ELEKTROFORESIS GEL
I. TUJUAN
1. Mempelajari teknik elektroforesis gel untuk mengetahui ukuran fragmen DNA tanaman, darah dan plasmid. 2. Mengetahui dan memahami prinsip kerja elektroforesis gel. II. TEORI
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Bowen 2000: 1). Elektroforesis gel adalah teknik memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel dibantu dengan tenaga listrik (Anonim ?: 1). Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Bowen 2000: 1). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings 1994: 215). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen 1999: 280). Aplikasi elektroforesis dapat digunakan dalam uji paternitas dan
identifikasi pelaku kejahatan (DNA fingerprinting). Elektroforesis juga berperan dalamhuman genome project (Anonim ?: 3). Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk. 2002: 396--397). Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu: 1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer. 2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. 3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar. (Davis dkk. 1994: 151). Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu: 1. Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar. 2. Konsentrasi gel Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar. 3. Bentuk molekul Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat. 4. Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.
5. Pori-pori gel Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA. 6. Voltase Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA. 7. Larutan buffer elektroforesis Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA. (Wolfe 1993: 127; Bowen 2000: 3-4). Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contohmarker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb. Penggunaan DNA marker tersebut dikarenakan molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran 110--20.000 pb. (Birren & Lai 1993: 82; Martin 1996: 77). Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari: 1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa. 2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa. 3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa. 4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis. Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren & Lai 1993: 79--81). Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat
disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell 1994: 299--310 & 500--501; Fairbanks & Andersen 1999: 278).
III. ALAT, BAHAN DAN CARA KERJA
A. ALAT
Alat yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah aparatus elektroforesis yang terdiri dari tray, comb, chamberdan sumber listrik; sarung tangan karet; mikropipet dan tips; alat dokumentasi gel (gel doc) merek BIORAD tipe XR. B. BAHAN
Bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah bubuk agarosa 1 gr; running buffer; loading buffer; parafilm; sampel DNA (produk PCR); Etidium bromida (EtBr); DNA marker (lambda DNA/Hind III). C. CARA KERJA
1. Gel agarose dibuat (telah dilakukan oleh asisten) dengan campuran 2 gr agarose + 200 ml 1x TBE, dididihkan dan ditambahkan etidium bromida 2 L dicampur dengan baik, kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan combnya dan dibiarkan sampai mengeras. 2. Gel dimasukkan kedalam electrophoresis chamber dan ditambahkan larutan running buffer serta etidium bromida. 3. Sampel DNA hasil PCR dicampurkan dengan loading bufferkemudian dimasukkan ke dalam well pada gel dengan menggunakan mikropipet. 4. Marka DNA dimasukkan. 5. Penutup electrophoresis chamber dipasang dan power supplydinyalakan. 6. Setelah pewarna bergerak sampai bagian ujung gel, gel dikeluarkan dan dilihat dengan sinar UV.
IV. HASIL PENGAMATAN A. SAMPEL DNA TANAMAN
Agarose 0,8%, 100 volt, 1µl/ml EtBr
Keterangan : A. DNA Marker C. DNA tanaman
B. Well D. Gel
B. SAMPEL DNA DARAH
Agarose 1%, 100 volt, 1µl/ml EtBr
Keterangan: A. DNA Marker B. DNA darah C. Well D. Gel
C. SAMPEL DNA PLASMID
Gal Agarose 1%, 100 volt, 0,1µl/ml EtBr
Keterangan: A. DNA Marker B. DNA plasmid C. Well D. Gel
V. PEMBAHASAN
Praktikum elektroforesis gel menggunakan gel agarosa. Gel agarosa diperoleh dari rumput laut dan biasanya digunakan dalam konsentrasi 0,5--2%. Alasan memakai agarosa dibandingkan poliakrilamida adalah agarosa mudah untuk disiapkan karena proses pembuatannya mudah. Gel agarosa dibuat dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer, kemudian dipanaskan dan tunggu sampai mengeras. Gel agarosa juga bersifat non-toxic (Bowen 2000: 1). Selain itu praktikum elektroforesis gel juga menggunakan alat-alat yang mempunyai fungsi dan peranan masing-masing. Alat-alat tersebut adalah mikropipet, apparatus elektroforesis, power supply, sumber sinar UV, dan sarung tangan lateks. Mikropipet berfungsi untuk memindahkan sampel dan larutan lainnya dari tubeke dalam wellwell pada aparatus elektroforesis. Apparatus elektroforesis terdiri atas comb (sisir) yang membentuk well (sumur) pada gel agarosa, tray yang merupakan wadah cetakan gel, danchamber yang merupakan medium tempat berlangsungnya proses elektroforesis. Power Supply (DC) sebagai sumber energi untuk aparatus elektroforesis. Sumber Sinar UV berfungsi untuk membantu mengamati hasil band yang tampak sehingga terlihat lebih jelas. Sarung tangan lateks berfungsi untuk melindungi tangan agar tidak bersentuhan langsung dengan etidium bromida yang bersifat karsinogenik atau penyebab kanker (Birren & Lai 1993: 79--81). Praktikum elektroforesis gel dimulai dengan pembuatan gel agarosa. Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarosa karena dilakukan oleh asisten praktikum. Secara umum, proses pembuatan gel agarosa dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer, dipanaskan di dalam microwave, tambahkan etidium bromida, dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarosa yang digunakan sebanyak 1 gr dan larutan running buffer TBE (Tris- Borate- EDTA) sebanyak 100 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Bowen 2000: 3). Penambahan etidium bromida dilakukan dengan tujuan mewarnai asam nukleat. Etidium bromida adalah mutagen dan harus ditangani dengan hati-hati. Penanganannya harus dilakukan dengan sarung tangan karet (Bowen 2000: 4). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke
dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner et al. 1991: ?). Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 80 Volt selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Bowen 2000: 4). Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA hasil amplifikasi lewat proses PCR dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Bowen 2000: 3). DNA amplifikasi yang dipindahkan hanya DNA khamir dan plasmid. Hal tersebut berkaitan dengan terbatasnya jumlah well yang ada. Pemindahan sampel DNA hasil amplifikasi dilakukan oleh dua orang praktikan secara bergantian. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak “meluber” ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin 1996: 9). Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik. Gel dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna dan dilihat dengan sinar UV. Hasil dokumentasi dilakukan dengan gel doc. Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis. Gel doc yang digunakan bermerek BIORAD tipe XR. Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk. 1994: 157-158) DNA marker yang digunakan saat praktikum adalahlambdaDNA/Hind III. DNA marker tersebut mencakup delapan fragmen DNA (125 bp-23130bp) dan digunakan dengan alasan dapat melihat pasangan basa yang lebih banyak dibandingkan DNA marker yang lain (Davis dkk. 1994: 157--158).
Hasil pengamatan elektroforesis pada sampel darah praktikan tidak memperlihatkan adanya band-band meskipun telah dirunning berulang kali, namun pada sampel darah yang diambil dari asisten memperlihatkan band-band. Sampel 1 sampai sampel 4 merupakan sampel darah asisten, sedangkan sampel 5 sampai sampel 8 merupakan sampel darah praktikan. Hasil elektroforesis DNA tanaman dengan gel agarosa 1% tidak menunjukkan adanyaband, baik paralel 1 maupun paralel 2 sehingga asisten melakukanloading ulang dengan gel agarosa 0,8% dan dijadikan dalam satu gel dengan ukuran comb yang lebih kecil. Hasil perlakuan tersebut memperlihatkan band berada di atas marker namun tampak kurang jelas. Hasil elektroforesis DNA plasmid terlihat band hanya pada sampel DNA plasmid kelompok 3 dan 4, sedangkan pada sampel DNA plasmid kelompok lainnya tidak menunjukkan adanyaband-band Hasil elektoforesis gel yang band-bandnya tidak terlihat dan kurang jelasnya bandband yang terbentuk menyebabkan hasil tersebut tidak dapat digunakan untuk mengukur ukuran fragmen DNA. Hal tersebut kemungkinan dikarenakan banyak faktor, antara lain proses pengisolasian yang tidak benar, proses PCR yang kurang bekerja, keterbatasan fasilitas yang tersedia, dan telah terkontaminasinya sampel DNA. Kekurang telitian praktikan dalam proses pengerjaannya pun menjadi faktor ketidakberhasilan praktikum.
VI. KESIMPULAN
1. Ukuran fragmen DNA dapat diketahui dengan teknik elektroforesis gel. 2. Prinsip kerja elektroforesis adalah pergerakan molekul organik dari kutub negatif ke kutub positif berdasarkan ukuran fragmen. III. DAFTAR ACUAN
Anonim. ?. Gel Electrophoresis. ?. www.bergen.org. 27 April 2007,pk.17.10.
Birren, B. & E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc., San Diego: xviii + 235 hlm. Bowen, R. 2000. Principles of gel electrophoresis. 3 Januari 2000: 4 hlm.
http://www.vivo.colostate.edu. 27 April 2007, pk. 17.50.
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Terj. dari BIOLOGY oleh Lestari, R, dkk. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm. Colorado State University. 2000. Principle of gel electrophoresis. 3 Januari 2000: 1.http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbook/genetics/biotech/gels/principles.html, 16 Mei 2008, pk. 08.30. Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm. Faibanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life.
Brooks/Cole
Publishing Company, New York: xix + 820 hlm. Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics.
8th ed. John
Wiley & Sons Inc., New York: xviii + 713 hlm. GenScript Corp. (?). Marker Lambda HindIII. (?): 1 hlm. http://www.genscript.com/site2/images/MM1212.jpg, 16 Mei 2008, pk. 08.25. Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood Cliffs: xvi + 773 hlm. Martin, R. 1996. Gel electroforesis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers
Ltd., Oxford:
xiii + 173 hlm. Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers, New York: xvi + 528 hlm. TerritorioScuola. (?).Gel electrophoresis apparatus. (?): 1 hlm. http://commons/thumb/a/a6/Gel_electrophoresis_apparatus.JPG/288pxGel_electrophoresis_apparatus.JPG, 16 Mei 2008, pk. 08.40. Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm.
Tinjauan pustaka Untuk mengetahui kemampuan hidup mikroorganisme dalam media yang mengandung logam berat, maka dilakukan pengjitungan jumlah sel mikroorganisme yang diinokulasi pada media cair dengan konsentrasi Cr(VI) 0 ppm dan 10 ppm selama 16 jam. Biakan yang tumbuh diencerkan beberapa kali pengenceran 10-5 dan 10-6. hasil pengneceran ditumbuhkan pada media LB padat sebanyak 100 µl, dan diinkubasi lagi selama 16 jam suhu 37 ºC. Koloni yang tebentuk dihitung dengan colony counter dan dihitung jumlah sel mikrooganisme dalam satuan sel/ml (Hadioetomo, 1993). Elektroforesis dikatakan sebagai analisis yang ideal untuk memurnikan komponen protein dari campuran sampel dengan cara penambahan medium yang dapat mengikat protein selama elektroforesis. Metode terbaik dalam pemurnian protein dengan tehnik elektroforesis adalah dengan bahan polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Gel poliakrilamid merupakan larutan dari akrilamid dan bisakrilamid (Hames, 1990; Matsudaira, 1993; Davis,et.al, 1994). Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari campuran polypeptida (Hames & Rickwood, 1990). Marker protein yang digunakan memiliki rentang berat molekul 212 kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan dan intensitas warna yang lebih besar dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap variaetas disebut protein mayor (Wijaya & Rahman: 2005). Penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi dari protein, terutama ikatan disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS juga membungkus rantai protein yang tidak terikat dengan muatan negatif yang sama membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS protein mempunyai densitas muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya berdasarkan ukuran protein (Wijaya & Rohman, 2005). Alasan elektroforesis digunakan dalam penelitian ini karena memiliki peran sangat penting dalam proses pemisahan molekul-molekul biologi, khususnya protein. Karena disamping metode tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer, tetapi juga sangat sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil (Bachrudin, 1999). Protein yang dialirkan dalam medium yang menagndung medan listrik maka senyawa-senyawa yang bermuatan akan bergerak dalam larutan sebagai akibat dari sifat polaritas yang berlawanan, maka mobilitas suatu molekul meupakan fungsi dari bentuk, ukuran molekul, dan besar tipe muatan. Pembahasan Elektroforesis Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatukutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada
bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengangaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Jenis elektroforesis Perangkat elektroforesis gel Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam danpartikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks.Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. Banyak molekul biologis seperti asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam-asam nukleat memiliki gugus yang dapat engion sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+) atau anion (-). Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi muatan. Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medanlistrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika system koloid bermuatan negative, maka partikel itu akan menuju electrode positif Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifatsifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
Fe = qE, F= gaya Lorentz, q= muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai. Jenis Elektroforesis 1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. 2. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. Medium Pendukung Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu. Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa. 1. Cellulose asetat 2. Larutan Buffer Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu : - Komposisi => Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat. - Konsentrasi => Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M. - Ph => Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah, sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam aminoyang
memiliki sifat asam dan basa 3. Medan elektrik Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam medium. - Voltase => Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion. - Aliran listrik => Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya. - Tahanan => Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer. Dalam hasil praktikum yang dilakukan dihasilkan pembahasan seperti ini Pembuatan Jel Horisontal Alat dan bahan yang di butuhkan seperti sisir, cetakan, tempat jel, tutup berventilasi, tegangan 25 volt, 50 volt, 100 volt, 135 volt. Pembuatan horizontal => bahan yang digunakan dari agarosa (dari rumput laut/ agar2 yang telah dip roses lagi) hal ini dilakukan menggunakan agarose karena padi dan agar – agar mudah retak atau patah. 0,8% sampai dengan 2% agarose ( tergantung berat molekul ) dibawah 0,8% mudah lunak sehingga perlu di ekstrak. Etilium bromide( ditambahkan pada agarose atau washing buffer pada akhir pembuatan jel ). Mencetak pada tempat cetakan yang sudah di siapkan, mendiamkan 15 sampai 30 menit, sampai jel membeku. Mengambil sisir dalam cetakan. Ambil jel dan meletakkan pada tempatnya ( yang horizontal ). Memasukkan running buffer ( supaya tidak terbentuk gelembung udara pada sumuran). Apabila ada gelembung udara, otomatis berpenggaruh pada pemasukan samprl. Memesukan sampel pada sumuran ( pada loading sampel). Ditambahkan pewarna BPB/BTB (ditambahkan pemberat agar turun kesumuran) hal ini adalah teknik loading buffer. Ditambahkan marker di akhir pembuatan jel. Menutup dan pasang arus listrik setelah running lepas tutup dan ambil tempat jel. Masukan washing buffer ( kira – kira selama 15 menit). Memasukan UVilluminator. Pembuatan jel vertikal Alat dan bahan yang dibutuhkan plate(kaca) kecil 1mm, plate (kaca) besar 3mm ada speacer. PAGE SDS PAGE, urea. Metodenya yang digunakan sparating jel bagian bawah. stacking bagian atas (untuk sampel) Pembuatan vertical => 10% sampai 12,5% atau 5% sampai 15% untuk pembuatan jel vertical, stacking jel kosentrasinya 4% dimasukan. Merendam jel membutuhkan larutan staning dan destining. Yang larutan staning membutuhkan 12jam. Metodenya hampir sama dengan pembuatan jel yang horizontal. Kesimpulan dan saran Kesimpulan
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik .
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks.
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Saran
Dalam praktikum setidaknya penjelasan demi penjelasan harus diperhatikan, karna bagi kita dalam praktikum ini masih banyak yang belum dimengerti. Daftar Pustaka Paper Electrophoresis. Image from http://www.funsci.com Wijaya. S.K.S & Rohman, L. 2005. Fraksinasi dan Karakterisasi protein Utama Biji Kedelai.Fakultas MIPA Universitas Jember Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: UI Press Bachrudin. Z. 1999. Petunjuk Laboratorium: Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein. PAU Bioteknologi: UGM Yogyakarta. Hames, B.D & Rickwood.1990. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington: Robert E Krieger Publishing Company Matsudaira, P. 1993. A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing. 2ndEd. California: Academic Press. Inc Davis, P.H dan V.H Heywood. 1963.Basic Methods in Molecular Biology. 2nd Ed. Conecicut: Appleton & Lange. Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group. http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular
TUJUAN 1. Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis. 2. Mengetahui cara mengukur fragmen DNA. DASAR TEORI Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012). Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan
prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010) Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999). Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbell dkk, 2002). Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu: 1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer. 2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. 3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar (Davis dkk. 1994). Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).
Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan (di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010). 1. 2. 3. 4.
Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari: Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarose. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarose. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis (Birren and Lai, 1993). Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993). Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999). Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan, 2011).
ALAT DAN BAHAN 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
1. 2. 3. 4. 5. 6.
1. 2. 3. 4. 5. 6.
1. 2. 3.
ALAT Satu set alat elektroforesis Mikropipet dan tip Gel Doc Power Supply Parafilm BAHAN DNA Marker Produk DNA Ethidium Bromide (EtBr) dd H2O Gel Agarose Loading Buffer (Loading dye) Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE) Akuades CARA KERJA Pembuatan Gel Agarose 0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer TAE. Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan. Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu ±50°C. Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis. Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan hingga mengeras. Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat diambil dan gel agarose siap untuk digunakan. Elektroforesis Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE. 1µl loading dye dicampur dengan 3µl produk DNA pada parafilm yang telah tersedia dengan bantuan mikropipet. Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose. Sedangkan untuk 3µl DNA marker 1kb dituangkan pada sumur/well yang berada pada paling tepi atas dan bawah. Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power supply. Power Supply ( 400mA, 90V) dinyalakan selama 30 menit. Dokumentasi Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada larutan EtBr selama ± 15 menit. Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades selama ± 15 menit. Divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc dan kemudian diambil gambarnya. HASIL DAN PEMBAHASAN HASIL
PEMBAHASAN Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan mampu untuk melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa (DNA dan Protein), yaitu metode elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat mengetahui bagaimana cara mengukur fragmen DNA pada praktikum ini. Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005). Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).
Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu: 1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan. 2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan, mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau poliakrilamid (Biosciences, 1999). Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona dan menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisais DNA. Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984). Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%. Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten praktikum. Secara umum, proses pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan di dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991). Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012). Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 4µl dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak
“meluber” ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996). Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996). Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan dengan arus sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna. Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis dkk, 1994). Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose hasil elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini berfungsi untuk meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah itu dilakukan pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc. Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis. Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk, 1994). Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu: 1.
Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2.
Konsentrasi gel Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3.
Bentuk molekul Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.
4.
Densitas muatan Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.
5.
Pori-pori gel Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.
6.
Voltase Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.
7.
Larutan buffer elektroforesis Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Wolfe, 1993). Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari UV tidak menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama sekali, yang terlihat hanyalah migrasi dari marker DNA pada sisi tepi gel agarose. Hal yang semacam ini kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya penyimpanan untai DNA setelah di isolasi pada praktikum yang sebelumnya, atau terdapat sedikit kesalahan dalam penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi proses elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa tidak mungkin untuk tidak bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan faktor yang lain yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu untai DNA itu sendiri. Kenapa bisa begitu, dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan sebelumnya yang kurang baik, yaitu dari suhu penyimpanan. Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu produk DNA. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi linier. KESIMPULAN
1. Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis
elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal. 2. Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan
negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks membran gel agarose. 3. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan tahap elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan kurva regresi linier.
4. Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel
adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat muncul sebagai yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran fragmen DNA dan faktor ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan produk DNA jika produk tersebut sebelumnya disimpan. DAPUS Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences : USA. Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc., San Diego. Boffey, S. A. (1984). Isolation of high molecular weight DNA, in Methods in Molecular Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Totowa, NJ. Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga : Jakarta. Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed. Appleton & Lange, Norwola. Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole Publishing Company, New York. Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8th ed. John Wiley & Sons Inc., New York. Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1). Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill Publishing Co. : Columbus, Ohio. Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2): 351-354 (2010). Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek : Bogor. Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia. Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford. Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers, New York. Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011. Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont. Diposkan 14th May 2013 oleh Percy Ajis Jackson
