UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA G UATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA DEPARTAMENTO DE CITOHISTOLOGÍA INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS Práctica 7
1. Introducción La técnica ELISA (ensayos (ensayos de inmunoabsorbencia inmunoabsorbencia ligada a enzimas) se basa en la detección detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción marcada enzimáticamente cuyo producto, puede ser medido espectrofotométricamente. espectrofotométricamente. La cantidad de antígeno antígeno se determina determina comparando la la curva estándar generada con cantidades conocidas del antígeno. Ventajas: versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre, es fácil de adaptar adaptar a analizadores analizadores automáticos. Este se caracteriza caracteriza por ser un método cuantitativamente exacto exacto por la medición medición de la velocidad de de la reacción y la duración de la reacción en un instante fijo único Desventajas: para adaptarlo a analizadores automáticos se necesitan de reactivos muy purificas, lo que aumenta el costo de las pruebas. 2. -
Objetivos Conozca los principios en los que se basa la prueba de ELISA Se familiarice con el equipo utilizado para la elaboración del la prueba de ELISA. Conozca la importancia de este tipo de pruebas y su aplicación en el ámbito de la medicina.
3. Antecedentes Dispositivos Empleados En ELISA Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de absorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de ´screeningµ masivo de los sistemas robotizados (HTS, High throughput system). Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.
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Fases de un ensayo ELISA Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes: 1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.
3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
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4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. Tipos de ensayos ELISA Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales, o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes. La versión más común de ELISA es el ensayo sandwich. - Ensayo directo: (Ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, etc.) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido). - Ensayo indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos. - Ensayo sandwich: (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
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Aplicaciones: Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc. Enzima Sustrato Tampón Estas enzimas son utilizadas en la etapa de detección, las cuales unen de manera covalente a mAbs (anticuerpos monoclonales), sin afectar la capacidad de unión a antígenos del anticuerpo, o bien, sin inhibir la actividad de la enzima. Una gran variedad de sustratos se puede incubar con estas enzimas para generar productos de color susceptibles de cuantificación mediante espectrofotómetros con placas de microtitulación. Las enzimas más comunes empleadas en la etapa de detección son: peroxidasa de suero de caballo y la fosfatasa alcalina. A continuación se describe la preparación de las enzimas más comunes: HRP (peroxidasa de rábano) OPD 10 mg/25 mL de tampón citrato sódico 0.15 M pH 5; añadir microL de 30% peróxido de hidrógeno 30% AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampón dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1 mM cloruro de magnesio TMB (tetrametil benzidina) 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampón citrato sódico 0.1M pH 6; añadir 5 microL de peróxido de hidrógeno 30% y
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4. -
Materiales Alcohol al 70% Algodón Beaker con cloro al 5% Cloro al 5% Kit de reactivos para ELISA
5. Procedimiento - Agregar 100 uL (4 gotas) de control positivo, control negativo y suero del paciente en los pozos siguientes: Control positivo A1 y B1 o Control negativo C1 y D1 o Muestra de paciente E1 y F1 o - Agregar 100 uL (4 gotas) de reactivo de conjugado en todos los pozos (A1 al F1) - Incubar durante 20 minutos - Lavar tres veces cada pozo con solución buffer de lavado
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Agregar 100 uL (4 gotas) de reactivo de cromógeno (sustrato) Incubar durante 20 minutos Interpretación: Positivo: cambio de color amarillo o Negativo: cambio de color a azul o
6. Cuidados y otros aspectos relevantes de seguridad Recuerde que las muestras de pacientes son potencialmente infectivas, por lo que debe observar las medidas universales de bioseguridad. Aplique también las medidas de bioseguridad en el descarte de los materiales. 7. Formato de presentación de resultados Presentar los resultados en forma escrita, con una discusión de los mismos. 8. Cuestionario Indique cual es la función de los siguientes pasos en la prueba de ELISA - Incubación inicial de la muestra en el pocillo - Lavados - Adición del conjugado - Adición del cromógeno 8.2 Mencione por lo menos cinco aplicaciones de la técnica de ELISA: - Directa - Indirecta - Tipo sándwich 8.3 Defina que es una prueba de ELISA de primera, segunda, tercera y cuarta generación 9. Bibliografía - Parslow t, Stites d et al. Inmunología básica y clínica 10 Ed. 2002. Editorial El manual moderno México. P.917 (Pág. 254 ² 257). - HSV IgG (Prueba de ELISA para detección de anticuerpos IgG anti-Herpes simplex 1 en suero humano) Disponible en http://www.biokitdemaracaibo.com/tecnicas/elisa/elhsv1g.pdf . Fecha de consulta septiembre de 2009.
