qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyui opasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfgh Extracción de ADN a partir de Sangre S angre Humana jklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvb Universidad Tecnológica de Tecámac nmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwer Biología molecular Ing. Cristian Álvarez Cárdenas * tyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas Aidé Cervantes – David García – Cynthia Ibarra – Marcela Islas – Sandra Gutiérrez – Juan Carlos Ortiz 10 IBT 3 dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzx cvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmq wertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuio pasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghj klzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbn mqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwerty uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdf ghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxc vbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmrty uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdf ghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxc 13/10/2010
EXTRACCION DE ADN SANGRE Objetivo general
Aislar ADN a partir de sangre humana
Objetivo particular
Conocer la técnica y fundamentos generales para la extracción del ADN a partir de sangre.
Fundamentos teóricos y análisis de procedimiento de extracción de ADN a partir de sangre.
La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por romper las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol (etílico para extracción de ADN en saliva y alcohol isopropilico para extracción de ADN en sangre). El núcleo es extraído de la célula por diferencia de presión osmótica entre la célula y el medio, los detergentes orgánicos, destruyen los lípidos al nivel de la membrana plasmática y exponen al ADN en un medio de altas concentraciones de sal que nos permita separar al ADN del resto de los componentes con ayuda de agentes químicos generalmente solventes. La precipitación de restos de membrana y proteínas que contaminen el ADN, nos permite obtener Biomoléculas disueltas, entre ellas al ADN libre de proteínas Histonas y no Histonas. Todas las células, a excepción de las células anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos, contienen ADN en sus núcleos celulares. También se puede encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares diferentes al núcleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material genético y poseer baja actividad de DNAasa. El dodecilsulfato sódico (SDS o NaDS) (C12H25NaO4S) También conocido como laurilsulfato sódico (SLS), es un compuesto tensoactivo iónico, empleado en diversos productos de higiene personal, como pasta de dientes, champú y jabones de baño. La molécula posee una cola de 12 átomos de carbono, adosada a un grupo sulfato, dotando a la molécula de las propiedades antifílicas y básicamente actúa rompiendo enlaces no covalentes en las proteínas, desnaturalizándolas, provocando que estas moléculas proteicas pierdan su conformación nativa. Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del polipéptido. Además, la cantidad de SDS unido es similar para muchas proteínas: una molécula de SDS por cada dos residuo s aminoácidos, correspondiendo a unos 1,4 g SDS/g proteína. Ello proporciona al polipéptido una carga negativa que resulta proporcional a la longitud de la cadena (el número de aminoácidos) y, por tanto, a la masa molecular de la proteína. Este aporte de carga negativa es sustancialmente mayor que la carga original de la proteína. La repulsión electrostática creada por la unión del SDS a la proteína es uno de las causas de que la proteína pierda su conformación nativa, eliminándose de este modo las diferencias en conformación de las diferentes proteínas que han de ser separadas. Los anticoagulantes más comunes son: EDTA: (etilen-diamino-tetra-acetato) Este tipo de anticoagulante es utilizado principalmente cuando se realizan estudios en donde se cuentan células. Citrato de sodio: Generalmente en concentraciones al 3.8 % y ser utiliza comúnmente en estudios de coagulación.
Heparina: Se utiliza tanto en algunos estudios de rutina como especializados. Su presentación puede incluir heparina con concentraciones de sodio o litio. En general, la heparina con tilio es utilizada para estudios de química y la heparina sódica se utiliza para estudios de linfocitos. La Proteinasa K, es una enzima, la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos. La proteinasa K se utiliza habitualmente en biología molecular para digerir las proteínas y eliminar la contaminación de las preparaciones de ácido nucleico. Además inactiva rápidamente las nucleasas de otro modo podrían degradar el ADN o ARN durante la purificación. El paso siguiente consiste en la precipitación de los ácidos nucleicos, ya que el ADN presente en soluciones con alta concentración de sales puede precipitarse mediante la adición de alcohol etílico a dichas soluciones. La solución Isotónica PBS tiene muchos usos, no es tóxico para las células. Puede ser utilizado para diluir las sustancias. Se utiliza para lavar los recipientes que contengan células. PBS se puede utilizar como diluyente en los métodos de biomoléculas en seco, como las moléculas de agua en su interior se estructuran en torno a la sustancia (proteína, por ejemplo) para ser "seca" y se inmoviliza a una superficie sólida . La película delgada de agua que se une a la sustancia previene la desnaturalización u otros cambios conformacionales. Tampones de carbonatos se pueden utilizar para el mismo proposito pero con menos eficacia. La muestra a tratar es necesario que se centrifugue con la finalidad de separar las bases, permaneciendo el DNA en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interface.
Fig. 1. Fases de la separación de ADN Una vez realizada la lisis celular se hace la extracción que consiste en separar en dos fases una orgánica y otra acuosa, (figura 1) a la fase orgánica van las proteínas y lípidos, a la interface las sustancias antipáticas como ciertos lípidos, y en la acuosa los ácidos nucleicos. Se usan sales como NaCl o LiCl para aumentar la solubilidad del DNA en la fase acuosa. Luego, cuando se quiere purificar el DNA, se lo precipita agregando alcohol absoluto , sales y frío, de este modo se cambia la polaridad de la solución acuosa, volviéndose insoluble el DNA, en este caso las sales protegen al DNA. Es importante recordar que el DNA tiene carga negativa por los grupos fosfato , entonces los cationes interactúan con el DNA. Después de extraído el ADN suele ser rápidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remoción , aislamiento y purificación con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la célula de la cual proviene. El estrés o tensión mecánica o físico química, que acompañan los procesos de purificación de las moléculas de ADN deben ser evitadas al máximo y las nucleasas inhibidas.
Factores como los iones Ca2+ y Mg2 son importantes para la actividad del las DNAasas .El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para la extracción y purificación del ADN, atrapa estos iones e impide, de esta forma, la acción de las enzimas que digieren estas moléculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remoción de las proteínas deben ser llevadas a cabo tan rápido como sea posible y en frío. Las nucleoproteínas, son proteínas que aparecen asociadas con los ácidos nucleicos de las células eucariotas; son insolubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica pero solubles en soluciones de alta fuerza iónica ; propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de extracción inicial. Ya que existen múltiples factores involucrados en el proceso de coagulación de la sangre. Los anticoagulantes son sustancias que previenen la formación de coágulos. Existen diferentes tipos de ellos en polvo o líquidos. Deben seleccionarse siempre el anticoagulante apropiado según el estudio que se quiera realizar. Por último en el lavado se utiliza etanol 70%, formando una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se enrolla conforme sale de la solución y también se utiliza para precipitar la solución del ADN. Posteriormente se seca y se re suspende. En conclusión: Es de gran importancia conocer los elementos técnicos como los fundamentos del protocolo de extracción de ADN, además de permitir una interpretación permiten efectuar modificaciones y adecuaciones al procedimiento, que si se hacen acertadamente, se obtienen resultados viables. Lo más importante a tomar en cuenta en esta práctica es como separar el ADN de sustancias no deseadas que se encuentran en las células y evitar que el ADN se desnaturalice. El uso e implementación de este tipo de procedimientos y técnicas conlleva a entender un poco más sobre la importancia e implicaciones que esta molécula biológica tiene para el ser humano y cualquier ser vivo. Así como también, lograr una mejor comprensión de los avances que en su estudio y aplicación ha tenido y seguirá teniendo.
Bibliografía *
LEHNINGER, A.L. 1978. Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura celular. Omega (2ª Ed.). Barcelona, España.
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ALBERT, S. and ET AL. 1983. Molecular biology of the cell. Garland. New York. London.
