nuestra muestra y de los protocolos usados en cada caso. Key Words: extracción DNA, RNA, muestras enlatadas, muestras frescas buffer CTAB

Materiales y Métodos:

se incubo por 30 min a 60 oC. Luego se adiciona 600 L de un solvente orgánico

1

[Escriba el título del documento] resuspenderlo con 100L de buffer TE y almacenarlo a 70oC. En la segunda experiencia, se usó RNA de tilapia, la cual ha estado sometida a una dieta de 3 tipos de alimento, del cual se obtuvieron porciones de tejido de aproximadamente 50mg a los cuales fueron pesados, separadas en tubos autoclavados conteniendo Trizol Trizol y rotuladas (ver Anexo). Después se disgrego mecánicamente e incubó a temperatura ambiente por 10min. Se le añadió 200L de cloroformo, se agito por inversión y se dejó reposar por 5min. Centrifugar en frio a 10000 RPM x 15min. Luego se tomó 200L de la fase acuosa y transfirió a un tubo con 500 L de alcohol isopropílico donde se homogenizó por inversión y se dejó reposar x 10min. Centrifugar a 10000 RPM x10 min. Se retiró el sobrenadante y el lavado se hizo con 1 mL de etanol 80 o y se centrifugo a 10000 RPM x5min. La

conteniendo buffer de carga (glicerol y azul de bromofenol y cinanocenol) y 2 buffer TBE 1x a pH 8,3 a 100 voltios por 30 minutos. La visualización del gel se hizo tiñendo con bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y fluoresce con luz UV, y un transiluminador con lámpara de luz UV, las imágenes fotografiadas pueden verse en la zona de anexos.

Resultados y Discusión: Para una exitosa extracción de ácidos nucleicos, estos deben separarse de cualquier otro compuesto proveniente de las células o del ambiente al que estuvo expuesta la muestra. El espectro de absorción característico para los ácidos nucleicos presenta un máximo en ~260nm; así también es posible obtener mediante reglas empíricas que el valor para una unidad de absorbancia a 260 nm es aproximadamente 50g/mL de dsDNA. Del mismo modo estas reglas también nos

[Escriba el título del documento] la pureza de la muestra (Sambrook y Russel, 2001; Falcón y Valera, 2007). Cuando los valores no cumplen los estándares estipulados se considera que no entran en el intervalo de aceptabilidad. Los resultados obtenidos por el espectrofotómetro pueden verse en el cuadro #01 para DNA y #02 para RNA. El análisis espectrofotométrico de la tabla #01 nos indica mediante las lecturas de Absorbancia 230nm e índices de A260nm/A230nm que las muestras de extracción de DNA no están aptas para un posterior estudio con PCR al tener valores que no se ajustan a los valores matemáticos mínimos permitidos (A260nm/A230nm>2.0) debido posiblemente a una alta tasa de contaminación producto del proceso de trabajo y/o el protocolo. Ahora si se tiene en cuenta los índices de A260/A280, estos no estarían indicando que la cantidad de DNA presente en las diferentes tubos estaría posiblemente contaminado con

para las muestras de DNA podemos darnos cuenta que solo 12 carriles dieron un resultado fluorométrico positivo, de los cuales solo 4 (carril 8, 12, 14, 15) dieron un resultado parcialmente positivo a la presencia de bandas de DNA de alto peso molecular las cuales se usan como indicador de DNA en buen estado (no degradado) para usos posteriores en PCR. En los carriles 22-24 se puede evidenciar unas bandas ubicadas al final lo que posiblemente estaría indicando una contaminación con fragmentos pequeños de DNA e incluso con sustancias aromáticas y/o proteínas posiblemente producto del proceso de extracción y del origen de la muestra. Como se puede ver el material aislado mediante este protocolo para extracción de DNA nos indica inicialmente que no es viable para los 3 tipos de muestreo (muestras frescas, fijadas en alcohol y enlatados) ya que la cantidad de material purificado detectado

3

[Escriba el título del documento] A260/A280 para los 3 muestreos presentan un amplio rango yendo desde el 1 hasta más de 3. Así las muestras frescas (carriles 1-10) son las que presentan un índice elevado sobre las otras indicando una alta presencia de DNA fragmentado y RNA como puede verse en la Fig#01 donde solamente el carril 8 presente respuesta fluorescente apreciable aun así es posible que sea un falso positivo ya que su valor de absorbancia a 260nm es muy bajo (0.084) y su nivel de absorbancia a 230nm es más elevado (0.205). Las muestras fijadas en alcohol, como se dijo líneas arriba, son las que mejor han respondido al protocolo usado, ya que sus índices de A260/A280 no están disparados hacia los extremos (exceptuando la muestra 20 que posiblemente sea producto de un mal manejo del material) sino más bien fluctúan cerca de 2 aun y se puede ver en el gel su fluorescencia (carriles 12,14,15)

material genético del producto alimenticio ha sufrido algún proceso de degradación previa. Así con esta consideración se sugiere que se debería hacer una corrida más pero con un patrón para poder determinar el grado de degradación de los ácidos nucleicos presentes en los tejidos de la caballa destinada al consumo y determinar su verdadero potencial alimenticio. Para determinar el grado de pureza del RNA, sus índices de A260nm/A280nm deben estar alrededor 1,80~2. Ahora teniendo en cuenta lo anterior, el análisis espectrofotométrico de la tabla #02 nos indica que los carriles 17, 22, 24, 25, 35 y 42 se esperarían que tuviesen la mayor cantidad de RNA puro y los otros carriles con muestras tuviesen en menor cantidad o no presentasen por estar contaminados con DNA u solventes orgánicos producto de protocolo. Así podemos ver en las Figuras #01 (parte inferior) y #02 en los carriles

4

[Escriba el título del documento] En aquellas muestras cuyo índice de A260/A280 es muy elevado (sobre 3) como en los carriles 30-34 y 39-41 y cuyos índices de A260nm para nucleótidos es alto indicaría presencia de RNA pero esto no se evidencia en el gel, lo cual es explicable por 2 sucesos, el primero es posible que haya ocurrido una contaminación por RNAasas en los carriles 30-34 por eso que prácticamente no se evidencia nada ya que todo se difuminado al medio al estar tan degradado. El otro suceso es lo que ocurre en la Figura #02 en los carriles 39-14 donde se ve muy fluorescente el carril pero no se puede evidenciar las bandas ribosomales claramente y es que si se ve sus valores de Absorbancia a 230nm y a 260nm están elevados, lo cual es posiblemente producido por una mala colecta de la fase acuosa durante la extracción de RNA; al tomar pipetear seguramente las otras fases (fase orgánica con DNA y fase no soluble) junto a la de la muestra (fase acuosa) y se puede

instrumentos al realizar el protocolo ya que esto afecto mucho en los datos. Considerando que los productos enlatados atraviesan diferentes mecanismos de procesamiento como calentamiento y/o adición de diversas sustancias no siempre indicadas en la etiqueta del producto, estas pueden filtrar en el tejido heterogenizando el producto llevando aún bajo rendimiento en el aislamiento de los ácidos nucleicos. Esta posibilidad debe confirmarse, ya que podría sugerir algún tipo de engaño a nivel comercial, ya que se altera la calidad del material que se está comercializando, y además puede dificultar la correcta identificación de la materia prima. Para la extracción de RNA, el protocolo estuvo acertado sin embargo como para DNA, la mala manipulación y trabajo sobre la muestra afectan demasiado el obtener un análisis valido así como una posterior utilización de la muestra para un estudio más avanzado.

5

[Escriba el título del documento] 

AMARU, RICARDO, PENALOZA, ROSARIO, MIGUEZ, HORTENCIA ET AL. UMSAgen,

extracción de ácidos nucleicos en muestras comerciales enlatadas de atún (Thunnus sp,) Revista

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The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium

Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía

6


CERVANTES

GONZALES.

Obtención de ADN útil para análisis genético, a partir de uñas recortadas. Rev. Medica Herediana

Vol14 nº4. 2003.

7


Anexos:

8 Figura#01: Gel conteniendo corridas electroforéticas de DNA y RNA (DNA parte superior y posillos 22- 24 parte inferior; RNA parte inferior)

DNA 22

23

muestras de RNA 24 16

17

18 19

20

21

22 23

24 25

26

27

28 30

32

33

34

Laboratorio de Genética Molecular


9

Muestras de RNA 35

39 40 41 Muestras de DNA

42

Figura#02: Gel conteniendo la continuación de la corrida electroforética de RNA(nótese que solo los posillos 35 y 42 señalan bandas risómicas; flechas negras)



10

Tabla #01 .-datos de Extraccion de Dna # #

muestra

peso tejido (g)

DATOS dilución A230

ABSORBANCIAS A260

A280

1

FRESCA

0.051

30

0.154

0.080

0.023

2

FRESCA

0.060

0.197

0.138

0.044

3

FRESCA

0.045

30 30

0.119

0.031

0.011

4

FRESCA

0.048

0.169

0.044

5

FRESCA

0.045

30 30

0.212 0.251

0.163

0.054

6

FRESCA

0.055

0.113

0.034

7

FRESCA

0.052

30 30

0.184 0.299

0.092

0.043

8

FRESCA

0.041

0.084

0.035

FRESCA

0.034

0.307

0.097

0.061

10

FRESCA

0.033

30 30 30

0.205

9

0.207

0.072

0.039

11

ALCOHOL

0.033

0.259

0.197

0.054

12

ALCOHOL

0.020

30 30

0.144

0.037

0.017

13

ALCOHOL

0.027

0.132

0.052

14

ALCOHOL

0.023

30 30

0.261 0.226

0.070

0.033

15

ALCOHOL

0.023

0.203

0.056

0.030

16

ALCOHOL

0.026

0.188

0.045

0.016

17

ALCOHOL

0.057

30 30 30

0.336

0.169

0.057

18

ALCOHOL

0.020

0.173

0.031

0.014

19

ALCOHOL

0.032

30 30

0.192

0.041

0.019

20

ALCOHOL

0.046

0.098

0.013

0.013

21

ENLATADO

0.058

30 30

0.180

0.083

0.054

22

ENLATADO

0.060

0.145

0.073

23

ENLATADO

0.068

30 30

0.207 0.190

0.130

24

ENLATADO

0.053

30

0.223

0.185

RESULTADOS INDICES CONCENTRACION A260/A230 A260/A280 ug/mL ug/g Tej. 0.519 3.478 120 235.294 0.701 0.261

3.136 2.818

207 46.5

345.000 103.333

0.797 0.649

3.841 3.019

253.5 244.5

528.125 543.333

0.614 0.308

3.324 2.140

169.5 138

308.182 265.385

0.410 0.316 0.348

2.400 1.590 1.846

126 145.5 108

307.317 427.941 327.273

0.761 0.257

3.648 2.176

295.5 55.5

895.455 277.500

0.506 0.310

2.538 2.121

198 105

733.333 456.522

0.276 0.239 0.503

1.867 2.813 2.965

84 67.5 253.5

365.217 259.615 444.737

0.179 0.214

2.214 2.158

46.5 61.5

232.500 192.188

0.133 0.461

1.000 1.537

19.5 124.5

42.391 214.655

0.073

0.700 0.684

1.986 1.781

217.5 195

362.500 286.765

0.105

0.830

1.762

277.5

523.585

339.118

389.946

346.876



11 Tabla #02.- Datos de Extraccion de Rna

DATOS

# #

muestra

peso tejido (g)

dilución

16

PEJERREY

0.0497

17

PEJERREY

0.0374

30 30

18

PEJERREY

0.0612

19

PEJERREY

0.0388

20

PEJERREY

0.0459

21

PEJERREY

0.0409

22

PEJERREY

0.0377

23

PEJERREY

0.0500

24

PEJERREY

0.0553

25

PEJERREY

0.0450

26

PEJERREY

0.0402

27

PEJERREY

0.0457

28

PEJERREY

0.4840

29

PEJERREY

0.0306

30

PEJERREY

0.0363

32

PEJERREY

0.0333

33

PEJERREY

0.0423

34

PEJERREY

0.0370

35

PEJERREY

0.0470

39

PEJERREY

0.0521

40

PEJERREY

0.0411

41

PEJERREY

0.0630

42

PEJERREY

0.0396

RESULTADOS A230

ABSORBANCIAS A260

A280

0.419

0.235

0.104

0.244

0.201

0.102

30 30 30

0.509

0.824

0.263

0.327

0.372

0.120

0.330

0.326

0.147

30 30

0.322

0.614

0.176

0.677

0.269

0.151

30 30

0.802

0.541

0.195

0.487

0.276

0.135

30 30 30

0.548

0.348

0.180

0.206

0.365

0.121

0.311

0.656

0.190

30 30

0.553

0.464

0.135

0.193

0.064

0.040

30 30 30

0.553

0.574

0.175

0.328

0.430

0.100

0.352

0.599

0.168

30 30

0.194

0.192

0.064

0.303

0.272

0.135

30 30

0.483

0.888

0.250

0.701

0.553

0.158

30 30

0.547

0.603

0.169

0.168

0.161

0.094

INDICES A260/A230 A260/A280

CONCENTRACION ug/mL ug/g Tej.

0.561 0.824

2.260 1.971

282 241.2

567.404 644.920

1.619 1.138 0.988

3.133 3.100 2.218

988.8 446.4 391.2

1615.686 1150.515 852.288

1.907 0.397

3.489 1.781

736.8 322.8

1801.467 856.233

0.675 0.567

2.774 2.044

649.2 331.2

1298.400 598.915

0.635 1.772 2.109

1.933 3.017 3.453

417.6 438 787.2

928.000 1089.552 1722.538

0.839 0.332

3.437 1.600

556.8 76.8

115.041 250.980

1.038 1.311 1.702

3.280 4.300 3.565

688.8 516 718.8

1897.521 1549.550 1699.291

0.990 0.898

3.000 2.015

230.4 326.4

622.703 694.468

1.839 0.789

3.552 3.500

1065.6 663.6

2045.298 1614.599

1.102 0.958

3.568 1.713

723.6 193.2

1148.571 487.879



Actividades Complementarias: Extraccion de DNA

12

1. Explicar los principios de los reactivos utilizados para la extracción de DNA 

Bromuro de etidio.- Conocido también como Bromuro de hexadeciltrimetilamonio ((C16H33)N(CH3)3Br), es una sal

cuaternaria, que es ampliamente usada en técnicas de biología molecular en los laboratorios debido a su propiedad de agente intercalaste entre las hebras del ADN. Emite fluorescencia cuando es irradiado con luz UV. Es conocido también por ser un agente altamente mutaren al contacto con la piel o el tracto respiratorio. 



Tris es el nombre abreviado del compuesto orgánico conocido como tris(hidroximetil)aminometano, de fórmula (HOCH2) 3CNH2. Se utiliza ampliamente en bioquímica y biología molecular en particular para preparar disoluciones tampón. Es una amina primaria, con la reactividad típica, por ejemplo la condensación con aldehídos y el establecimiento de un equilibrio ácido-base (responsable de su capacidad tamponante). El Tris tiene un pKa de 8,06, lo que le aporta capacidad tamponante efectiva en un intervalo de pH entre 7,0 y 9,2. TRIS

(Hidroximetil

amino

metano).-

EDTA ó Acido etilendiaminotetraacético.- es una sustancia comercializada en forma de polvo blanco, soluble en agua de peso molecular 292,24 g/mol y de formula global C10H16N208 y usada como agente quelante en biología molecular debido a

su capacidad de crear complejos con iones de metales pesados en solución que tengan una estructura de coordinación octaédrica, formando complejos coordinados cíclicos no iónicos virtualmente no disociable y solubles en agua. También tienen importancia farmacológica debido a que el EDTA y sus sales sódicas derivadas se utilizan para precipitar metales pesados tóxicos de manera que puedan ser excretados por la orina, así tenemos que forman fuertes quelatos con el plomo, el cadmio y el níquel. Cabe resaltar que pare que tenga una óptima función quelante debe actuar bajo un estrecho margen de pH alcalino, dentro del cual está la sangre y los líquidos tisulares. 

Buffer CTAB.- conocido también como “bromuro de cetil -trimetil amonio (CTAB)”, es una sal de amonio cuaternario

cuya fórmula es ((C16H33)N(CH3)3Br), con un grupo alquilo de gran longitud con actividad surfactante catiónica. Su uso en los diversos protocolos de extracción en biología molecular, radica en su capacidad de precipitar ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos en soluciones de baja concentración catiónica, haciendo que las proteínas y polisacáridos Laboratorio de Genética Molecular

[Escriba el título del documento] permanezcan neutros; sin embargo en soluciones de con alta concentración iónica, el CTAB forma complejos con las proteínas y los polisacáridos pero no precipita ácidos nucleicos. Es por esta razón que su uso es ampliamente adecuado 13 para extraer y purificar ADN de vegetales, derivados de estas y de bacterias que producen grandes cantidades de polisacáridos y compuestos fenólicos (Murray y Thompson, 1980), que, de otro modo, alterarían la pureza del ADN y por lo tanto, su calidad. 

Buffer TE.- es una solución buffer comúnmente usada en biología molecular, especialmente para procedimientos que envuelven a DNA o RNA. “TE” es la abreviatura de sus componente Tris, un tampón de pH común, y EDTA, una molécula

que quela cationes como el Mg+2. El propósito de este buffer es solubilizar el DNA o el RNA, mientras lo protege de la degradación. Estudios realizados con nucleasas en los años 80’s, se dio a ver que los rangos de pH podían ajustarse a diferentes aplicaciones, por ejemplo a pH 8 el DNA puede guardarse para reducir la depurinizacion la cual es catalizada en medios ácidos, mientras el RNA guardado a pH 7,5 debido a la catalización degradativa de las bases del RNA. Cabe añadir que las nucleasas se ven inactivadas por el EDTA debido a que este secuestra los cationes divalentes necesarios como cofactores para el funcionamiento de las nucleasas. 

Mercaptoetanol.- llamado también “-mercaptoetanol o 2-HGidroxietanol”, es un ti oglicol liquido incoloro; de masa

molecular 78,1 g/mol y de formulación C 2H6OS/HSCH2CH2OH. Su uso en bioquímica así como en biología molecular está muy extendido debido a su habilidad de disociar puentes de disulfuro, una característica muy apreciada cuando se emplea en protocolos de aislamiento de RNA, donde se busca eliminar las ribonucleasas liberadas durante la lisis celular; es aquí donde el mercaptetanol desestabiliza la estructura terciaria de las ribonucleasas por ruptura de puentes S-S previniendo la digestión del RNA durante su extracción. 

Cloroformo: alcohol isoamílico.- la adición de cloroformo – alcohol isoamílico (24: 1) durante la extracción tiene como fin

una combinación de efectos obtenidos por ambos compuestos, ya que por separado cada uno se utiliza para separar proteínas y polisacáridos de los ácidos nucleicos, pero la utilización de ambos juntos permite la agregación de los complejos proteína-polisacárido- El cloroformo es más denso que el agua, por lo que luego de una centrifugación se forman dos fases, la inferior en donde se encuentra el cloroformo-alcohol isoamílico con las proteínas y los polisacáridos, y una fase superior en la cual se mantiene el DNA.


[Escriba el título del documento] 2. Determinar la diferencias entre los detergentes aniónicos, catiónicos y no iónicos, su aplicación en las 14 extracciones 





Los detergentes conocidos también como surfactantes o sustancias anfifílicas son básicamente moléculas con una parte lipofilica (L) que generalmente es un radical hidrocarbonado y otra parte hidrofílica (H) o polar de la molecular, que es en general un grupo oxigenado. Según el tipo e disociación del grupo hidrofílico en fase acuosa los detergentes pueden ser aniónicos, catiónicos, no iónicos o anfóteros. Así tenemos que los detergentes aniónicos al disociarse en fase acuosas un ión cargado negativamente aporta las propiedades de actividad superficial, como por ejemplo los derivados del ion sulfato o de sulfonados como el dodecil sulfato de sodio o dodecil bencensulfonato de sodio ; los detergentes catiónicos actúan de igual forma sólo que en este caso es el ión cargado positivamente el que aporta las propiedades de actividad superficial, como los derivados de compuestos cuaternarios de amonio como el Hexadecil trimetil bromuro de amonio (CTAB). Los tensioactivos no iónicos no pueden disociarse en iones, pero son solubilizados en agua debido a la presencia de grupos polares. En algunos casos los tensioactivos no iónicos no poseen una cola claramente definible como hidrofóbica, pero aun así, las propiedades tensioactivas continuarán dependiendo del balance de las características hidrofóbicas e hidrofílicas de los diferentes grupos en la molécula, así tenemos a los alcoholes grasos o fenoles. Los tensioactivos anfóteros son sustancias en las que los grupos hidrofílicos pueden tener una carga positiva, negativa o ambas en disolución acuosa, dependiendo del pH, generalmente en medio básico son aniónicos y en medio ácido catiónicos. Sin embargo a pesar de la amplia gama de detergentes que se pueden aplicar a los protocolos de extracciones estos están limitados al tipo de adsorción que tiene las moléculas del surfactante con la macromolécula a querer retirar, así tenemos que se necesitan detergentes de origen aniónico para retirar proteínas o membranas como el SDS (dodecil sulfato de sodio) o el Sarkosyl (lauril sarcosina), o detergentes catiónicos para solubilizar polisacáridos como el CTAB.

3. Investigar otros protocolos. Función y principio del Chelex. Aplicaciones


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Metodología a usar en caso de muestras enlatadas (modificación hecha por Amarys Aguilar et al. para Thunnus sp. – Universidad Central de Venezuela 2011) o

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Se homogeniza 2g de tejido muscular en 5mL de buffer 1 (tris-HCL 50mM; ph 8; EDTA 0,1M; SDS al 1% y NaCl 0,2M) empleando el Mixer Homogenizer (Omni Internacional). Se trató con 200L de proteína K 5mg/mL a 55 ºC por toda una noche en agitación constante. A la mañana siguiente se incuba x30min en hielo y se centrifuga a 13400 x g/1 min. El sobrenadante se trató 2 veces con un volumen igual de fenol/cloroformo (1: 1), centrifugando a 13400 x g/5 min en cada tratamiento. Se precipitan los ácidos nucleicos con 2 volúmenes de etanol puro y centrifugando a 13400 x g/10 min. Se resuspende el sedimento en 100L de agua destilada estéril.

Metodología de extracción de DNA de tejidos embebidos en parafina o Se lava cortes el tejido con xilol, y luego 2 veces con etanol de manera similar a lo estipulado por Lench y col.(*) Los cortes de tejido se resuspenden en 300L de solución amortiguadora TEN (Tris-HCl 0.04M, pH 8.3; NaCl o 0.2M, pH 8.0; EDTA 1mM) con 5 L de proteinasa K y 5.25 L de SDS al 20%, como reportan Ghossein y col. (**) o La solución se incuba a 55 oC durante 4 horas, y se calienta a 100 oC durante 10 min para inactivar la proteinasa K. o El sobrenadante tras la centrifugación a 13000 g x10min, se precipita con 2 volúmenes de etanol absoluto, en presencia d NaCL 0.2M. La solución se incuba a temperatura ambiente x 30min, se recentrifuga a 13000 RPM x 30min, y el precipitado se o resuspende en 40 L de agua destilada estéril.  

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(*) Lench N, Stainer P, Williamson R. Simple non-invasive method to obtain DNA for gene analysis. Lancet 1988; 1(8599): 1356-8 (**) Ghossein RA, Ross DG, Salomon RN, Rabson AR. A search for mycobacterial DNA in sarcoidosis using the polymerase chain reaction. Am J Clin Pathol. 1994; 101:733-7

Metodología aplicada a técnicas de muestreo no invasivas en mamíferos: heces


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Las heces se resuspenden en solución 1 : 2 de etanol absoluto y buffer CTAB (Tris-HCl 0.1M pH8; NaCl 1.4M; EDTA 0.02M; CTAB 2%) teniendo en cuenta que el volumen de heces a resuspender debe contener el suficiente 16 material para una extracción exitosa de DNA. Las muestras se incuban x 2horas a 70 oC, se las deja enfriar a temperatura ambiente y se las centrifuga 14000 RPM x10 min. El sobrenadante se somete a extracción por fenol- cloroformo (*Sambrook et al. 1989). El pellet obtenido se resuspende en 180L de buffer ATL ( Qiagen), completándose la extracción con el kit de Qiagen “DNeasy Blood and Trissue Kit” siguiendo las especificaciones del fabricante. El DNA obtenido se seca a temperatura ambiente, se resuspende en 50-100L de agua destilada estéril, pudiéndose guardar a -20oC. 

(*) Sambrook J, Fritsch EF,Maniatis T . Molecular Cloning: A laboratory Manual 2a Ed-Cold Spring Harbor Press. New York- EEUU 1989.

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Metodología aplicada a técnicas de muestreo no invasivas en mamíferos: pelos – modificación del protocolo de (*)Anderson et al. (2006) por Maximiliano Nardelli y col. Universidad Nacional de Lujan 2011 o

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Se toma 0.5 cm del extremo proximal de unos 10-20 pelos, incubándolos una noche a 55oC en 50L de buffer TNES (Tris-HCl 50mM pH 8; NaCl 100mM, EDTA 2mM; Nonidet P-40 1%) y proteinasa K 2mg/ml. Se calienta la mescla a 94 oC para desnaturalizar la enzima. La eliminación de proteínas se sigue según lo propuesto por Anderson et al (2006)* y se implementa a esto al extracción por fenol-cloroformo (Sambrook et al. 1989)**. El ADN se resuspende en 50-100L de agua destilada estéril y se puede almacenar a -20oC. 

(*)Anderson HM, McCAfferty DJ, Sacchers IJ, McCluskie AE. Non-invasive genetic sampling of Eurasian otter (Lutra lutra) using hairs-2006. Hystrix It. J. Mamin 17;65-77

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(**)Sambrook J, Fritsch EF,Maniatis T . Molecular Cloning: A laboratory Manual 2a Ed-Cold Spring Harbor Press. New York- EEUU 1989.



Metodología aplicada a la extracción de DNA por uñas recortadas en humano 17 o Se obtienen las uñas (utilizando un cortaúñas ordinario) y se las sumerge en alcohol, de 70%. o Se incuban las uñas (150mg aproximadamente) a 55 C x72horas en solución lisis conteniendo EDTA 2mL (0.5M, o pH8.0- Nacalai tesque Inc, Japan), 200mL de proteína K (20mg/mL-Boehringer Mannheim, Germany) y 200mL de SDS al 10% (Valley Biomedical Inc, EEUU). o Se extrae el DNA del sobrenadante por medio de columnas conteniendo una matriz de fibra de vidrio de GFX Genomic Blood Purification Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Función y Principio del Chelex: 

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El Chelex ( Chelex-100 nombre comercial) es una resina preferentemente capturadora de iones metálicos polivalentes en soluciones, muy usada en el campo de la genética molecular, ciencias forenses, detección molecular de diferente especies de bacterias y estudios virológicos, dada la simplicidad y rapidez con la que permite trabajar las muestras. El efecto del Chelex es de prevenir a través de su acción quelante la ruptura del DNA a altas temperaturas catalizada por iones involucrados en las muestras de trabajo. Una aplicación práctica es por ejemplo para extraer DNA a partir de muestras embebidas en parafina (TEP), a continuación se detalla el protocolo donde se trabaja con Chelex-100 para extraer DNA de Mycobacterium tuberculosis de tejidos en TEP: o (*)…El procesamiento de extracción de ADN del corte histológico del bloque de parafina fue llevado a cabo utilizando 150uL de una solucion de Chelex-100 al 5% y calentando a 100 oC por 30 minutos. Luego se centrifugo a 13000 rpm por 10 min y se transfirió el sobrenadante a un microtubo estéril de 0.5 mL limpio, sin tomar la resina quelante para evitar inhibición de la RCP (reacción en cadena de la polimerasa).  (*)tomado de: Yaxsier de Armas y col. Extraccion de ADN de tejidos embebidos en parafina por Chelex 100. VIII Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica- Octubre 2006, sección Patología molecular. http://conganat.cs.urjc.es

Actividades Complementarias: Extracción de RNA 1. Explicar los principios de los reactivos usados para extracción de RNA



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Trizol.- es una solución química usada en la extracción de RNA. El Trizol o Tri-reagent es el nombre comercial que 18

se le da a una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina que se le adiciona a la muestra durante la homogenización mecánica (lisis celular) para una lisis rápida, solubilización de los componentes celulares, inactivación de las RNAasas, separar el RNA ribosomal de los ribosomas y a la vez mantener la integridad del RNA durante el proceso. 

Cloroformo.- la adición de cloroformo al proceso de extracción es para poder limpiar la muestra de cualquier resto

lipídico aun presente y a la vez generar las fases diferenciadores: fase acuosa con el RNA y una fase orgánica (donde se encuentran las proteínas desnaturalizadas), el DNA se queda en una interfase 

Alcohol isopropilico.- es un alcohol incoloro, inflamable, de olor intenso y miscible en agua. Este alcohol secundario

es usado ampliamente en técnicas de extracción de ácidos nucleicos ya que ayuda a precipitar estos ya que no son solubles frente a alcoholes, sin embargo a diferencia del etanol, no es necesario que el isopropanol este frio. 2. Función del DEPC, Tiocinato de g uanidina, urea 

DEPC.- el dietil pirocarbonato (DEPC), es un eficiente inhibidor no especifico de las RNAasas. Es típicamente usado

para tratar agua y soluciones donde es necesario trabajar con RNA no degradado. El DEPC reacciona con los grupos amino, hidroxy y tiol de las proteínas con actividad enzimática como las RNAasas. Cuando se va a trabajar con agua con DEPC, se tiene que autoclavar la misma (120oC x30min) para eliminar cualquier traza el DEPC ya que produce modificaciones químicas a los residuos de purinas (A+G) en el RNA por carboxymetilacion. 

Tiocinato de guanidina.- este compuesto es ampliamente usado en genética molecular por ser un excelente agente

caotrópico, desestabilizante de proteínas en general. Su uso durante los protocolos de extracción de ácidos nucleicos incluye una función de lisador celular así como de prevenir la digestión por RNAasas y DNAasas mediante la denaturación de las mismas.



Urea.- usualmente se le suele acompañar, para las extracciones de ácidos nucleicos, junto a cloruro de litio dando

19 lugar a la inactivación de las RNAasas y permitiendo la desnaturalización con proteinasa K. Después de esto se les suele eliminar en una sola extracción, y los ácidos nucleicos se precipitan con etanol absoluto frio o isopropanol. 3. Investigar otros protocolos y aplicaciones 

Metodología aplicada a la extracción de RNA y DNA simultáneamente a partir de medula ósea en humanos por el kit UMSagen  o o

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Protocolo, usado para extraer RNA y DNA aprovechando las diferentes características de solubilidad en fase orgánica y acuosa.

Las muestras deben estar almacenadas a 4oC. Descongelar la muestra y agitar en vortex y agregar 30L de acetato de sodio, 330L de Fenol acido, 100L de Cloroformo: alcohol isoamílico (49: 1), mezclar en vortex y dejar 10min a -20oC. Centrifugar a 13000 rpm x15min a 4 oC. Recuperar el sobrenadante en otro tubo eppendorf y agregar 500L de isopropanol y mezclar suavemente por inversión. 

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Extraccion de DNA  Sacar el DNA precipitado con la punta de la micropipeta en un tubo eppendorf que contenga 500L de etanol frio 70%.  Centrifugar a 13000 RPMx5min, desechar el sobrenadante y secar el sedimento a temperatura ambiente.  Agregar 200 L de agua destilada estéril y dejar a temperatura ambiente hasta que se disuelva el DNA. Almacenar a 4oC. Extraccion de RNA o  Dejar a -20 C x60min. El tubo que contiene RNA.  Centrifugar a 13000 RPM x15min a 4 oC y decantar el sobrenadante.  Agregar 500L de etanol frio 70%, mezclando por inversión.



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Centrifugar a 13000 RPM x5min a 4 oC. Resuspender el sedimento con 50L de agua DEPC fría, 5 L de acetato de sodio, 100L de etanol absoluto frio; mezclar por inversión y dejar a -20oC por una 20 noche. Centrifugar a 13000 RPM x15min a 4oC y decantar el sobrenadante. Secar tota lmente el sedimento a temperatura ambiente y resuspender el sedimento con 30L de agua DEPC. Preservar a -20oC.

Metodología de extracción de RNA aplicada a plantas – Capsicum annuum L. o o

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El tejido vegetal elegido debe haber estado previamente fijado en nitrógeno líquido a -70oC Colocar 500L del buffer de extracción (tiocinato de guanidina 4M; citrato de sodio 25mM pH 7; Sarcosyl 0,5%solución preparada con agua trata con DEPC y pH ajustado a 8) y 500 L de fenol saturado con TE en un tubo microcentrífuga. Añadir 3,5L de 2-mercaptoetanol y 50L de acetato de sodio 3M. Moler 200 mg del tejido, y transferirlos al tubo preparado anteriormente. Agitar en vortex la muestra e incubar a temperatura ambiente x5min. Añadir 200L de cloroformo- alcohol isoamílico (24: 1), llevarlo al vortex x1min y dejar reposar por 12min a temperatura ambiente. Centrifugar al máximo por 15min. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo. Adicionar 500L de isopropanol y mezclar por inversión. Reposar la muestra x7min a temperatura ambiente. Centrifugar al máximo x10min. Descartar el sobrenadante. Lavar el pellet con 1mL de etanol 75%. Centrifugar al máximo por 5min a 4 oC. Descartar el sobrenadante, Dejar secar el pellet x10min a temperatura ambiente. Disolver el pellet en 200 L de TESAR (10mM Tris-HCl ph7,6; 1mM EDTA; 1% Sarcosyl todo preparado con agua tratada con DEPC). Añadir 200L de aq/CTAB y 200 L de bu/CTAB. Agitar 2 min en el vortex, luego centrifugar a máxima velocidad por 5min a temperatura ambiente. Se observaran fases, remover la fase superior que contiene bu/CTAB y reservar en un tubo nuevo. Re-extraer la capa inferior con 200L de bu/CTAB.


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Remover la capa superior y combinarla con el bu/CTAB reservado. El RNA ahora esta con la sal de CTAB y es 21 soluble en butanol. Añadir 150L de 0.2M NaCl para combinar las fases. Agitar en vortex x30 segundos y centrifugar x5min. Transferir la capa superior conteniendo butanol a un tubo nuevo. Ahora el RNA es una sal de sodio y esta soluble en la fase acuosa (fase inferior). Reservar la fase acuosa. Re-extraer la capa de butanol con 150L y 0.2M de NaCl. Colectar la capa inferior y combinar con la fase acuosa reservada anteriormente. Añadir 300L de cloroformo para combinar las fases. Agitar en vortex por 30 segundos. Centrifugar a máxima velocidad a 4oC x5min, transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Añadir 1/10 volúmenes de acetato de sodio y 2,5 volúmenes de etanol a la fase acuosa para precipitar el RNA. Incubar la muestra a -20oC por al menos 1 hora. Centrifugar a velocidad máxima a 4oC x5min. Secar el pellet a temperatura ambiente y resuspenderlo con agua tratada con DEPC.

Metodología usada para extracción de RNA en la hipófisis de huesos o

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Tomar muestras de aproximadamente 250mg y homogenizar con 3mL de solución a pH7 (isotiocinato de guanidina 4M; citrato de sodio 5mM; Sarcosil 0,5% y mercaptoetanol 0,1M) por 2min. Centrifugar a 12000 g x10min a 12 oC. Calentar el sobrenadante a 65oC por 2 min. Adicionar CsCl solido hasta alcanzar una concentración de 0, 1mg/mL Transferir a un tubo de ultracentrífuga junto a 3mL de solución a pH7 compuesta por CsCl 5,7M en EDTA 0,1M. observar fases. Centrifugar a 60000 g x 12h a 22 oC, retirar el sobrenadante y el precipitado lavarlo con etanol 70% (3x300L) Redisolver en un buffer EDTA 5mM-Sarcosil 0,5%-mercaptoetanol 0,1M (600 L) y extraer (3x 600L) con cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1). Observar fases. Precipitar el RNA con acetato de sodio 3M(57L) y etanol absoluto frio (1,5mL; 2,5 vol) Lavar el RNA separado con etanol 79% (2x 100 L) y disolver en agua el pellet en agua tratada con DEPC (160L).



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Evaluación de la calidad y cantidad de ácidos nucleicos a partir de extractos de ADN y ARN de osteoictios

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