Enzimologí a Clí nica nica (Tema 17)
Enzimologí a Cl Enzimologí Clí í nica.T nica.Tnica.T-17 1. Los enzimas como catalizadores. • Estructura y naturaleza de los enzimas Comportamiento cinético cinético de los enzim nzi mas • Comp
2.- Medida de la actividad enzim ática. 2.• Fundamento. • Factores que modifican la actividad enzimática. edida de la activida activi dad d enzimática de mues muestras clínicas clí nicas • M edi entación. Optimizaci Optimización ón de las las condi condicione ciones de medida. medida. • I nstrumentación. • Sistemas acoplados.
3.- Los enzimas como marcadores de lesi ón tisular. 3.nzi mas como marcadores de daño celul celular ar • Enzim • Distribución tisular de los enzimas • Patrón isoenzimático.
4.- Enzimas sé 4.séricos de importancia diagnó diagn óstica clí clínica. inasas (ALT, AST) • Transamina il asa • α−A milas fosfoquinasa(CPK sa(C PK)) • Creatín fosfoquina sa ácida ida (ACP (A CP)) • Fosfatasaác Fosfatasaalcali saalcalina na (AL P) • Fosfata glutamil trans transpe peptidasa(GGT sa (GGT)) • Gama glutam L áctico ác tico deshidroge des hidroge nasa na sa(L (LDH) DH) • 5’-nucleotidas idasa (NTP) (NT P) • 5’-nucleot
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1. Los enzimas como catalizadores. • Naturaleza proteica de los enzimas
1. Los enzimas como catalizadores. El que una reacción discurra más o menos aprisa está en función no solo del estado energético de los compuestos antes y después sino también del propio mecanismo de la reacción.
Durante el curso de la reacción es necesaria la formación de intermedios reactivos cuyo nivel energético es superior a la energía media de las moléculas de los reactivos, lo que en la práctica hace que la formación de esos intermediarios suponga una barrera energética que impide que la reacción avance.
Cuanto mayor es el nivel energético de los intermedios reactivos tanto menor es la velocidad.
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1.2 Velocidad de una reacció reacción La velocidad de una reacción (S → P) se define como: v=-d[S]/dt =d[P]/dt S
P
Δ [S] Δ T
Δ [P] Δ T
1.3 El Comportamiento cinético de las reacciones catalizadas por enzimas
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1.4 Velocidad de una reacci ón catalizada por un enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima con cinética enzimática michaeliana es proporcional a la concentración de substrato, pero es saturable y alcanza un máximo. Reacción no enzimática
“ Actividad Actividad “ “ y y “ cantidad cantidad ” ” de un enzima en una muestra. • Actividad de un enzima: moles transformados por unidad de tiempo. Se expresaen Unidades Internacionales (μmolestransformados/seg). • Actividad específica de un enzima: actividad enzimática por masa de enzima (μmoles/seg/mg proteína) • Concentración: cantidad de enzima por unidad devolumen, o en su defecto
cantidad deactividad enzimática por unidad de volumen
En bioquímica clínica se recurre a expresar la cantidad de enzima de una muestra en forma de Unidades de actividad enzim á ática por tica por ml. ml.
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2.- La medida de la cantidad de un enzima en una muestra.
• Fundamento. • Optimización de las condiciones de medida. • Medida de la actividad enzimática de muestras clínicas • Instrumentación. • Sistemas acoplados
2.1 Medida de la “cantidad ” de enzima presente en una muestra:
Medida de la cantidad de enzima (proteína) presente en la muestra. Se utilizan métodos inmunológicos
Medida de la actividad catalítica correspondiente al enzima presente en la muestra. Se utilizan métodos espectrofotométricos
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2.1 Medida de la actividad enzim ática. S
La velocidad de una reacción se puede expresar bien como moles de substrato consumidos, o bien como moles de producto formado por unidad de tiempo: v= Δ [S]/ Δ T = Δ [P]/Δ T
La
formación de producto o desaparición del compuesto de partida puede monitorizarse espectrofotométricamente midiendo cambios en la absorción óptica de la solución que contiene los substratos y el enzima
Color
P
Δ [S] Δ T
Δ [P] Δ T
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Unidad de actividad enzimá enzimática se define como aquella cantidad de enzima capaz de transformar 1 μmol de substrato por minuto. minuto
Tiempo
2.2 Medida de la actividad enzim ática... Las
condiciones experimentales para la medida de la actividad enzimática deben ser tales que el grado de conversión de substratos sea pequeño en términos relativos, de manera que su concentración global apenas cambie. Si la concentración de substrato está por encima de la Km (> 5x), el enzima estará actuando a su velocidad máxima; aun habiéndose consumido una fracción del substrato, la velocidad de reacción del enzime verá muy poco afectada. Si las condiciones de velocidad máxima de la reacción se mantienen durante la duración del ensayo, existirá una relación lineal entre la velocidad de reacción y la actividad enzimática.
Δ
V≈0
Si [S] >> K M
V ≈ V max Si [S]= constante
V ≈ cte.
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2.3 Medida de la actividad enzim ática de muestras biológicas.
Por ejemplo, la actividad LDH se mide mediante la reacción: Piruvato + NADH → Lactato + NAD+
Cada mol de piruvato que es convertido en lactato consume un mol de NADPH, que se transforma en NAD +, por lo que la velocidad de la reacción es equivalente a la velocidad de formación de lactato, de NAD + o a la desaparición de piruvato o de NADPH
Δ [S] Δ T
S
P
Δ [P] Δ T
El NADH absorbe luz de 340 nm, cosa que el NAD + no hace. La absorbancia a 340 nm es proporcional a la concentración de NADH (Ley de Beer), y cambios en la absorbancia a 340 nm se corresponde a cambios en la concentración de NADH.
a i c n a b r o s b A
Absorbancia = ε x concentración x
recorrido óptico de la luz A
concentraci ó ón n (molar)
NAD(P)H
NAD(P) +
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A medida que avanza la reacción y el piruvato se convierte en lactato, hay un consumo de NADPH, y como consecuencia de ello una disminución en la absorbancia a 340. La velocidad de la reacción se mide por la variación de la absorbancia con el tiempo con un espectrofotómetro.
Δ Absorbancia m n 0 4 3 a a i c n a b r o s b A
340 nm Ä
Moles consumidos de NAD(PH)/seg
Ä
actividad enzimática
Tiempo
2.3 Medida de la actividad enzimática de muestras biológicas. En primer lugar se preparan los reactivos y se mezclan en una cubeta de espectrofotómetro, de manera que las concentraciones de los substratos (Piruvato y NADH) estén por encima de sus respectivos K M. El enzima se añade al añadir la muestra de suero. Se mide entonces la velocidad de reacción como moles consumidos de NADPH por minuto. Se expresa este valor en Unidades de Actividad Enzimática (IU) Se refiere dichas unidades al volumen que se había añadido de suero Se expresa el resultado final como Unidades de actividad enzim á enzim á tica tica por ml de suero.
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3.- Los enzimas como marcadores de lesión tisular (I) 3.1 Caracterí Características de los enzimas utilizados como marcadores:
• Los enzimas que se utilizan en el diagnóstico son enzimas intracelulares, cuya concentración en plasma es muy baja. • Su relación concentración plasma/concentración tejidos es <1:1000 • La presencia de niveles elevados de enzimas en el suero implica que ha habido lesión (muerte?) celular lo que permite la salida a la circulación de enzimas normalmente confinados en el interior de las células. • La cantidad deactividad enzimáticamedibledepende de su liberación al medio, de la estabilidad del enzima, de su velocidad de eliminación. • Se trata de enzimas (o isoenzimas) que seexpresan mayoritariamente en un determinado tejido, pudiendo servir de marcador tisular específico.
3 Los enzimas como marcadores de lesi ón tisular (II) ¿por qué qué aumenta su nivel en plasma...?: •Necrosis delos tejidos •Aumento del catabolismo celular (reparación tisular, cáncer) •Aumento concentración intracelular (inducción) •Obstrucción en la salida exocrina (α-amilasa)
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3 Los enzimas como marcadores de lesi ón tisular (III)
3.2 Distribució Distribución tisular de la actividad enzimá enzimática de enzimas con significació significación clí clínica
Transaminasas en distintos tejidos 60 50 g / s 40 e d a 30 d i n 20 U 10 0
AST/GOT ALT/GPT AST: mitocondria y citosol ALT: citosólica
Hígado
Corazón Músculo Cerebro
Riñón
Páncreas Pulmón Hematíes
10
Actividad tisular fosfatasa ácida 1200 1000 g800 / s e d600 a d i 400 n U 200
0 Próstata
Riñón
Páncreas
Fosfatasa alcalina en tejidos 60
Duodeno 50 g 40 / s e d a 30 d i n 20 U
10
Hueso Hígado
Riñón
Próstata
0
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Creatí n fosfoquinasa en tejidos 2500
M.esquel. 2000 g / s 1500 e d a d i 1000 n U 500
Cerebro Miocardio M. liso
Riñón Hígado
0
Láctico deshidrogenasa en tejidos 160 140 120
g / s 100 e d a 80 d i n 60 U 40
M. esquel Hígado Miocardio Riñón Ganglios Páncreas Eritrocitos Pulmón
20 0
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3.- Los enzimas como marcadores de lesión tisular (IV)
3.3 Patró Patrón isoenzimá isoenzimático de algunos enzimas con significaci ón clí clínica
Estructura de la CPK y sus isoenzimas:
CPK 1 =b2
CPK 2 =mb
CPK 3 =m2
Cerebro
corazón
m. esquelético
-
+ 3
2
1
Muestra suero La CPK está constituida por dos subunidades. Existen dos tipos de subunidades. diferentes, lo que explica la existencia de tres isoformas son distintas. En los los tejidos está presente una isoforma distinta.
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Estructura de LDH y sus isoenzimas: isoenzimas:
La LDH está constituida por cuatros subunidades. Existen dos tipos de subunidades. diferentes, lo que explica la existencia de 5 isoformas son distintas que poseen una movilidad electroforética diferente que permite distinguirlas. En los los tejidos está presente una isoforma distinta.
LDH1 =α4 LDH2 =α3β1 LDH3 =α2β2 LDH4 =α1β3
-
LDH5 =β4
5
+ 4
3
2
1
Distribución de los isoenzimas de láctico deshidrogenasa en tejidos 200 150 100 50 0
α 4 ( 1 ) α 3 β 2 ) β ( 2 α 2 β 3 ( 3 ) ( 4 ) α ) β 4 ( 5
o d a g í H
o i d r a c o i M
s o t i c o r t i r E
n o l ñ e i u R q s e . M
g / s e d a d i n U
n s ó a l m e r u c P n á P
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Patrón isoenzimático de la LDH de suero en infarto de miocardio y en hepatitis aguda
3.3.- Los enzimas como marcadores de lesió lesión tisular (II) Magnitud del dañ daño celular •
Citoplasmático: LDH, ALT, CPK, AP
•
Organelas (mitocondrial, microsomal): AST, GT, 5’ nucleotidasa
Localizació Localización del dañ daño celular •
Muy pocos enzimas son específicos de un solo tejidos. Alternativas: •medida de más de un enzima (p. ej. “perfil hepático”) •isoenzimas
Alteraciones inespecí inespecíficas de enzimas sé séricos. •
Factores dependientes de la edad y sexo
•
Factores atribuibles a la conservación de las muestras
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4.4.- Enzimas sé séricos de importancia diagnó diagn óstica clí clínica (I). •Aspartato aminotransferasa(AST/GOT) •Valores normales: <40U/ml •Aumento importante: Infarto emiocardio, hepatitis, traumatismos •Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, hemólisis
•Alaninaaminotransferasa(ALT/GPT) •Valores normales: <50 U/ml •Aumento importante: Shock, hepatitis •Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia,
• α-amilasa • Valores normales: <50U/ml •Aumento importante: pancreatitis aguda y crónica, cáncer de páncreas. •Aumento moderado: parotiditis, algunos carcinomas, procesos parapancreáticos
(gastritis, úlcera duodenal, peritonitis, obstrucción intestinal.
4.4.- Enzimas sé séricos de importancia diagnó diagn óstica clí clínica (II). •Creatín fosfoquinasa(CPK ) •Valores normales: <160U/ml en varones y <130U/ml en mujeres •Aumento importante: Infarto de miocardio (isoenzimaCPK-1) •Aumento moderado: miopatías, distrofia muscular, accidente cerebro-vascular
•Fosfatasaácida (ACP) • Valores normales: <2 U/ml • Aumento importante: hipertrofia o cáncer de próstata (isoenzimaprostático),
hiperparatiroidismo, Hodkin, enf. Paget • Aumento moderado: enf. Gaucher, insuficiencia renal aguda, hepatitis, ictericia
obstructiva
• Fosfatasaalcalina(ALP) • Valores normales: 85-190U/ml en el adulto. Hasta 500U/ml en niños en desarrollo • Aumento importante: ictericia obstructiva, colelitiasis, neoplasia de vías biliares, cirrosis, hepatomas • Aumento moderado: neoplasias óseas osteogénicas, osteomalacia, enf. Paget, hiperparatiroidismo
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4.4.- Enzimas sé séricos de importancia diagnó diagn óstica clí clínica (III). • Gamaglutamil transpeptidasa(GGT) •Valores normales: <35U/ml en varones y <25U/ml en mujeres •Aumento importante: Hepatitis vírica, obstrucción biliar, metástasis hepáticas, enf. alcohólica •Aumento moderado: infecciones que afectan al hígado (citomegalovirus, mononucleosis infecciosa)
•Láctico deshidrogenasa(LDH) • Valores normales: <120-230 U/ml • Aumento importante: infarto de miocardio (L DH1), hepatitis víricas (LDH 4, LDH5) • Aumento moderado: hemólisis, accidente cerebro-vascular, distrofia muscular
• 5´nucleotidasa(NTP) • Valores normales: <9U/ml en el adulto. • Aumento importante: colestasis intra o extrahepática, enfermedades hepatobiliares, cáncer hepático • Aumento moderado:
Enzimas séricos en la enfermedad cardiaca
• Creatín fosfoquinasa (CPK) < 160 U/L (Isoenzima “mb”) • Láctico deshidrogenasa (LDH) < 120-230 U/L; isoenzima 1 (15-25%). • Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L Tras el infarto, hay una liberación de proteínas intracelulares de las células dañadas. La primera en ser detectada es la troponina (5-10 h post infarto), seguida de la CK-MB (pico a 1 día), y finalmente la LDH, cuyo máximo se alcnza den los 2-3 días post infarto
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Enzimas séricos en la enfermedad hep ática
• • • • • • •
Alanina aminotransferasa (ALT; GPT) < 50 U/L Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L Lactato deshidrogenasa < 90 U/L (isoenzima 5) γ glutamil transpeptidasa (GGT) < 50 U/L Fosfatasa alcalina < 70 U/L Fosfatasa ácida < 0.6 U/L 5’ nucleotidasa < 5 U/L
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